專利名稱：快速檢測四種硝基呋喃類藥物的免疫納米金試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測四種硝基呋喃類藥物的免疫納米金試紙條，總體屬于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域(畜牧與水產(chǎn)業(yè))，具體屬于動物源性產(chǎn)品安全檢測/獸藥殘留檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮均屬于化學(xué)合成的硝基呋喃類廣譜抗菌藥物，但由于它們的原形藥和代謝物具有致癌性和致突變作用，已被中國農(nóng)業(yè)部列為禁止用于食品動物的藥物。但這些藥物往往被添加在動物飼料中違法使用，因此而造成的獸藥殘留會嚴(yán)重影響動物性產(chǎn)品安全，威脅消費(fèi)者身體健康。因此，檢測飼料中非法添加的此類藥物可從源頭保護(hù)動物性產(chǎn)品的質(zhì)量安全。目前，有些研究者采用免疫學(xué)方法對此類藥物進(jìn)行檢測。如專利2005101112 ， 其聲明將呋喃唑酮直接與載體蛋白連接作為免疫原，獲得抗體制備免疫納米金試紙條可檢測飼料中的呋喃唑酮；再如專利200610041481，其聲明制備了呋喃西林的單克隆抗體，建立的ELISA方法可檢測呋喃西林。但其沒有給出免疫原的制備方法，按免疫學(xué)原理推斷，申請者也應(yīng)是將呋喃西林直接與載體蛋白連接。這些方法技術(shù)均只能檢測一種硝基呋喃類藥物，而不能同時檢測其他幾種硝基呋喃類藥物。因此，研究制備可同時對飼料中這四種硝基呋喃類藥物進(jìn)行快速檢測的方法技術(shù)非常重要。目前已有的方法技術(shù)不能同時檢測這四種硝基呋喃類藥物，是因?yàn)樗鼈兊拿庖咴诤铣蓵r只針對一種藥物，存在很大不足。硝基呋喃類藥物的分子結(jié)構(gòu)母核是5-硝基呋喃環(huán)，上述四種藥物都含有這一結(jié)構(gòu)。而一種藥物合成中間體5-硝基糠醛也含有這一結(jié)構(gòu)，針對5-硝基糠醛的抗體就能同時識別這四種藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是提供一種能快速檢測四種硝基呋喃類藥物的免疫納米金試紙條。本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
一種快速檢測四種硝基呋喃類藥物的免疫納米金試紙條，其制備方法如下
(1)合成通用半抗原稱取5-硝基糠醛50-80mg溶于3_5mL乙醇中得A液；稱取硫酸聯(lián)氨70-100mg溶于5-10mL蒸餾水中得B液；室溫下將A液逐滴滴加到B液中，攪拌反應(yīng) 30-60分鐘，得黃色沉淀；用飽和碳酸鈉溶液中和上述反應(yīng)液至pH6. 0-8. 0后，將此混和液抽濾至干；所剩固體用10-20mL蒸餾水洗滌，再抽濾至干，自然干燥即得通用半抗原；
(2)合成免疫原稱取所述半抗原10-20mg溶于5-10mL甲醇中，攪拌條件下逐滴滴加到含牛血清白蛋白30-50mg的濃度為0. 01mol/L、pH7. 0-7. 4磷酸緩沖液5-lOmL中；然后逐滴加入濃度為25%的戊二醛溶液60-100μ L，20-25°C反應(yīng)4小時即得免疫原溶液，然后在 4°C生理鹽水中透析72小時，透析液冷凍保存；
(3)合成捕獲抗原稱取所述半抗原10-20mg溶于5-10mL甲醇中，冷卻至4°C ；然后，在4 °C條件下用鹽酸調(diào)節(jié)pH為1.0-3.0，再逐滴加入0.2-0. 5mol/L的亞硝酸鈉溶液l_4mL，攪拌反應(yīng)至淀粉碘化鉀試紙檢驗(yàn)呈灰藍(lán)色為止；然后用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至 7. 5-9. 0 ；將所得溶液逐滴加入到含卵清蛋白10-20mg的濃度為0. 01mol/L、pH7. 0-7. 4的磷酸緩沖液5-10mL中，4°C攪拌反應(yīng)8_16h即得捕獲抗原溶液，然后在生理鹽水中透析72小時，透析液冷凍保存；
