專利名稱：淋病抗原唾液快速檢測試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種淋病抗原唾液快速檢測 試紙條。
背景技術(shù)：
淋病(gonorrhea)是淋病奈瑟菌(簡稱淋菌)引起的以泌尿生殖系統(tǒng)化 膿性感染為主要表現(xiàn)的性傳播疾病，是一種古老而又常見的性病。近年來 發(fā)病率居我國(中國)性傳播疾病首位，淋菌為革蘭氏陰性雙球菌，呈腎 型，成雙排列，離開人體不易生存， 一般消毒劑容易將其殺滅，多發(fā)生于 青年男女。
解放前，我國一些城市的淋病發(fā)病率為20%左右。解放后在1953年 早期病人已近絕跡，1960年基本上完成了晚期病人的普查普治，1964年 已基本消失淋病。由于淋病是世界各國發(fā)病率最高的性傳播疾病，接觸者 感染率高，潛伏期短，可在短期內(nèi)病例成倍增長。又由于1976年西非和 東亞出現(xiàn)了耐青霉素的淋球菌菌林以來，世界淋病有明顯增加的趨勢。我 國自1975年以后，淋病又死灰復(fù)燃，病人逐年呈直線增多，是性病主要 發(fā)病病種。如上海地區(qū)性病就以淋病為主，約占90°/。以上。
淋病的病原體即奈瑟菌，是1879年由Neisseria首次分離出的淋病雙 球菌，因而淋病雙J求菌又稱為奈瑟雙球菌(Neisseria gon-orrhoeas)。淋病雙 球菌呈腎形，兩個凹面相對，大小一致，長約0.7微米，寬0.5微米。它 是嗜二氧化碳的需氧菌，革蘭染色陰性，最適宜在潮濕，溫度為35。C,含 2.5-5%二氧化碳的環(huán)境中生長。常存在多核白細(xì)胞內(nèi)，橢圓或球形，常成 雙排列，無鞭毛、無莢膜、不存在芽孢，對外界理化條件的抵抗力差，最 怕干燥，在干燥環(huán)境中1-2小時即可死亡。在高溫或低溫條件下都易致死。 對各種化學(xué)消毒劑的抵抗力也很弱
目前，檢測淋病最常用的方法是免疫檢測，此方法以抗原-抗體的特 異性識別為基礎(chǔ)，包括傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和近來興起的膠
4體金法兩種。膠體金法分為免疫層析和免疫滲濾兩種方式，其中以免疫層 析法最為方便、快捷。
免疫層析膠體金技術(shù)是新型的診斷技術(shù)，已得到較為廣泛的應(yīng)用，基
本原理如下利用膠體金標(biāo)記一種抗原或抗體，在試紙條的硝酸纖維素膜 上包被相應(yīng)的配對抗原或抗體，檢測時當(dāng)樣品中含有相應(yīng)的特異性抗體或 抗原時，膠體金標(biāo)記顆粒和樣品中配體相結(jié)合形成復(fù)合物，然后在硝酸纖 維素膜上層析，再被包被的抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見的檢測線(T 線)，通過檢測線的有無實現(xiàn)對結(jié)果的判定。但現(xiàn)有的試紙條大多以血液 為樣品，不適合現(xiàn)場檢測和自檢，檢測成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種淋病抗原唾液快速檢測試紙條，該試紙條可以用唾 液作為樣品，解決了現(xiàn)有試紙條不適合現(xiàn)場檢測，檢測成本較高的問題。
一種淋病抗原唾液快速檢測試紙條，包括底板，底板上依次粘貼有樣 品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊，所述的膠體金墊上附著有膠 體金標(biāo)記的可與淋病抗原特異性結(jié)合的第一單克隆抗體，所述的硝酸纖維 素膜上包被有由第二單克隆抗體構(gòu)成的檢測線以及由可與第一單克隆抗 體特異性結(jié)合的二抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線，所述的第一單克隆抗體與第二單 克隆抗體相配對。
所述的淋病抗原是醫(yī)學(xué)上檢測人體是否感染淋菌的標(biāo)記物，該標(biāo)記物 大量存在于人體血液當(dāng)中，在人唾液當(dāng)中也有少量存在。所述的第一單克 隆抗體、第二單克隆抗體以及二抗抗體均可以通過商業(yè)購買或者通過現(xiàn)有
