專利名稱：大菱鲆抗體快速檢測試紙的制作方法
技術領域：
本實用新型屬于水產(chǎn)動物免疫學檢測技術領域，具體涉及一種大菱鲆抗體快速檢測試紙。
背景技術：
大菱鲆(Scophthalmus maximus)是我國引進的海水養(yǎng)殖名貴魚種，已成為我國北方工廠化養(yǎng)殖的主要種類。然而隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴大，養(yǎng)殖密度的不斷增加，大菱鲆疾病問題日漸突出，大規(guī)模死亡現(xiàn)象頻繁發(fā)生。目前，在越來越高的環(huán)保和食品健康安全的要求下，以疫苗等為主要代表的新型病害防治手段得到廣泛發(fā)展。在十一五期間，鰻弧菌基因缺失減毒活疫苗、海水魚哈維氏弧菌病的重組外膜蛋白疫苗轉基因生物安全評價中間試驗已獲得了農(nóng)業(yè)部的批準，此外還構建了遲緩愛德華氏菌基因缺失減毒活疫苗等。在特定品種大菱鲆的養(yǎng)殖中，鰻弧菌疫苗、 遲緩愛德華氏菌疫苗等已經(jīng)得到了廣泛的研究和應用。如今，在以雷霽霖院士為首席科學家的“全國鲆鰈類產(chǎn)業(yè)技術體系”支持下，大菱鲆弧菌相關疫苗有望被國家批準成為新型防治藥物。這種情況下，對抗體的檢測就顯得越來越必要。通過對抗體水平的檢測，不僅可以對疾病進行早期預警，防治其暴發(fā)和流行，也可以實時監(jiān)測動物接種疫苗后體內抗體的應答變化，對其免疫效果進行評定，及時制定有效的免疫程序，提高疫苗應用效率，降低病害損失。但是，現(xiàn)有的魚類抗體檢測方法諸如凝集試驗、瓊脂擴散試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)、免疫熒光等，不僅成本高、費時費力且需專業(yè)人員操作，不易推廣普及，難以解決現(xiàn)場快速檢測問題。因此，亟需建立大菱鲆特異性抗體的快速靈敏、簡便易行、易于推廣應用的現(xiàn)場快速檢測方法。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種大菱鲆抗體快速檢測試紙，即一種可以快速、準確的進行現(xiàn)場檢測大菱鲆特異性抗體的試紙，以彌補現(xiàn)有技術的不足。本實用新型的試紙，包括有底座、試紙芯和覆蓋試紙芯的面板，其中試紙芯安裝在底座的固定槽內，面板上設有加樣孔和結果顯示窗，試紙芯由樣品墊、帶有金標抗體的金標物結合墊、反應膜和吸水墊依次相互搭接粘貼在襯板上制成；且樣品墊的位置對應著面板的加樣孔，反應膜對應著面板的結果顯示窗。其中樣品墊為玻璃纖維棉，金標物結合墊為吸附金標抗體的玻璃纖維棉，反應膜為印制有隱形的檢測線和對照線的硝酸纖維素膜，檢測線和對照線平行排列，且檢測線靠近面板的加樣孔側；吸水墊為吸水能力較強的吸水濾紙，襯板為硬質塑膠條。金標物結合墊上的金標抗體為膠體金標記的兔抗大菱鲆免疫球蛋白多抗，反應膜上的檢測線印記的是牛血清白蛋白(BSA)，反應膜上的對照線印記的是葡萄球菌A蛋白 (SPA)，對照線和檢測線平行排列，相距0. 5cm。檢測線，靠近加樣孔側，面板上印有字母T ； 對照線，在遠離加樣孔側，面板上印有字母C。[0008]本實用新型的試紙制作簡單，特異性強，敏感性高，與ELISA檢測水平相當，使用本實用新型的試紙，無需其它試劑和儀器，可現(xiàn)場操作；5分鐘內即可肉眼判定結果，簡單、 快速、形象、直觀、時效性強，有效的節(jié)省了檢測費用，適用范圍廣，易于推廣應用。另外，以某種抗原替換試紙中的BSA即可制備成相應的抗體檢測試紙。
圖1 本實用新型試紙芯各部分組裝側面結構示意圖。圖2 本實用新型試紙芯組裝后側視結構示意圖。圖3 本實用新型試紙芯俯視結構示意圖。圖4 本實用新型的檢測試紙面板結構俯視圖。圖5 本實用新型的檢測試紙底座結構示意圖。其中1、襯板2、樣品墊3、金標物結合墊4、金標抗體5、檢測線6、對照線7、反應膜8、吸水墊9、加樣孔10、結果顯示窗11、面板12、底座13、固定槽