(4)制備多克隆IgG抗體將所述免疫原用生理鹽水稀釋為lmg/mL，加與稀釋后免疫原溶液等量的氟氏完全佐劑制成乳化劑，在實(shí)驗(yàn)動物家兔的背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射進(jìn)行首免， 免疫劑量0. 2-0. Smg/只；3-4周后，取lmg/mL的免疫原溶液加與免疫原溶液等量的氟氏不完全佐劑乳化后在實(shí)驗(yàn)動物家兔背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量0. 2-0. Smg/ 只，每4周加強(qiáng)免疫一次，共免疫6-8次；最后一次免疫，為免疫原直接耳緣靜脈注射，免疫劑量0. 2-0. Smg/只；然后，取兔全血分離血清，采用飽和硫酸銨法對血清中的IgG進(jìn)行粗提；粗提液在濃度0. Olmol/L、pH7. 0-7. 4的磷酸緩沖液中透析2_3天以脫鹽；透析液再用 DEAE-52層析柱進(jìn)行純化；純化后的IgG溶液再在濃度0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4的磷酸緩沖液中透析2-3天以脫鹽，即得多克隆IgG抗體溶液，最后冷凍保存；
(5)制備納米金溶液取0.01%-0. 05%的氯金酸溶液IOOmL恒溫?cái)嚢杓訜嶂练序v，在持續(xù)攪拌的情況下加入1%_4%的檸檬酸三鈉溶液l_4mL，繼續(xù)攪拌加熱20-30分鐘，至溶液呈透亮紅色，室溫冷卻，用去離子水恢復(fù)至IOOmL,即得納米金溶液，4°C保存?zhèn)溆茫?br> (6)制備金標(biāo)抗體將步驟(5)所得的納米金溶液用濃度0.01mol/L的碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH至6. 5-8. 5 ；向其中加入步驟(4)所得多克隆IgG溶液，使IgG抗體濃度為20-25 μ g/ mL，搖勻后4°C靜置30-60分鐘；然后加入牛血清白蛋白使其濃度為1%- ，攪拌反應(yīng)1_2小時，4°C靜置2-3小時；然后1500r/min離心20-30分鐘，棄去沉淀，再將上清液以20000r/ min 4°C離心30-60分鐘，棄去上清液；將沉淀懸浮于10_20mL濃度0. 01mol/L、ρΗ7· 0-7. 4 的磷酸緩沖液中，以20000r/min 4°C離心30-60分鐘，沉淀懸浮于5_10mL濃度0. 01mol/L、 pH7. 0-7. 4的磷酸緩沖液中，即為金標(biāo)抗體溶液，4°C保存；
(7)制備免疫納米金試紙條(a)將步驟(6)所得金標(biāo)抗體溶液用濃度0.Olmol/L、 pH7. 0-7. 4的磷酸緩沖液稀釋4-6倍，所述磷酸緩沖液中含3%蔗糖、0. 1%牛血清白蛋白和 0. 05% Tween-20，按20μ1/αιι2的劑量噴涂在Glass 33型玻璃纖維素膜即結(jié)合釋放墊上，然后37°C烘10-20分鐘；(b):將所述捕獲抗原用濃度0. 01mol/L、pH9· 0-9. 5的含3%甲醇的碳酸緩沖液稀釋為8Pg/ml，在AE99型硝酸纖維素膜的檢測線位置噴涂1_2μ1 ；在此硝酸纖維素膜的質(zhì)控線位置噴涂1000-1500倍稀釋的羊抗兔IgG抗體1_2μ1，檢測線與質(zhì)控線間距5-8mm ；將硝酸纖維素膜在37°C烘10-20分鐘；再將硝酸纖維素膜在20 25°C下浸泡在濃度0. 01mol/L、pH7. 0-7. 4的磷酸緩沖液中封閉10分鐘，所述磷酸緩沖液中含0. 5%BSA和 0. 05%疊氮鈉，然后將硝酸纖維素膜在37°C烘10-20分鐘；(c)依次將AE99硝酸纖維素膜、結(jié)合釋放墊Glass 33玻璃纖維素膜、吸收墊Cotton Iinters沈68和樣品墊Glass 33 粘貼在PVC背板上；最后裁剪為4X50mm的試紙條。所制備的免疫納米金試紙條用于現(xiàn)場檢測時，先處理待檢樣品，然后將處理好的待檢樣品100 μ L滴至樣品墊上，5分鐘內(nèi)讀取結(jié)果，若有兩條紅色顯色帶即質(zhì)控線和檢測線均顯色，則判為陰性；若有一條紅色顯色帶即質(zhì)控線顯色而檢測線不顯色，則判為陽性。所制備的免疫納米金試紙條對呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮的檢測限分別為 2 μ g/g、2 μ g/g、3 μ g/g 和 5 μ g/g。
與現(xiàn)有的方法技術(shù)相比，本發(fā)明取得的積極效果為