方法制備得到。所述的第一單克隆抗體與第二單克隆抗體相配對是指上述 兩種單克隆抗體與淋病抗原的兩個不同抗原決定簇結(jié)合。
所述的膠體金墊上附著有0.12 ~ 0.25pg/cm2的可與淋病抗原特異性結(jié) 合的第一單克隆抗體，在該濃度范圍滿足唾液中淋病抗原檢測的靈敏度要 求。
所述的膠體金墊制備方法如下
取膠體直徑為15~35歸的膠體金溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0 8.2，以每 100ml膠體金溶液計，加入0.5~ l.Omg的第一單克隆抗體，攪拌后用牛血 清蛋白封閉，離心去上清液，加入相同體積的膠體金溶液復(fù)溶，將每毫升
5溶液鋪在40cn^玻璃纖維膜上，干燥后制得膠體金墊。
所述的檢測線中所述的第二單克隆抗體的含量為0.05 ~ 1.1pg/cm;所 述的質(zhì)控線中所述的二抗抗體含量為0.05 ~ 1.1pg/cm。在該濃度范圍唾液 中淋病抗原檢測的靈敏度要求。
所述的檢測線包被方法如下
將所述的第二單克隆抗體溶解在磷酸緩沖溶液中制得濃度為0.05 ~ 1.0mg/ml溶液，利用該溶液以1 1.5pl/cm的用量在硝酸纖維素膜的一端 劃線，干燥后即得檢測線；
所述的質(zhì)控線包被方法如下
將所述的二抗抗體溶解在磷酸緩沖溶液中制得濃度為0.05 ~ 1.0mg/ml 溶液，利用該溶液以l~1.5nl/cm的用量在硝酸纖維素膜的另一端劃線， 干燥后即得質(zhì)控線。
所述的磷酸緩沖溶液pH值優(yōu)選為8.0，濃度優(yōu)選為O.OIM。 本發(fā)明還提供了 一種上述淋病抗原唾液快速檢測試紙條的檢測方法， 包括以下步驟
取人唾液，用磷酸緩沖溶液稀釋，取50 100^il稀釋后的唾液滴在樣 品墊上，根據(jù)檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)的顯色狀態(tài)，判斷檢測結(jié) 果。
如C、 T線均出現(xiàn)，判定樣品為陽性；C線出現(xiàn)，T線不出現(xiàn)，判定 樣品為陰性；C、 T線都不出現(xiàn)或者C線不出現(xiàn)T線出現(xiàn)，均判定試紙無 效。
本發(fā)明試紙條采用膠體金標(biāo)記技術(shù)，檢測唾液中的淋病抗原，從而判 斷是否感染淋菌，具有操作簡單、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強、適合 現(xiàn)場檢測和自檢、經(jīng)濟實用等優(yōu)點。
具體實施方式
實施例1 膠體金墊的制備
以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑15nm的膠體金溶液，制備完成 后取100ml膠體金溶液于燒杯內(nèi)，用O.IM K2C03調(diào)至pH8.0,加入0.5mg 可與淋病抗原特異性結(jié)合的第一單克隆抗體(鼠抗人上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)，室溫攪拌1小時，加入重量百分比為5%的牛血清白蛋白 (BSA)封閉1小時，12000rpm、 4。C離心30分鐘，棄上清，用膠體金溶 液復(fù)溶至100ml，按lml溶液鋪40cir^的比例，將溶液均勻地鋪在玻璃纖 維膜上，37'C干燥30分鐘，制成膠體金墊。
硝酸纖維素膜的包被
將可與淋病抗原特異性結(jié)合的第二單克隆抗體(鼠抗人上海領(lǐng)潮生
物科技有限公司)溶解在0.01M、pH8.0磷酸緩沖液(PBS )西己制成0.05mg/ml 的溶液，用噴膜儀在硝酸纖維素膜一端以lpl/cm的參數(shù)進行劃線。
將可與上述第一單克隆抗體特異性結(jié)合的二抗抗體(羊抗鼠上海領(lǐng) 潮生物科技有卩艮公司)溶解在O.OIM、 pH8.0磷酸緩沖液(PBS )配制成 0.05mg/ml的溶液，用噴膜儀在硝酸纖維素膜另一端以ljxl/cm的參數(shù)進行 劃線。
