一種厭氧真菌乙酰酯酶活性的快速檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種厭氧真菌乙酰酯酶活性的快速檢測(cè)方法，將待測(cè)液在離心后，取上清液測(cè)定乙酰酯酶活性，將適當(dāng)稀釋的上清液、p-硝基苯乙酯和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液置于50℃預(yù)熱，然后向適當(dāng)稀釋的上清液中加入甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液和p-硝基苯乙酯溶液于干燥潔凈的96孔酶標(biāo)板上，50℃反應(yīng)，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值，根據(jù)p-硝基苯的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙酰酯酶活性。該方法測(cè)定乙酰酯酶活性的方法是在活性最優(yōu)條件下測(cè)得，所以減少了乙酰酯酶活性測(cè)定的誤差。同時(shí)能夠優(yōu)化厭氧真菌乙酰酯酶的活性培養(yǎng)條件，使得厭氧真菌分泌的乙酰酯酶活性最高，一個(gè)反應(yīng)可快速且準(zhǔn)確的測(cè)定96個(gè)檢測(cè)液的乙酰酯酶活性，且較少的樣品量即可檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】一種厭氧真菌乙酰酯酶活性的快速檢測(cè)方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種厭氧真菌乙酰酯酶活性的快速檢測(cè)方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]乙酰酯酶(Acetyl esterase, EC3.1.1.6)，由于其含量較低，且適宜的底物也相對(duì)較少，因而該酶的研究相對(duì)晚于其他酯酶。1985年首次報(bào)道乙酰酯酶后，目前該酶已受到越來(lái)越多的重視。乙酰酯酶能夠水解釋放出乙?；揪厶侵心咎菤埢鵆-2和C-3位上的O-乙酰取代基團(tuán)。在植物的細(xì)胞壁中廣泛存在著一些連接乙酰基的木糖聚合物(大約每10個(gè)木糖殘基就有7個(gè)被乙?；?，這些具有乙酰取代基團(tuán)的木糖聚合物提高了細(xì)胞壁的完整性，增加了細(xì)胞壁的剛度和強(qiáng)度，降低了細(xì)胞壁的降解性。乙酰取代基團(tuán)在木聚糖酶降解木聚糖過(guò)程中具有很強(qiáng)的阻礙作用，而乙酰酯酶能夠很好的消除這種阻礙，從而顯著提高木聚糖酶對(duì)木聚糖的親和力和降解能力。在飼料工業(yè)中，利用乙酰酯酶處理植物性的原材料，可將乙?；鶑闹参锛?xì)胞壁的結(jié)構(gòu)中游離出來(lái)，從而破壞細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)，使得飼料更容易被牲畜消化吸收，可顯著提高飼料的利用效率?？梢?jiàn)，乙酰酯酶具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]自然界中產(chǎn)生酯酶的微生物主要是真菌，如青霉、黑曲霉、黃曲霉和酵母菌等，其次是細(xì)菌，如假單胞菌、粘質(zhì)賽氏桿菌、無(wú)色桿菌和葡萄球菌等。研究表明反芻動(dòng)物厭氧真菌也能夠分泌乙酰酯酶，而且酯酶活性相對(duì)較高。因此，從厭氧真菌中分離篩選乙酰酯酶將是研究的一個(gè)趨勢(shì)。目前關(guān)于半纖維素酶系的研究集中于降解半纖維素主鏈的木聚糖酶和β-1，4-木糖苷酶，而對(duì)降解側(cè)鏈的乙酰酯酶研究較少。
[0004]目前，測(cè)定乙酰酯酶的方法是首先將適當(dāng)稀釋的粗酶液、2mMP-硝基苯乙酯和50mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH7.0)置于39°C預(yù)熱15min，然后向50 μ L粗酶液中加入100 μ L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液和50 μ L底物，39°C反應(yīng)30min后，用酶標(biāo)儀680XR(Bio-rad,美國(guó))在415nm下檢測(cè)吸光值,根據(jù)p_硝基苯的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙酰酯酶活性。但根據(jù)
【發(fā)明者】的研究表明，厭氧真菌乙酰酯酶在PH9.0和50°C下具有較高的活性，因此，建議厭氧真菌乙酰酯酶活性測(cè)定方法修改成將待測(cè)酶液和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液(PH9.0)置于50°C預(yù)熱15min，然后向待測(cè)酶液中加入底物P-硝基苯乙酯，50°C反應(yīng)30min,用酶標(biāo)儀在415nm下檢測(cè)反應(yīng)30min時(shí)的吸光值,根據(jù)p_硝基苯的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙酰酯酶活性。
[0005]現(xiàn)有微生物的乙酰酯酶活性都相對(duì)較低，因此目前測(cè)定乙酰酯酶活性的方法誤差相對(duì)較大。鑒于從厭氧真菌中分離篩選乙酰酯酶將是研究的一個(gè)趨勢(shì)，優(yōu)化針對(duì)厭氧真菌乙酰酯酶的活性測(cè)定方法成為飼料工業(yè)尚待解決的重要問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一種厭氧真菌乙酰酯酶活性的快速檢測(cè)方法，該方法測(cè)定乙酰酯酶活性是在最優(yōu)條件下測(cè)得，所以減少了乙酰酯酶活性測(cè)定的誤差。其具體技術(shù)方案為:[0007]—種厭氧真菌乙酰酯酶活性的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0008]將待測(cè)液在1000Xg離心10min，取上清液測(cè)定乙酰酯酶活性，將適當(dāng)稀釋的上清液、2mM P-硝基苯乙酯和50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液置于50°C預(yù)熱15_30min，然后向50 μ L適當(dāng)稀釋的上清液中加入100 μ L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液和50 μ L P-硝基苯乙酯溶液于干燥潔凈的96孔酶標(biāo)板上，50°C反應(yīng)15-30min后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在410_420nm下檢測(cè)吸光值，根據(jù)P-硝基苯的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙酰酯酶活性。
[0009]進(jìn)一步優(yōu)選，所述預(yù)熱時(shí)間為15min。
[0010]進(jìn)一步優(yōu)選，所述反應(yīng)時(shí)間為30min。
[0011]進(jìn)一步優(yōu)選，所述全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為415nm。
[0012]進(jìn)一步優(yōu)選，所述緩沖液為pH9.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，配制方法為:稱取
0.7505g甘氨酸,用去離子水充分溶解,并定容至50mL，稱取0.4g氫氧化鈉，用去離子水充分溶解，并定容至50mL，用去離子水稀釋使其濃度為50mM，甘氨酸和氫氧化鈉按照17: 3的比例配制使用。