硝基呋喃類藥物的分子結(jié)構(gòu)母核是5-硝基呋喃環(huán)，呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮都含有這一結(jié)構(gòu)，5-硝基糠醛也含有這一結(jié)構(gòu)，針對5-硝基糠醛的抗體就能同時識別這四種藥物。本發(fā)明以5-硝基糠醛為原料，合成了硝基呋喃類藥物的通用半抗原， 制備了能同時快速檢測飼料中呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮等四種藥物的免疫納米金試紙條，所制備的免疫納米金試紙條可以在10分鐘內(nèi)檢測被測樣品中是否含有這四種藥物，且該試紙條的成本價(jià)格低于5元，適合在飼料檢測或食品動物檢測中廣泛應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明中合成半抗原、免疫原和捕獲抗原的示意圖； 圖2為本發(fā)明的免疫納米金試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
(1)合成通用半抗原如圖1所示，稱取5-硝基糠醛60mg溶于3mL乙醇中(A液)，稱取硫酸聯(lián)氨70mg溶于7mL蒸餾水中(B液)。室溫下將A液逐滴滴加到B液中，攪拌反應(yīng)30 分鐘，得黃色沉淀。用飽和碳酸鈉溶液中和上述反應(yīng)液至PH6. 0-8. 0后，將此混和液抽濾至干。所剩固體用15mL蒸餾水洗滌，再抽濾至干，自然干燥即得通用半抗原，合成反應(yīng)的產(chǎn)率 74%，熔點(diǎn)243-245°C (5-硝基糠醛熔點(diǎn)39°C )，紅外光譜特征吸收峰3150，3129，3099， 1641，1349，1251，1027，825，738 cnT1，紫外分光光度計(jì)對5-硝基糠醛和半抗原進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果兩者的紫外吸收曲線基本相同，說明5-硝基糠醛本身的結(jié)構(gòu)未被破壞，且半抗原中含有5-硝基糠醛的結(jié)構(gòu)，表明半抗原合成成功；
(2)合成免疫原稱取所述半抗原IOmg溶于7mL甲醇中，攪拌條件下逐滴滴加到含牛血清白蛋白40mg的磷酸緩沖液8mL (0. 01mol/L,pH7. 0-7. 4)中，然后逐滴加入25%的戊二醛溶液80 μ L，室溫反應(yīng)4小時。然后在4°C生理鹽水中透析72小時，透析液冷凍保存；
(3)合成捕獲抗原稱取所述半抗原20mg溶于8mL甲醇中，冷卻至4°C。然后，在4°C 條件下用鹽酸調(diào)節(jié)PH為1. 0-3. 0，再逐滴加入0. 5mol/L的亞硝酸鈉溶液lmL，攪拌反應(yīng)至淀粉碘化鉀試紙檢驗(yàn)呈灰藍(lán)色為止，然后用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7. 5-9.0。將所得溶液逐滴加入到含卵清蛋白20mg的磷酸緩沖液8mL中(0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4)，4°C攪拌反應(yīng) 8_16h，然后在生理鹽水中透析72小時，完全抗原的紫外全波長掃描曲線相當(dāng)于載體的掃描曲線與半抗原紫外曲線的疊加，表明免疫原與捕獲抗原合成成功；透析液冷凍保存；
(4)制備多克隆抗體將所述免疫原用生理鹽水稀釋為lmg/mL，加與稀釋后免疫原溶液等量的氟氏完全佐劑制成乳化劑，在新西蘭白兔的背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射進(jìn)行首免，免疫劑量0.5mg/只；4周后，取lmg/mL的免疫原溶液加與此免疫原溶液等量的氟氏不完全佐劑乳化后在實(shí)驗(yàn)動物新西蘭白兔背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量0. 5mg/只， 每4周加強(qiáng)免疫一次，共免疫8次；最后一次免疫，為免疫原直接耳緣靜脈注射，免疫劑量 0. 5mg/只。然后，取兔全血分離血清，采用飽和硫酸銨法對血清中的IgG進(jìn)行粗提；粗提液在磷酸緩沖液(0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4)中透析3天以脫鹽；透析液再用DEAE-52層析柱進(jìn)行純化；純化后的IgG溶液再在磷酸緩沖液(0. 01mol/L,pH7. 0-7. 4)中透析3天以脫鹽，最后冷凍保存；