劃線后在室溫下千燥8小時，分別得到檢測線和質(zhì)控線。第一單克隆 抗體與第二單克隆抗體與淋病抗原的兩個不同抗原決定簇結(jié)合。
檢測試紙的組裝
在干燥室內(nèi)，溫度20~25°C，濕度小于30%，將樣品墊(玻璃纖維 膜)、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊(吸水試紙)粘貼在底板上， 其中硝酸纖維素膜位于底板中部，硝酸纖維素膜包被有T線的一端與膠體 金墊的1/3搭接，包被有C線的一端與吸樣墊的1/10招:接，樣品墊與膠體 金墊的1/5搭接。最后切成寬度為2.5mm的試紙條，也可將試紙條裝入一 個塑料卡中制成檢測卡。
實施例2 膠體金墊的制備
以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑35nm的膠體金溶液，制備完成 后取100ml膠體金溶液于燒杯內(nèi)，用0.1M K2C03調(diào)至pH8.2，加入l.Omg 可與淋病抗原特異性結(jié)合的第一單克隆抗體(鼠抗人上海領(lǐng)潮生物科技
有限公司)，室溫攪拌1小時，加入重量百分比為5%的牛血清白蛋白 (BSA)封閉1小時，12000rpm、 4。C離心30分鐘，棄上清，用膠體金溶液復(fù)溶至100ml，按lml溶液鋪40cn^的比例，將溶液均勻地鋪在玻璃纖 維膜上，37-C干燥30分鐘，制成膠體金墊。
硝酸纖維素膜的包被
將可與淋病抗原特異性結(jié)合的第二單克隆抗體(鼠抗人上海領(lǐng)潮生
物科技有P艮公司)溶解在0.01M、 pH8.0磷酸緩沖液(PBS)配制成1.0mg/ml 的溶液，用噴膜儀在硝酸纖維素膜一端以1.5^/cm的參數(shù)進行劃線。
將可與上述第一單克隆抗體特異性結(jié)合的羊抗鼠二抗抗體(上海領(lǐng)潮 生物科技有限公司)溶解在O.OIM、 pH8.0磷酸緩沖液(PBS)配制成 1.0mg/ml的溶液，用噴膜儀在硝酸纖維素膜另一端以1.5nl/cm的參數(shù)進行 劃線。
劃線后在室溫下干燥8小時，分別得到檢測線和質(zhì)控線。同樣上述第 一單克隆抗體與第二單克隆抗體相配對。
檢測試紙的組裝
在干燥室內(nèi)，溫度20 25。C，濕度小于30%,將樣品墊(玻璃纖維 膜)、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊(吸水試紙)粘貼在底板上， 其中硝酸纖維素膜位于底板中部，硝酸纖維素膜包^皮有T線的一端與膠體 金墊的1/3搭接，包被有C線的一端與吸樣墊的1/10 4荅接，樣品墊與膠體 金墊的1/5搭接。最后切成寬度為2.5mm的試紙條，也可將試紙條裝入一 個塑料卡中制成才全測卡。
臨床樣品試驗
待檢人在采集唾液樣品前30分鐘禁食，取每位待檢人唾液0.5ml于 紙杯中，用吸管取兩滴滴加到濃度0.02M、 pH8.0的磷酸緩沖溶液中稀釋， 取稀釋的唾液100pl加到樣品墊中，肉眼觀測30分鐘，記錄T線和C線 的顯色狀態(tài)。同時將唾液樣品用淋病抗原ELISA試劑盒;f企測，若兩者檢 測檢測結(jié)果不一致，再以另外兩種淋病抗原ELISA試劑盒進行檢測，若 兩種或以上的ELISA試劑為陽性，判定結(jié)果為陽性，兩種或以上的ELISA 試劑為陰性，判定結(jié)果為陰性。
收集唾液樣品167份，其中ELISA試劑盒檢測出陽性樣品48份，本發(fā)明試紙條(實施例1)檢測出陽性樣品49份，具體結(jié)果如下表1所示: 表l本發(fā)明試紙條對臨床樣品淋病抗原的檢測結(jié)果
本試紙
ELISA+—總數(shù)
+48048
—1118119
總數(shù)49118167
靈敏度=48/48=100%;特異性=118/119=99.2%
9
權(quán)利要求
