真菌基因文庫(kù)的雙分裂標(biāo)記物整合的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中對(duì)基因文庫(kù)進(jìn)行位點(diǎn)特異性染色體整合的方法以及適用于此目的的多核苷酸構(gòu)建體。
【專(zhuān)利說(shuō)明】真菌基因文庫(kù)的雙分裂標(biāo)記物整合
[0001] 對(duì)序列表的引用
[0002] 本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表。該計(jì)算機(jī)可讀形式通過(guò)引用結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及若干已知特征和技術(shù)的組合，當(dāng)如在此所示一起應(yīng)用時(shí)，其提供一種 用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中對(duì)基因文庫(kù)進(jìn)行位點(diǎn)特異性染色體整合的改進(jìn)方法以及適用 于此目的的多核苷酸構(gòu)建體。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 常染色體復(fù)制質(zhì)粒已經(jīng)被用來(lái)成功地轉(zhuǎn)化真菌宿主細(xì)胞，既作為預(yù)形成的環(huán)狀質(zhì) 粒又作為線性化質(zhì)粒與PCR片段一起共轉(zhuǎn)化，用于在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)重組的目 的。真菌復(fù)制質(zhì)粒配備有自主復(fù)制序列，例如熟知的最初從構(gòu)巢曲霉分離的AMA1序列或其 已知的功能衍生物之一(參見(jiàn)例如，阿萊克森科(Aleksenko)和克拉特巴克(Clutterbuck)， 分子微生物學(xué)(Mol Microbiol ·) 1996年2月；19(3): 565-74) 〇
[0006] 例如由尼爾森(Nielsen)等人(針對(duì)構(gòu)巢曲霉的有效的基于PCR的用可再循環(huán)標(biāo)記 物進(jìn)行的基因革巴向（Efficient PCR-based gene targeting with a recyclable marker for Aspergillus nidulans)，真菌遺傳學(xué)和生物學(xué)（Fungal Genetics and Biology)43 (2006)54-64)披露了絲狀真菌宿主中的位點(diǎn)特異性分裂標(biāo)記物（split-marker)或雙分 (bi-part ite)染色體整合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 眾所周知，常染色體復(fù)制質(zhì)粒的使用改進(jìn)在絲狀真菌宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化效率，并 且提供一致的表達(dá)水平，以使得當(dāng)所述質(zhì)粒被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，能夠比較自包括在其中 的基因文庫(kù)表達(dá)的蛋白質(zhì)。然而，本申請(qǐng)的諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用自主復(fù)制載體對(duì)絲狀真 菌宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，隨后進(jìn)行包括在所述載體中的編碼脂肪酶的基因的位點(diǎn)特異性分裂 標(biāo)記物染色體整合，提供了優(yōu)越的轉(zhuǎn)化效率加上脂肪酶表達(dá)水平的出人意料的增加，如通 過(guò)SDS-PAGE評(píng)估的（參見(jiàn)圖3)。
[0008] 因此，在第一方面，本發(fā)明涉及用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中對(duì)基因文庫(kù)進(jìn)行位點(diǎn) 特異性染色體整合的方法，所述方法包括以下步驟：
[0009] a)提供一種多核苷酸構(gòu)建體，該多核苷酸構(gòu)建體包括自主復(fù)制序列和整合盒，所 述盒包括基因文庫(kù)和第一選擇性標(biāo)記，其中該盒在一側(cè)側(cè)接第二選擇性標(biāo)記的非功能性部 分并且在另一側(cè)側(cè)接第三選擇性標(biāo)記的非功能性部分；
[0010] b)提供一種絲狀真菌宿主細(xì)胞，該絲狀真菌宿主細(xì)胞在其染色體中包括第二選擇 性標(biāo)記的非功能性部分以及第三選擇性標(biāo)記的非功能性部分，其中第二和第三選擇性標(biāo)記 的染色體非功能性部分與多核苷酸構(gòu)建體中的對(duì)應(yīng)的非功能性部分之間的正確重組將產(chǎn) 生第二和第三功能性染色體選擇性標(biāo)記；
[0011] c)用多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并且針對(duì)第一選擇性標(biāo)記在該宿主細(xì)胞中的 存在進(jìn)行選擇，由此分離出被成功轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;并且然后
[0012] d)針對(duì)第二和第三功能性選擇性標(biāo)記的存在進(jìn)行選擇，由此獲得具有基因文庫(kù)的 正確位點(diǎn)特異性染色體整合的宿主細(xì)胞。
[0013] 在第二方面，本發(fā)明涉及用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中對(duì)基因文庫(kù)進(jìn)行位點(diǎn)特異性 染色體整合的多核苷酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括自主復(fù)制序列和整合盒，所述盒包括基因 文庫(kù)和第一選擇性標(biāo)記，其中該盒在一側(cè)側(cè)接第二選擇性標(biāo)記的非功能性部分并且在另一 側(cè)側(cè)接第三選擇性標(biāo)記的非功能性部分。