(5)制備納米金溶液取0.05%的氯金酸溶液IOOmL用恒溫電磁攪拌器攪拌加熱至沸騰，在持續(xù)攪拌的情況下加入3%的檸檬酸三鈉溶液2mL，繼續(xù)攪拌加熱30分鐘，至溶液呈透亮紅色，室溫冷卻，用去離子水恢復(fù)至IOOmL,即得納米金溶液，4°C保存?zhèn)溆茫?br> (6)制備金標(biāo)抗體將步驟(5)所得納米金溶液用碳酸鉀溶液(0.01mol/L,pH9. 0-9. 5) 調(diào)節(jié)PH至6. 5-8. 5。向其中加入IgG溶液，使IgG濃度為20 μ g/mL,搖勻后4°C靜置50分鐘。然后加入牛血清白蛋白使其濃度為洲，攪拌反應(yīng)2小時，4°C靜置3小時。然后1500r/ min離心25分鐘，棄去沉淀，再將上清液以20000r/min 4°C離心60分鐘，棄去上清液。將沉淀懸浮于IOmL磷酸緩沖液(0. 01mol/L, ρΗ7· 0-7. 4)中，以20000r/min 4_6°C離心30分鐘，沉淀懸浮于8mL (0.01mol/L, pH7. 0_7. 4)磷酸緩沖液中，4°C保存。采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法對抗體的特異性進(jìn)行檢測，結(jié)果所得抗體對呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮和呋喃妥因的交叉反應(yīng)率分別為95%、68%、61%和59%，檢測限分別為22. 5,31. 5,35. 1,36. 3ng/ mL。表明以5-硝基糠醛為半抗原獲得了能識別四種硝基呋喃類藥物的抗體；
(7)制備免疫納米金試紙條(a)將步驟(6)所得金標(biāo)抗體用磷酸緩沖液(0.Olmol/ L，ρΗ7· 0-7. 4，含 3% 蔗糖，0. 1% 牛血清白蛋白，0. 05% Tween-20)稀釋 4 倍后，按 20μ1/αιι2 的劑量噴涂在Glass 33型玻璃纖維素膜上(結(jié)合釋放墊)，然后37°C烘20分鐘；(b):將所述捕獲抗原用碳酸緩沖液(0. 01mol/L, ρΗ9· 0-9. 5，含3%甲醇)稀釋為8Pg/ml，在ΑΕ99型硝酸纖維素膜的檢測線位置噴涂 μ ，在此硝酸纖維素膜的質(zhì)控線位置噴涂1000倍稀釋的羊抗兔IgG抗體 μ ，檢測線與質(zhì)控線間距8mm。將硝酸纖維素膜在37°C烘10分鐘。再將硝酸纖維素膜在室溫條件下(20 25°C)浸泡在磷酸緩沖液中(0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4，含 0. 5%BSA, 0. 05%疊氮鈉)封閉10分鐘后，37°C烘10分鐘；(c)如圖2所示，依次將AE99硝酸纖維素膜、結(jié)合釋放墊Glass 33玻璃纖維素膜、吸收墊Cotton Iinters沈68和樣品墊 Glass 33粘貼在PVC背板上，最后裁剪為4X 50mm的試紙條。(8)飼料樣品檢測稱取磨碎后的飼料樣品5克于試管中，加入IOmL 50%的甲醇/ 水溶液(1:1，v/v)，振蕩5分鐘，4000r/min離心5分鐘。檢測時吸取10倍稀釋的IOOyL 樣品提取液滴至試紙條樣品墊上，5分鐘內(nèi)讀取結(jié)果，質(zhì)控線顯色而檢測線不顯色，則判斷為陽性，即樣品中至少含有呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮中的一種。本發(fā)明可同時檢測飼料中呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮，對四種藥物的檢測限分別為2、2、3、5 μ g/g。實(shí)施例2
(1)合成通用半抗原稱取5-硝基糠醛50mg溶于5mL乙醇中(Α液)；稱取硫酸聯(lián)氨 85mg溶于5mL蒸餾水中(B液);室溫下將A液逐滴滴加到B液中，攪拌反應(yīng)60分鐘，得黃色沉淀；用飽和碳酸鈉溶液中和上述反應(yīng)液至PH6. 0-8. 0后，將此混和液抽濾至干；所剩固體用20mL蒸餾水洗滌，再抽濾至干，自然干燥即得通用半抗原；
(2)合成免疫原稱取所述半抗原15mg溶于5mL甲醇中，攪拌條件下逐滴滴加到含牛血清白蛋白30mg的5mL磷酸緩沖液(0. 01mol/L,pH7. 0-7. 4)中；然后逐滴加入25%的戊二醛溶液60 μ L，室溫反應(yīng)4小時；然后在4°C生理鹽水中透析72小時，透析液冷凍保存；