具體實施方式
制備本實用新型的大菱鲆特異性抗體快速檢測試紙之前，已根據(jù)需要分離純化了大菱鲆血清免疫球蛋白，然后制備其多克隆抗體(多抗)，并以膠體金標記多抗；然后將金標多抗與市售BSA、SPA分別組裝到試紙芯的各個部位，并安裝到塑料殼底座的固定槽中， 最后和面板嵌合在一起制成本實用新型的試紙，下面進行具體描述一、本實用新型的試紙結構及制備過程1、底座12和面板11的加工用軟塑或其他合適的材料來制備底座12，其長度為5 10cm，寬為2 3cm，在底座12上有一個固定槽13，用于安裝固定試紙芯(圖5)。面板11用來覆蓋住底座12和試紙芯，其上設有加樣孔9和結果顯示窗10，在使用的時候為了更好的確定檢測線5和對照線6的位置，在結果顯示窗10的兩邊分別印有字母 T和C，其中T靠近檢測線5端；C靠近對照線6 —側(圖4)。2、試紙芯的制作試紙芯由樣品墊2、帶有金標抗體4的金標物結合墊3、反應膜7和吸水墊8依次相互搭接粘貼在襯板1上制成；且樣品墊2位置對應著面板11的加樣孔9，反應膜7對應著面板11的結果顯示窗10。下面分別對試紙芯的各個組分的制備進行描述(圖1-3)1)金標物結合墊3的制備采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金，其顆粒直徑為20nm，用0. lmol/L K2CO3調膠體金溶液的PH值為8.5，置2-8°C保存?zhèn)溆?。按照ImL膠體金溶液中加入0.3mg多抗的比例， 進行標記Ih后，加入豬血清IgG至終濃度為10 %，在4°C、15000rpm/min條件下離心30min， 用20mM四硼酸鈉溶解沉淀，獲得膠體金標記的金標抗體4。然后將玻璃纖維棉用正常兔血清完全浸潤以降低其非特異吸附性，43°C干燥3h 后，在干燥器內室溫保存?zhèn)溆?。將膠體金標記的金標抗體4用X-only單向噴點儀均勻噴灑于已處理過的玻璃纖維棉上，43°C干燥3h后，加入干燥劑密封保存于干燥的室溫環(huán)境，即制成帶有金標抗體4的金標物結合墊3。[0025]2)反應膜7的制備將硝酸纖維素膜放于X-only單向噴點儀平臺上，將BSA(4mg/mL)放于貯存池A， SPA (0. 8mg/mL)放于貯存池B。將硝酸纖維素膜展平，并放上壓條，開機后將BSA和SPA分別點射于硝酸纖維素膜上形成檢測線5與對照線6，兩線相距0. 5cm，位于膜的中間，距膜的邊距分別為0. 75cm。置室溫自然干燥后，密封室溫保存?zhèn)溆?，即制成了帶有檢測線5和對照線6的反應膜7。3、試紙的組裝將反應膜7、金標物結合墊3、樣品墊2及吸水墊8按照從左至右的順序組裝在不干膠襯板1上。將組裝的半成品試紙放入CM4000切割機槽內，進行切割制成試紙芯，然后將試紙芯固定在底座12的固定槽13內，再用面板11包裝后制備成品試紙，注明生產(chǎn)日期， 與干燥劑一起密封，保存?zhèn)溆?圖1-3)。本實用新型的金標物結合墊3上的金標抗4體為膠體金標記的兔抗大菱鲆免疫球蛋白多抗，反應膜7上的抗原檢測線5為牛血清白蛋白(BSA)，反應膜7上的對照線6為葡萄球菌A蛋白(SPA)。另外，以某種抗原替換試紙中的BSA即可制備成相應的抗體檢測試紙。下面對兔抗大菱鲆免疫球蛋白多抗的制備過程進行描述。1)大菱鲆血清免疫球蛋白的分離純化取正常大菱鲆50尾，尾靜脈采血，室溫放置Ih后，4°C過夜，次日離心(5000r/min， 30min,4°C )分離血清，分裝并保存于-70°C冰箱待用。鹽析法對大菱鲆血清免疫球蛋白(IgM)進行粗提，具體操作步驟如下大菱鲆血清以等體積0. 01mol/L(pH = 7. 4)磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后，在0. 01mol/L(pH = 5. 