[0014] 定義
[0015] 編碼序列：術(shù)語(yǔ)"編碼序列"意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列 的邊界一般由開(kāi)放閱讀框架決定，該開(kāi)放閱讀框架從起始密碼子(如ATG、GTG或TTG)開(kāi)始并 且以終止密碼子(如TAA、TAG或TGA)結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組 合。
[0016] 控制序列：術(shù)語(yǔ)"控制序列"意指對(duì)于表達(dá)編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必 需的核酸序列。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼該多肽的多核苷酸來(lái)說(shuō)可以是天然的（即，來(lái)自相同 基因）或外源的（即，來(lái)自不同基因），或相對(duì)于彼此是天然的或外源的。此類(lèi)控制序列包括 但不限于前導(dǎo)子、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列、以及轉(zhuǎn)錄終止子。至少， 控制序列包括啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。出于引入有利于將這些控制序列與編碼多 肽的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的，這些控制序列可以提供有多個(gè) 接頭。
[0017] 表達(dá):術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修 飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。
[0018] 表達(dá)載體:術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"意指線性或環(huán)狀DNA分子，該分子包括編碼多肽的多核 苷酸并且該多核苷酸可操作地與提供用于其表達(dá)的控制序列相連接。
[0019]宿主細(xì)胞:術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"意指易于用包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類(lèi)型。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變 而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。
[0020] 分離的：術(shù)語(yǔ)"分離的"意指處于自然界中不存在的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的 物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括（1)任何非天然存在的物質(zhì)，（2)包括但不限于任何酶、變體、核 酸、蛋白、肽或輔因子的任何物質(zhì)，該物質(zhì)至少部分地從與其本質(zhì)相關(guān)的一種或多種或所有 天然存在的成分中去除；（3)相對(duì)于天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)通過(guò)人工修飾的任何物質(zhì)；或(4)通過(guò) 增加該物質(zhì)相對(duì)于與其天然相關(guān)的其他組分的量而修飾的任何物質(zhì)（例如，宿主細(xì)胞中的 重組體產(chǎn)生;編碼該物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝；以及使用比編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)的啟 動(dòng)子強(qiáng)的啟動(dòng)子）。
[0021] 核酸構(gòu)建體：術(shù)語(yǔ)"核酸構(gòu)建體"或"多核苷酸構(gòu)建體"意指單鏈或雙鏈的核酸分 子，該核酸分子是從天然存在的基因中分離的，或以本來(lái)不存在于自然界中的方式被修飾 成含有核酸的區(qū)段，或是合成的，該核酸分子包括一個(gè)或多個(gè)控制序列。
[0022] 可操作地連接:術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"意指如下的構(gòu)造，其中，控制序列相對(duì)于多核 苷酸的編碼序列安置在適當(dāng)位置，從而使得該控制序列指導(dǎo)該編碼序列的表達(dá)。
[0023] 序列一致性:用參數(shù)"序列一致性"來(lái)描述兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列 之間的相關(guān)性。出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件 套件，賴(lài)斯(Rice)等人，2000，遺傳學(xué)趨勢(shì)(Trends Genet ·) 16:276-277)(優(yōu)選5 · 0 · 0版或更 新版本)的尼德?tīng)?如6(116)程序中所實(shí)施的尼德?tīng)柭?翁施(如6(1161]^11-￥11118〇11)算法(尼德 爾曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970,分子生物學(xué)雜志（J.Mol .Biol .)48:443-453)來(lái)確 定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性。所使用的參數(shù)是空位開(kāi)放罰分10,空位延伸罰分 0.5，以及EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。尼德?tīng)枠?biāo)注的"最長(zhǎng)的一致性"的輸 出(使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得)被用作百分比一致性，并且計(jì)算如下：