(3)合成捕獲抗原稱取所述半抗原IOmg溶于IOmL甲醇中，冷卻至4°C;然后，在4°C條件下用鹽酸調(diào)節(jié)PH為1. 0-3. 0，再逐滴加入0. 3mol/L的亞硝酸鈉溶液4mL，攪拌反應(yīng)至淀粉碘化鉀試紙檢驗(yàn)呈灰藍(lán)色為止；然后用氫氧化鈉溶液調(diào)PH至7. 5-9. 0 ；將所得溶液緩慢加入到含卵清蛋白IOmg的5mL磷酸緩沖液中(0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4),4 ！攪拌反應(yīng) 8-16h ；然后在生理鹽水中透析72小時，透析液冷凍保存；
(4)制備多克隆抗體將所述免疫原用生理鹽水稀釋為lmg/mL，加與稀釋后免疫原溶液等量的氟氏完全佐劑制成乳化劑，在新西蘭白兔的背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射進(jìn)行首免，免疫劑量0. 2mg/只；4周后，取lmg/mL的免疫原溶液加與此免疫原溶液等量的氟氏不完全佐劑乳化后在新西蘭白兔背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量0. 2mg/只，每4周加強(qiáng)免疫一次，共免疫7次；最后一次免疫，為免疫原直接耳緣靜脈注射，免疫劑量0. 2mg/只；然后，取兔全血分離血清，采用飽和硫酸銨法對血清中的IgG進(jìn)行粗提；粗提液在磷酸緩沖液 (0. 01mol/L,pH7. 0-7. 4)中透析2天以脫鹽；透析液再用DEAE-52層析柱進(jìn)行純化；純化后的IgG溶液再在磷酸緩沖液(0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4)中透析3天以脫鹽，最后冷凍保存；
(5)制備納米金溶液取0.01%的氯金酸溶液IOOmL用恒溫電磁攪拌器攪拌加熱至沸騰，在持續(xù)攪拌的情況下加入4%的檸檬酸三鈉溶液lmL，繼續(xù)攪拌加熱20分鐘，至溶液呈透亮紅色，室溫冷卻，用去離子水恢復(fù)至IOOmL,即得納米金溶液，4°C保存?zhèn)溆茫?br> (6)制備金標(biāo)抗體溶液將步驟(5)所得納米金溶液用碳酸鉀溶液(O.Olmol/L， ρΗ9· 0-9. 5)調(diào)節(jié)ρΗ至6. 5-8. 5 ；向其中加入IgG溶液，使抗體濃度為25 μ g/mL,搖勻后4°C 靜置30分鐘；然后加入牛血清白蛋白使其濃度為1%，攪拌反應(yīng)1小時，4°C靜置2小時；然后1500r/min離心20分鐘，棄去沉淀，再將上清液以20000r/min 4°C離心30分鐘，棄去上清液；將沉淀懸浮于15mL磷酸緩沖液(0. 01mol/L，pH7. 0-7. 4)中，以20000r/min 4°C離心 60分鐘，沉淀懸浮于5mL (0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4)磷酸緩沖液中，即得金標(biāo)抗體溶液，4°C 保存；
(7)制備免疫納米金試紙條(a)將步驟(6)所得金標(biāo)抗體溶液用磷酸緩沖液 (0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4，含 3% 蔗糖，0. 1% 牛血清白蛋白，0. 05% Tween-20)稀釋 6 倍后， 按20μ Α:πι2的劑量噴涂在Glass 33型玻璃纖維素膜上(結(jié)合釋放墊)，然后37°C烘10分鐘；(b)將所述捕獲抗原用碳酸緩沖液(O.Olmol/L，pH9. 0-9.5,3%甲醇)稀釋為8μβ/ ml，在ΑΕ99型硝酸纖維素膜的檢測線位置噴涂2μ1，在此硝酸纖維素膜的質(zhì)控線位置噴涂 1500倍稀釋的羊抗兔IgG抗體2μ1，檢測線與質(zhì)控線間距5mm ；將硝酸纖維素膜在37°C烘 15分鐘；再將硝酸纖維素膜在室溫條件下(20 25°C)浸泡在磷酸緩沖液中(0. 01mol/L, ρΗ7· 0-7. 4，0. 5%BSA, 0. 05%疊氮鈉)封閉10分鐘后，37°C烘15分鐘；(c)依次將AE99硝酸纖維素膜、結(jié)合釋放墊Glass 33玻璃纖維素膜、吸收墊Cotton Iinters沈68和樣品墊 Glass 33粘貼在PVC背板上；最后裁剪為4X 50mm的試紙條。稱取磨碎后的飼料樣品5克于試管中，加入IOmL 50%的甲醇/水溶液(1 1，ν/ ν)，振蕩5分鐘，4000r/min離心5分鐘。檢測時吸取10倍稀釋的100 μ L樣品提取液滴至試紙條樣品墊上，5分鐘內(nèi)讀取結(jié)果，質(zhì)控線和檢測線均顯色(兩條紅線)，則判為陰性，被測樣品中不含呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮中的任何一種。實(shí)施例3