4) 磷酸緩沖液(PB)中4°C透析，離心(3000r/min，30min，4°C )收集沉淀后，將沉淀溶解于 0. lmol/L(pH = 5. 4)PB中后繼續(xù)按上述方法透析，再次離心收集沉淀后并將其溶解于 0. lmol/L (pH = 8. 6) PB 中，過 S印hadex-200 凝膠柱(80cmX 1.5cm)進一步純化，以 0. Imol/ L(pH = 8. 6) PB為洗脫緩沖液，SDS-PAGE檢驗，收集純度較高的樣品。S印hadex-200凝膠柱分離的樣品合并濃縮后，再過POROS 20HQ(AppliedBiosystems, USA)陰離子交換柱(100mmX4. 6mm)，以 0. 05mol/L(pH = 8. 5) Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫，NaCl濃度梯度為0至0. 5mol/L,流速度為5mL/min，檢測波長為280nm，收集洗脫峰，濃縮后以SDS-PAGE檢驗，收集純度高的樣品，測定蛋白質含量 (Nano Drop, ND-1000Spectrophotometer, USA)后于 _20°C保存?zhèn)溆谩?)大菱鲆免疫球蛋白多抗的制備將純化的大菱鲆血清IgM與等體積的弗氏完全佐劑(Pierce，USA)混勻乳化后，對新西蘭白兔背部皮下多點注射，每只兔子注射ImL(含0. Img IgM)(首免)。首免21d后， 將IgM與弗氏不完全佐劑(Pierce，USA)等比混勻乳化后，進行加強免疫，每只兔子注射 ImL(含0.2mg IgM) (二免)。二免21d后以相同劑量和方法再次加強免疫(三免)。三免 21d后，以2mL(含0.3mg IgM)的量再次加強免疫(四免)。四免21d后通過心臟取血，并分離血清，保存于-70°C冰箱待用。采用辛酸-硫酸銨鹽析法純化獲得的多抗，即兔IgG，透析后測定其效價水平及蛋白質含量，分裝并-20°C凍存?zhèn)溆?。二、試紙工作原理、程序及結果判定[0038]應用試紙進行檢測時，將待檢樣品滴入樣品墊2區(qū)，在毛細作用下，滴入的樣品會沿著試紙芯一直遷移擴散到吸水墊8處。當檢測樣品為陽性時(含抗BSA的IgMjP BSA-IgM)，待檢測的BSA-IgM會與金標物結合墊3上的金標抗體4 (兔抗IgM)結合形成膠體金抗體復合物，此復合物會與反應膜7上檢測線5的BSA結合并在檢測線5區(qū)形成肉眼可見的膠體金紅色條帶。如果檢測線5不顯紅色，則說明檢測樣品為陰性。無論檢測樣品是陽性還是陰性，金標抗體4都會與反應膜上對照線6處的SPA結合并顯紅色條帶；對照線 6如果不顯色，說明試紙無效。下面對本實用新型試紙的使用過程及檢測特異性進行描述試紙檢測特異性分析將制備的大菱鲆抗BSA血清以生理鹽水10倍稀釋后作為陽性血清，正常大菱鲆血清以生理鹽水10倍稀釋后作為陰性血清，生理鹽水作為對照。取 100 μ L樣品滴加在試紙的加樣孔9內，5min內可肉眼觀察結果，同時用BioDot-TSR 3000 讀條儀對檢測線5進行讀值，量化結果(表1)。結果表明，以組裝后的試紙條檢驗所制備的大菱鲆抗BSA血清，從大菱鲆免疫第四周開始試紙檢測出現(xiàn)陽性反應，且試紙條的顏色反應隨著大菱鲆免疫時間的延長而顯色逐漸加深，其變化趨勢與間接ELISA法檢測結果一致；其中第十周的顯色與第九周比較略弱，這與ELISA法檢測時第十周的顯色相對光密度讀值與第九周比較略低的結果相一致。試紙條與正常大菱鲆血清和生理鹽水均呈陰性反應。試紙檢測靈敏度分析將大菱鲆抗BSA血清(免疫后第9周樣品)從1 100開始以生理鹽水倍比稀釋檢驗試紙的檢測靈敏度，正常大菱鲆血清以生理鹽水100倍稀釋后作為陰性血清，生理鹽水作為對照。取100 μ L樣品滴加在試紙的加樣孔9內，5min內可肉眼觀察結果，同時用BioDot-TSR 3000讀條儀對檢測線5進行讀值，量化結果(表1)。結果表明組裝后的試紙條與1 100開始倍比稀釋的大菱鲆抗BSA血清反應，隨著稀釋倍數(shù)的增加，肉眼可見試紙條的顏色反應逐漸減弱。以大菱鲆免疫后第九周血清為例，當血清稀釋到1 25600時顯色為弱陽性，繼續(xù)稀釋則無肉眼可見顯色反應，試紙條檢測結果與間接 ELISA法檢測結果相當。試紙條與正常大菱鲆血清和生理鹽水均呈陰性反應。表1檢測不同樣品后試紙條檢測線的相對光密度值