[0024](一致的殘基X 100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù)）
[0025]出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件套件， 賴(lài)斯等人，2000,同上）（優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德?tīng)柍绦蛑兴鶎?shí)施的尼德?tīng)柭?翁施 算法(尼德?tīng)柭臀淌?970,同上)來(lái)確定兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性。所 使用的參數(shù)是空位開(kāi)放罰分1 〇，空位延伸罰分〇 . 5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS 版)取代矩陣。尼德?tīng)枠?biāo)注的"最長(zhǎng)的一致性"的輸出（使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得)被用作百分比 一致性，并且計(jì)算如下：
[0026](一致的脫氧核糖核苷酸X 100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù)）
[0027]變體:術(shù)語(yǔ)"變體"意指在一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))位置處包括改變(即，取代、插 入和/或缺失）的多肽。取代意指用不同的氨基酸置換占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸;缺失意指去 除占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸;并且插入意指在鄰接并且緊隨占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸之后添加 一個(gè)氨基酸。
[0028]附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0029] 圖1示出了在實(shí)例1中構(gòu)建的質(zhì)粒pBAC3155。
[0030] 圖2示出了在實(shí)例1中構(gòu)建的質(zhì)粒pBGMH0021。
[0031]圖3示出了 SDS-PAGE的照片；泳道卜3示出了通過(guò)具有攜帶在附加型基于AMA1質(zhì)粒 上的表達(dá)盒的菌株(BGMH1000)表達(dá)的脂肪酶條帶（由箭頭指示），然而泳道4-6示出了通過(guò) 具有整合到宿主菌株(BGMH1001;C0LS1300)的染色體中的表達(dá)盒的菌株表達(dá)的顯著更粗的 脂肪酶條帶，如在此的實(shí)例2中概述的。
[0032] 發(fā)明詳述
[0033] 本發(fā)明的第一方面涉及用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中對(duì)基因文庫(kù)進(jìn)行位點(diǎn)特異性 染色體整合的方法，所述方法包括以下步驟：
[0034] a)提供一種多核苷酸構(gòu)建體，該多核苷酸構(gòu)建體包括自主復(fù)制序列和整合盒，所 述盒包括基因文庫(kù)和第一選擇性標(biāo)記，其中該盒在一側(cè)側(cè)接第二選擇性標(biāo)記的非功能性部 分并且在另一側(cè)側(cè)接第三選擇性標(biāo)記的非功能性部分；
[0035] b)提供一種絲狀真菌宿主細(xì)胞，該絲狀真菌宿主細(xì)胞在其染色體中包括該第二選 擇性標(biāo)記的非功能性部分以及該第三選擇性標(biāo)記的非功能性部分，其中該第二和第三選擇 性標(biāo)記的染色體非功能性部分與該多核苷酸構(gòu)建體中的對(duì)應(yīng)的非功能性部分之間的正確 重組將產(chǎn)生第二和第三功能性染色體選擇性標(biāo)記；
[0036] c)用多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并且針對(duì)第一選擇性標(biāo)記在該宿主細(xì)胞中的 存在進(jìn)行選擇，由此分離出被成功轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;并且然后
[0037]針對(duì)第二和第三功能性選擇性標(biāo)記的存在進(jìn)行選擇，由此獲得具有基因文庫(kù)的正 確位點(diǎn)特異性染色體整合的宿主細(xì)胞。
[0038] 在第二方面，本發(fā)明涉及用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中對(duì)基因文庫(kù)進(jìn)行位點(diǎn)特異性 染色體整合的多核苷酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括自主復(fù)制序列和整合盒，所述盒包括基因 文庫(kù)和第一選擇性標(biāo)記，其中該盒在一側(cè)側(cè)接第二選擇性標(biāo)記的非功能性部分并且在另一 側(cè)側(cè)接第三選擇性標(biāo)記的非功能性部分。
[0039] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該基因文庫(kù)包括編碼感興趣的親本多肽的基因的 修飾的、突變的或變體版本或由其組成;優(yōu)選地，該感興趣的親本多肽是一種酶;更優(yōu)選地， 其是半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、 糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移 酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、 變位酶(mutanase )、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酸氧化酶、蛋白水解酶、核 糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