(1)合成通用半抗原稱取5-硝基糠醛80mg溶于4mL乙醇中(Α液)；稱取硫酸聯(lián)氨 IOOmg溶于IOmL蒸餾水中(B液);室溫下將A液逐滴滴加到B液中，攪拌反應(yīng)40分鐘，得黃色沉淀；用飽和碳酸鈉溶液中和上述反應(yīng)液至PH6. 0-8. 0后，將此混和液抽濾至干；所剩固體用IOmL蒸餾水洗滌，再抽濾至干，自然干燥即得通用半抗原；
(2)合成免疫原稱取所述半抗原20mg溶于IOmL甲醇中，攪拌條件下逐滴的滴加到含牛血清白蛋白50mg的磷酸緩沖液(0. 01mol/L,pH7. 0-7. 4)中；然后逐滴加入25%的戊二醛溶液100 μ L，室溫反應(yīng)4小時；然后在4°C生理鹽水中透析72小時，透析液冷凍保存；
(3)合成捕獲抗原稱取所述半抗原15mg溶于5mL甲醇中，冷卻至4°C;然后，在4 °C 條件下用鹽酸調(diào)節(jié)PH為1. 0-3. 0，再逐滴加入0. 2mol/L的亞硝酸鈉溶液3mL，攪拌反應(yīng)至淀粉碘化鉀試紙檢驗(yàn)呈灰藍(lán)色為止；然后用氫氧化鈉溶液調(diào)PH至7. 5-9. 0 ；將所得溶液逐滴加入到含卵清蛋白15mg的IOmL磷酸緩沖液中(0. 01mol/L, ρΗ7· 0-7. 4),4 °C攪拌反應(yīng) 8-16h ；然后在生理鹽水中透析72小時，透析液冷凍保存；
(4)制備多克隆抗體將所述免疫原用生理鹽水稀釋為lmg/mL，加與稀釋后免疫原溶液等量的氟氏完全佐劑制成乳化劑，在新西蘭白兔的背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射進(jìn)行首免，免疫劑量0. 8mg/只；3周后，取lmg/mL的免疫原溶液加與此免疫原溶液等量的氟氏不完全佐劑乳化后在新西蘭白兔背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量0. Smg/只，每4周加強(qiáng)免疫一次，共免疫6次；最后一次免疫，為免疫原直接耳緣靜脈注射，免疫劑量0. Smg/只 ’然后，取兔全血分離血清，采用飽和硫酸銨法對血清中的IgG進(jìn)行粗提；粗提液在磷酸緩沖液 (0. 01mol/L,pH7. 0-7. 4)中透析2天以脫鹽；透析液再用DEAE-52層析柱進(jìn)行純化；純化后的IgG溶液再在磷酸緩沖液(0.01mol/L，pH7. 0-7.4)中透析2天以脫鹽，最后冷凍保存；
(5)制備納米金溶液取0.03%的氯金酸溶液IOOmL用恒溫電磁攪拌器攪拌加熱至沸騰，在持續(xù)攪拌下加入1%的檸檬酸三鈉溶液4mL，繼續(xù)攪拌加熱25分鐘，至溶液呈透亮紅色，室溫冷卻，用去離子水恢復(fù)至IOOmL,即得納米金溶液，4°C保存?zhèn)溆茫?br> (6)制備金標(biāo)抗體溶液步驟(5)所得的納米金溶液用碳酸鉀溶液(O.Olmol/L， ρΗ9· 0-9. 5)調(diào)節(jié)ρΗ至6. 5-8. 5 ；向其中加入IgG溶液，使抗體濃度為23 μ g/mL,搖勻后4°C 靜置60分鐘；然后加入牛血清白蛋白使其濃度為1%，攪拌反應(yīng)2小時，4°C靜置3小時；然后1500r/min離心25分鐘，棄去沉淀，再將上清液以20000r/min 4°C離心50分鐘，棄去上清液；將沉淀懸浮于20mL磷酸緩沖液(0. 01mol/L，pH7. 0-7. 4)中，以20000r/min 4°C離心 40分鐘，沉淀懸浮于IOmL (0. 01mol/L,pH7. 0-7. 4)磷酸緩沖液中，即得金標(biāo)抗體溶液，4°C 保存；
(7)制備免疫納米金試紙條(a)將步驟(6)所得金標(biāo)抗體溶液用磷酸緩沖液 (0. 01mol/L, ρΗ7· 0-7. 4，含 3% 蔗糖，0. 1% 牛血清白蛋白，0. 05% Tween-20)稀釋 5 倍后，按 20μ1/οπι2的劑量噴涂在Glass 33型玻璃纖維素膜上(結(jié)合釋放墊)，然后37°C烘15分鐘； (b)將所述捕獲抗原用碳酸緩沖液(0. 01mol/L, ρΗ9· 0-9. 5,3%甲醇)稀釋為8“g/ml，在 AE99型硝酸纖維素膜的檢測線位置噴涂2μ1，在此硝酸纖維素膜的質(zhì)控線位置噴涂1000倍稀釋的羊抗兔IgG抗體2μ1，檢測線與質(zhì)控線間距6mm ；將硝酸纖維素膜在37°C烘20分鐘； 再將硝酸纖維素膜在20 25°C下浸泡在磷酸緩沖液中(0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4,0. 