6各免疫周血清 Serum in different week相對光密度值 ROD第9周血清稀釋 Dilution of serum in week 9相對光密度值 RODWO0.821/100120.48Wl0.861/200103.98W20.791/400101.05W36.111/80063.57W418.041/160053.81W559.321/320045.98W6107.831/640039.68W7122.241/1280019.98W8142.391/2560010.97W9176.331/512006.22WlO152.65陰性血清1.39對照組0.77對照組0.93 檢測結果表明本實用新型制備檢測試紙的特異性和敏感性與ELISA法相當。
權利要求1.一種大菱鲆抗體快速檢測試紙，其特征在于，所述的試紙包括有底座(12)、試紙芯和覆蓋試紙芯的面板(11)，其中試紙芯安裝在底座(12)的固定槽(13)內，面板(11)上設有加樣孔(9)和結果顯示窗(10)，試紙芯由樣品墊(2)、帶有金標抗體(4)的金標物結合墊 (3)、反應膜(7)和吸水墊(8)依次相互搭接粘貼在襯板(1)上制成；且樣品墊(2)的位置對應著面板(11)的加樣孔(9)，反應膜(7)對應著面板(11)的結果顯示窗(10)。
2.如權利要求1所述的檢測試紙，其特征在于上述樣品墊(2)為玻璃纖維棉。
3.如權利要求1所述的檢測試紙，其特征在于上述的金標物結合墊(3)為玻璃纖維棉。
4.如權利要求1所述的檢測試紙，其特征在于上述的反應膜(7)為印制有隱形的檢測線(5)和對照線(6)的硝酸纖維素膜。
5.如權利要求4所述的檢測試紙，其特征在于上述的檢測線(5)和對照線(6)平行排列，且檢測線(5)靠近面板(11)的加樣孔(9)側。
6.如權利要求4或5所述的檢測試紙，其特征在于上述的檢測線(5)為牛血清白蛋白BSA。
7.如權利要求4或5所述的檢測試紙，其特征在于上述的對照線(6)為葡萄球菌A蛋白 SPA。
8.如權利要求1所述的檢測試紙，其特征在于上述的金標抗體(4)為膠體金標記的兔抗大菱鲆免疫球蛋白多抗。
9.如權利要求1所述的檢測試紙，其特征在于上述的吸水墊(8)為吸水濾紙。
10.如權利要求1所述的檢測試紙，其特征在于上述的襯板(1)為硬質塑膠條。
專利摘要本實用新型涉及一種大菱鲆抗體快速檢測試紙，包括有底座、試紙芯和覆蓋試紙芯的面板，其中試紙芯安裝在底座的固定槽內，面板上設有加樣孔和結果顯示窗，試紙芯由樣品墊、帶有金標抗體的金標物結合墊、反應膜和吸水墊依次相互搭接粘貼在襯板上制成；且樣品墊的位置對應著面板的加樣孔，反應膜對應著面板的結果顯示窗。本實用新型的試紙制作簡單，特異性強，敏感性高，與ELISA檢測水平相當，使用本實用新型的試紙，無需其它試劑和儀器，可現(xiàn)場操作；5分鐘內即可肉眼判定結果，簡單、快速、形象、直觀、時效性強，有效的節(jié)省了檢測費用，適用范圍廣，易于推廣應用。另外，以某種抗原替換試紙中的BSA即可制備成相應的抗體檢測試紙。
文檔編號G01N33/558GK202033366SQ20112013159
公開日2011年11月9日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權日2011年4月22日
發(fā)明者劉濱, 孟振, 張改平, 李青梅, 王蔚芳, 郭軍慶, 雷霽霖 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所