[0040] 本發(fā)明的絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選地是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬 (Bjerkandera)、擬臘菌屬(Ceriporiopsis)、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬(Coriolus)、隱 球菌屬、線黑粉菌科(Filibasidium)、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬、 毀絲霉屬、新美鞭菌屬、鏈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃 壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂裙菌屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓 菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞;更優(yōu)選地，該絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲 霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(Bjerkandera adusta)、干擬錯(cuò)菌 (Ceriporiopsis aneirina)、卡內(nèi)基擬錯(cuò)菌（Ceriporiopsis caregiea)、淺黃擬錯(cuò)菌 (Ceriporiopsis gilvescens) Ceriporiopsis pannocinta)、環(huán)帶擬錯(cuò) 菌（Ceriporiopsis rivu lo sa)、微紅擬錯(cuò)菌（Ceripori ops is subrufa)、蟲(chóng)擬錯(cuò)菌 (Ceriporiopsis subvermispora)、狹邊金抱子菌（Chrysosporium inops)、嗜角質(zhì)金抱子 菌（Chrysosporium keratinophilum)、盧克諾文思金抱子菌（Chrysosporium lucknowense)、奠狀金抱子菌（Chrysosporium merdarium)、租金抱子菌（Chrysosporium pannicola)、昆士蘭金孢子菌（Chrysosporium queenslandicum)、熱帶金孢子菌、褐薄金孢 子菌（Chrysosporium zonatum)、灰蓋鬼傘、毛革蓋菌（Coriolus hirsutus)、桿孢狀鐮孢 (Fusarium bactridioides)、谷類(lèi)鏡抱（Fusarium cerealis)、庫(kù)威鏡抱（Fusarium crookwellense)、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮孢、合歡木 鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮 抱(Fusarium torulosum)、擬絲抱鏡抱(Fusarium trichothecioides)、鑲片鏡抱、特異腐 質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、射脈菌 (Phlebia radiata)、刺序側(cè)耳（Pleurotus eryngii)、土生梭孢殼霉、長(zhǎng)絨毛栓菌 (Trametes villosa)、變色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、 里氏木霉、或綠色木霉細(xì)胞。
[0041]優(yōu)選的是本發(fā)明的絲狀真菌宿主細(xì)胞具有增加的同源重組與非同源重組（HR/ NHR)比率；優(yōu)選地，非同源末端連接(NHEJ)途徑的一種或多種組分被抑制或者同源重組 (HR)途徑的一種或多種組分被過(guò)表達(dá);最優(yōu)選地，酵母KU70基因的等效物被失活。
[0042]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的自主復(fù)制序列是來(lái)自構(gòu)巢曲霉的AMA1序列或其功 能衍生物。
[0043] 本發(fā)明的選擇性標(biāo)記優(yōu)選地是pyrG、ni iA和niaD。
[0044] 核酸構(gòu)建體
[0045] 本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體或多核苷酸構(gòu)建體，這些構(gòu)建體包含可操作地連接至一 個(gè)或多個(gè)控制序列的本發(fā)明的基因文庫(kù)，在與控制序列相容的條件下，這些控制序列指導(dǎo) 編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
[0046] 該多核苷酸可以按多種方式操縱，以提供該多肽的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在多核 苷酸序列插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操縱可以是令人希望的或必要的。用于利用重組DNA方法 修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