5%BSA, 0. 05%疊氮鈉)封閉10分鐘后，37°C烘20分鐘；(c)依次將AE99硝酸纖維素膜、結(jié)合釋放墊Glass 33玻璃纖維素膜、吸收墊Cotton Iinters 2668和樣品墊Glass 33粘貼在PVC 背板上；最后裁剪為4X50mm的試紙。 稱取磨碎后的飼料樣品5克于試管中，加入IOmL 50%的甲醇/水溶液(1 1，ν/v)，振蕩5分鐘，4000r/min離心5分鐘。檢測時吸取10倍稀釋的100 μ L樣品提取液滴至試紙條樣品墊上，5分鐘內(nèi)讀取結(jié)果，質(zhì)控線顯色而檢測線不顯色，則判斷為陽性，即樣品中至少含有呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮中的一種。
權(quán)利要求
1. 一種快速檢測四種硝基呋喃類藥物的免疫納米金試紙條，其特征在于其制備方法如下(1)合成通用半抗原稱取5-硝基糠醛50-80mg溶于3_5mL乙醇中得A液；稱取硫酸聯(lián)氨70-100mg溶于5-10mL蒸餾水中得B液；室溫下將A液逐滴滴加到B液中，攪拌反應(yīng) 30-60分鐘，得黃色沉淀；用飽和碳酸鈉溶液中和上述反應(yīng)液至pH6. 0-8. 0后，將此混和液抽濾至干；所剩固體用10-20mL蒸餾水洗滌，再抽濾至干，自然干燥即得通用半抗原；(2)合成免疫原稱取所述半抗原10-20mg溶于5-10mL甲醇中，攪拌條件下逐滴滴加到含牛血清白蛋白30-50mg的濃度為0. 01mol/L、pH7. 0-7. 4磷酸緩沖液5-lOmL中；然后逐滴加入濃度為25%的戊二醛溶液60-100μ L，20-25°C反應(yīng)4小時即得免疫原溶液，然后在 4°C生理鹽水中透析72小時，透析液冷凍保存；(3)合成捕獲抗原稱取所述半抗原10-20mg溶于5-10mL甲醇中，冷卻至4。C；然后，在4 °C條件下用鹽酸調(diào)節(jié)pH為1. 0-3. 0，再逐滴加入0. 2-0. 5mol/L的亞硝酸鈉溶液l_4mL，攪拌反應(yīng)至淀粉碘化鉀試紙檢驗(yàn)呈灰藍(lán)色為止；然后用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至 7. 5-9. 0 ；將所得溶液逐滴加入到含卵清蛋白10-20mg的濃度為0. 01mol/L、pH7. 0-7. 4的磷酸緩沖液5-10mL中，4°C攪拌反應(yīng)8_16h即得捕獲抗原溶液，然后在生理鹽水中透析72小時，透析液冷凍保存；(4)制備多克隆IgG抗體將所述免疫原用生理鹽水稀釋為lmg/mL，加與稀釋后免疫原溶液等量的氟氏完全佐劑制成乳化劑，在實(shí)驗(yàn)動物家兔的背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射進(jìn)行首免， 免疫劑量0. 2-0. Smg/只；3-4周后，取lmg/mL的免疫原溶液加與免疫原溶液等量的氟氏不完全佐劑乳化后在實(shí)驗(yàn)動物家兔背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量0. 2-0. Smg/ 只，每4周加強(qiáng)免疫一次，共免疫6-8次；最后一次免疫，為免疫原直接耳緣靜脈注射，免疫劑量0. 2-0. 8mg/只；然后，取兔全血分離血清，采用飽和硫酸銨法對血清中的IgG進(jìn)行粗提；粗提液在濃度0. Olmol/L、pH7. 0-7. 4的磷酸緩沖液中透析2_3天以脫鹽；透析液再用 DEAE-52層析柱進(jìn)行純化；純化后的IgG溶液再在濃度0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4的磷酸緩沖液中透析2-3天以脫鹽，即得多克隆IgG抗體溶液，最后冷凍保存；(5)制備納米金溶液取0.01%-0. 05%的氯金酸溶液IOOmL恒溫?cái)嚢杓訜嶂练序v，在持續(xù)攪拌的情況下加入1%_4%的檸檬酸三鈉溶液l_4mL，繼續(xù)攪拌加熱20-30分鐘，至溶液呈透亮紅色，室溫冷卻，用去離子水恢復(fù)至IOOmL,即得納米金溶液，4°C保存?zhèn)溆茫?6)制備金標(biāo)抗體將步驟(5)所得的納米金溶液用濃度0.01mol/L的碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH至6. 5-8. 