1、一種淋病抗原唾液快速檢測試紙條，包括底板，底板上依次粘貼有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊，其特征在于所述的膠體金墊上附著有膠體金標(biāo)記的可與淋病抗原特異性結(jié)合的第一單克隆抗體，所述的硝酸纖維素膜上包被有由可與淋病抗原特異性結(jié)合的第二單克隆抗體構(gòu)成的檢測線以及由可與第一單克隆抗體特異性結(jié)合的二抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線，所述的第一單克隆抗體與所述的第二單克隆抗體相配對。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的淋病抗原唾液快速^r測試紙條，其特征在于所述的膠體金墊上附著有0.12 ~ 0.25pg/cm2的可與淋病抗原特異性結(jié) 合的第一單克隆抗體。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的淋病抗原唾液快速檢測試紙條，其特 征在于，所述的膠體金墊制備方法如下取膠體直徑為15 ~ 35nm的膠體金溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0 ~ 8.2,以每 100ml膠體金溶液計，加入0.5 ~ l.Omg的第一單克隆抗體，攪拌后用牛血 清蛋白封閉，離心去上清液，加入相同體積的膠體金溶液復(fù)溶，將每毫升 溶液鋪在40cmh皮璃纖維膜上，干燥后制得膠體金墊。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的淋病抗原唾液快速檢測試紙條，其特征在 于所述的檢測線中所述的第二單克隆抗體的含量為0.05~Upg/cm;所 述的質(zhì)控線中所述的二抗抗體含量為0.05 ~ 1.1pg/cm。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的淋病抗原唾液快速檢測試紙條，其特 征在于，所述的檢測線包#:方法如下將所述的第二單克隆抗體溶解在磷酸緩沖溶液中制得濃度為0.05 ~ 1.0mg/ml溶液，利用該溶液以1 1.5nl/cm的用量在硝酸纖維素膜的一端 劃線，干燥后即得檢測線；所述的質(zhì)控線包被方法如下將所述的二抗抗體溶解在磷酸緩沖溶液中制得濃度為0.05 ~ 1.0mg/ml 溶液，利用該溶液以l~1.5pl/cm的用量在硝酸纖維素膜的另一端劃線， 干燥后即得質(zhì)控線。
6、 一種權(quán)利要求1所述的淋病抗原唾液快速檢測試紙條的檢測方法， 包括以下步驟取人唾液，用磷酸緩沖溶液稀釋，取50~ 100fxl稀釋后的唾液滴在樣 墊上，根據(jù)檢測線和質(zhì)控線的顯色狀態(tài)，判斷檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種淋病抗原唾液快速檢測試紙條，包括底板，底板上依次粘貼有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊，所述的膠體金墊上附著有膠體金標(biāo)記的可與淋病抗原特異性結(jié)合的第一單克隆抗體，所述的硝酸纖維素膜上包被有由第二單克隆抗體構(gòu)成的檢測線以及由可與第一單克隆抗體特異性結(jié)合的二抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線，所述的第一單克隆抗體與第二單克隆抗體相配對。本發(fā)明試紙條采用膠體金標(biāo)記技術(shù)，檢測唾液中的淋病抗原，從而判斷是否感染淋菌，具有操作簡單、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測和自檢、經(jīng)濟實用等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/571GK101661039SQ20091015261
公開日2010年3月3日 申請日期2009年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月10日
發(fā)明者李洪江, 鄭隆泗 申請人:杭州艾力康醫(yī)藥科技有限公司