[0013]進(jìn)一步地，所述2mM p-硝基苯乙酯溶液的配制方法為:準(zhǔn)確稱取0.3623g p-硝基苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)品溶于800mL去離子水中，然后定容至1L。
[0014]進(jìn)一步地，乙酰酯酶的I個(gè)酶活力單位(U)可被定義為在上述酶促反應(yīng)條件下，ImL檢測(cè)液在Imin內(nèi)自標(biāo) 準(zhǔn)底物p_硝基苯乙酯中釋放I μ M p-硝基苯所需的酶量。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明修訂了厭氧真菌乙酰酯酶的測(cè)定方法，能夠在乙酰酯酶活性最高時(shí)測(cè)定其活性，減少了厭氧真菌乙酰酯酶活性測(cè)定的誤差，同時(shí)優(yōu)化了厭氧真菌乙酰酯酶的培養(yǎng)條件，使得厭氧真菌分泌的乙酰酯酶活性最高。而且，一個(gè)反應(yīng)可快速且準(zhǔn)確的測(cè)定96個(gè)檢測(cè)液的乙酰酯酶活性，且較少的樣品量即可檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為乙酰酯酶的最適pH ；
[0017]圖2為乙酰酯酶的最適溫度。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。
[0019]將厭氧真菌培養(yǎng)基在4°C 1000Xg離心5min，取上清入新的離心管作為待測(cè)酶液。常規(guī)乙酰酯酶的測(cè)定方法是:首先將適當(dāng)稀釋的粗酶液、2mM P-硝基苯乙酯和50mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH7.0)置于391:預(yù)熱151^11，然后向5(^14且酶液中加Λ 100 μ L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液和50 μ L底物,39 °C反應(yīng)30min后，用酶標(biāo)儀680XR(Bio-rad,美國(guó))在415nm下檢測(cè)吸光值,根據(jù)p_硝基苯的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙酰酯酶活性。
[0020]最適pH值的確定:使用50mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH3.0-5.0)，50mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(PH6.0-8.0)和50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH9.0-10.0)替代常規(guī)酶活測(cè)定中使用的50mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH7.0)，測(cè)定乙酰酯酶活性。
[0021]檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ρΗ3.0-5.0):[0022]0.1M檸檬酸溶液:稱取1.0500g檸檬酸，用去離子水定容至50mL。
[0023]0.1M檸檬酸鈉溶液:稱取1.4705g檸檬酸鈉，用去離子水定容至50mL。
[0024]用去離子水稀釋至50mM使用。
[0025]表1不同pH的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制方法
[0026]
【權(quán)利要求】
1.一種厭氧真菌乙酰酯酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: 將待測(cè)液在1000Xg離心10min，取上清液測(cè)定乙酰酯酶活性，將適當(dāng)稀釋的上清液、2mM P-硝基苯乙酯和50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液置于50°C預(yù)熱15_30min，然后向50 μ L適當(dāng)稀釋的上清液中加入100 μ L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液和50 μ L P-硝基苯乙酯溶液于干燥潔凈的96孔酶標(biāo)板上，50°C反應(yīng)15-30min后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在410_420nm下檢測(cè)吸光值，根據(jù)P-硝基苯的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙酰酯酶活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的厭氧真菌乙酰酯酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述預(yù)熱時(shí)間為15min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的厭氧真菌乙酰酯酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述反應(yīng)時(shí)間為30min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的厭氧真菌乙酰酯酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為415nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的厭氧真菌乙酰酯酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述緩沖液為PH9.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的厭氧真菌乙酰酯酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述沖液配制方法為:稱取0.7505g甘氨酸,用去離子水充分溶解,并定容至50mL,稱取0.4g氫氧化鈉，用去離子水充分溶解，并定容至50mL,用去離子水稀釋至50mM,甘氨酸和氫氧化鈉按照17: 3的比例配制使用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的厭氧真菌乙酰酯酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述2mMP-硝基苯乙酯溶液的配制方法為:準(zhǔn)確稱取0.3623g P-硝基苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)品溶于800mL去離子水中，然后定容至1L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的厭氧真菌乙酰酯酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于，乙酰酯酶的I個(gè)酶活力單位(U)被定義為在上述酶促反應(yīng)條件下，ImL檢測(cè)液在Imin內(nèi)自標(biāo)準(zhǔn)底物P-硝基苯乙酯中釋放I μ M P-硝基苯所需的酶量。
【文檔編號(hào)】C12Q1/44GK104017857SQ201410238895
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年5月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月25日
【發(fā)明者】曹陽(yáng)春, 姚軍虎, 王臘梅, 李宗軍, 孫菲菲, 魏筱詩(shī), 曹志昂, 王衛(wèi)濤, 徐秀容 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)