5 ；向其中加入步驟(4)所得多克隆IgG溶液，使IgG抗體濃度為20-25 μ g/ mL，搖勻后4°C靜置30-60分鐘；然后加入牛血清白蛋白使其濃度為1%- ，攪拌反應(yīng)1_2小時，4°C靜置2-3小時；然后1500r/min離心20-30分鐘，棄去沉淀，再將上清液以20000r/ min 4°C離心30-60分鐘，棄去上清液；將沉淀懸浮于10_20mL濃度0. 01mol/L、ρΗ7· 0-7. 4 的磷酸緩沖液中，以20000r/min 4°C離心30-60分鐘，沉淀懸浮于5_10mL濃度0. 01mol/L、 pH7. 0-7. 4的磷酸緩沖液中，即為金標(biāo)抗體溶液，4°C保存；(7)制備免疫納米金試紙條(a)將步驟(6)所得金標(biāo)抗體溶液用濃度0.Olmol/L、 pH7. 0-7. 4的磷酸緩沖液稀釋4-6倍，所述磷酸緩沖液中含3%蔗糖、0. 1%牛血清白蛋白和 0. 05% Tween-20，按20μ1/αιι2的劑量噴涂在Glass 33型玻璃纖維素膜即結(jié)合釋放墊上，然后37°C烘10-20分鐘；(b):將所述捕獲抗原用濃度0. 01mol/L、pH9· 0-9. 5的含3%甲醇的碳酸緩沖液稀釋為8Pg/ml，在AE99型硝酸纖維素膜的檢測線位置噴涂1_2μ1 ；在此硝酸纖維素膜的質(zhì)控線位置噴涂1000-1500倍稀釋的羊抗兔IgG抗體1_2μ1，檢測線與質(zhì)控線間距5-8mm ；將硝酸纖維素膜在37°C烘10-20分鐘；再將硝酸纖維素膜在20 25°C下浸泡在濃度0. 01mol/L、pH7. 0-7. 4的磷酸緩沖液中封閉10分鐘，所述磷酸緩沖液中含0. 5%BSA和 0. 05%疊氮鈉，然后將硝酸纖維素膜在37°C烘10-20分鐘；(c)依次將AE99硝酸纖維素膜、結(jié)合釋放墊Glass 33玻璃纖維素膜、吸收墊Cotton Iinters沈68和樣品墊Glass 33 粘貼在PVC背板上；最后裁剪為4X50mm的試紙條。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測四種硝基呋喃類藥物的免疫納米金試紙條，其特征在于所制備的免疫納米金試紙條用于現(xiàn)場檢測時，先處理待檢樣品，然后將處理好的待檢樣品IOOyL滴至樣品墊上，5分鐘內(nèi)讀取結(jié)果，若有兩條紅色顯色帶即質(zhì)控線和檢測線均顯色，則判為陰性；若有一條紅色顯色帶即質(zhì)控線顯色而檢測線不顯色，則判為陽性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測四種硝基呋喃類藥物的免疫納米金試紙條，其特征在于所制備的免疫納米金試紙條對呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮的檢測限分別為 2 μ g/g、2 μ g/g、3 μ g/g 和 5 μ g/g。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速檢測四種硝基呋喃類藥物的免疫納米金試紙條，其是以5-硝基糠醛為原料，合成了針對呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮四種硝基呋喃類藥物的通用半抗原以及免疫原和捕獲抗原，然后通過免疫實(shí)驗(yàn)動物家兔獲得多克隆IgG抗體，再用納米金和多克隆IgG抗體制備金標(biāo)抗體，將金標(biāo)抗體溶液噴涂在Glass33型玻璃纖維素膜即結(jié)合釋放墊上，捕獲抗原和羊抗兔抗體分別涂在AE99型硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線位置，然后依次將AE99硝酸纖維素膜、結(jié)合釋放墊Glass33玻璃纖維素膜、吸收墊Cottonlinters2668和樣品墊Glass33粘貼在PVC背板上，最后裁剪為4×50mm的試紙條。本發(fā)明能同時快速檢測飼料中呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮四種藥物，且該試紙條的成本價(jià)格低于5元，適合在飼料檢測或食品動物檢測中廣泛應(yīng)用。
文檔編號G01N33/532GK102183634SQ20111005139
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月4日
發(fā)明者劉怡菲, 劉聚祥, 張治洲, 王建平, 王萍, 趙彥嶺 申請人:河北省獸藥監(jiān)察所