[0047] 該控制序列可以是啟動(dòng)子，即，被宿主細(xì)胞識(shí)別以對(duì)編碼本發(fā)明的多肽的多核苷 酸進(jìn)行表達(dá)的多核苷酸。該啟動(dòng)子包含轉(zhuǎn)錄控制序列，這些序列介導(dǎo)該多肽的表達(dá)。該啟動(dòng) 子可以是在宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變型、截短型及雜合型啟 動(dòng)子，并且可以由編碼與該宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得。
[0048] 在絲狀真菌宿主細(xì)胞中，用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí) 例是獲得自以下各項(xiàng)的基因的啟動(dòng)子:構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉酸 穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性 蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶-樣蛋白酶(W0 96/00787)、鑲片鐮孢菌淀 粉葡糖苷酶(W0 00/56900)、鑲片鐮孢菌Daria(達(dá)莉亞）（W0 00/56900)、鑲片鐮孢菌Quinn (奎恩）（W0 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖 苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、 里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶Π 、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉 木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶Π 、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏 木霉翻譯延伸因子，連同NA2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自編碼中性α-淀粉酶的曲霉屬基因的修飾的啟 動(dòng)子，其中已經(jīng)用來(lái)自編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的曲霉屬基因的未翻譯的前導(dǎo)子替換未翻譯的 前導(dǎo)子;非限制性實(shí)例包括來(lái)自編碼中性淀粉酶的黑曲霉基因的修飾的啟動(dòng)子，其中已 經(jīng)用來(lái)自編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的構(gòu)巢曲霉或米曲霉基因的未翻譯的前導(dǎo)子替換未翻譯的 前導(dǎo)子）；及其突變型、截短型及雜合型啟動(dòng)子。其他啟動(dòng)子在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，011，147中描 述。
[0049] 控制序列還可以是由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止子。該終止子可操作地 連接至編碼該多肽的多核苷酸的3'_末端。在該宿主細(xì)胞中起作用的任何終止子都可以用 于本發(fā)明中。
[0050] 用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從以下各項(xiàng)的基因獲得:構(gòu)巢曲霉乙酰胺 酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α_葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉 酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、里氏木霉葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉 纖維二糖水解酶Π 、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡 聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉 木聚糖酶III、里氏木霉木糖苷酶以及里氏木霉翻譯延長(zhǎng)因子。
[0051] 該控制序列還可以是在啟動(dòng)子下游并且在基因編碼序列上游的mRNA穩(wěn)定子區(qū)域， 它增加該基因的表達(dá)。
[0052] 該控制序列還可以是前導(dǎo)子，一種對(duì)宿主細(xì)胞翻譯重要的非翻譯mRNA區(qū)域。該前 導(dǎo)子可操作地連接至編碼該多肽的多核苷酸的5'_末端?？梢允褂迷谒拗骷?xì)胞中起作用的 任何前導(dǎo)子。
[0053] 用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)子是從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷 酸異構(gòu)酶的基因獲得。
[0054] 控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，可操作地連接至該多核苷酸的3'-末端并且 當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)由宿主細(xì)胞識(shí)別為將聚腺苷酸殘基添加至所轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號(hào)的序列?？梢允褂?在宿主細(xì)胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。
[0055] 用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選聚腺苷酸化序列是從以下各項(xiàng)的基因獲得:構(gòu)巢曲 霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖鐮 抱膜蛋白酶樣蛋白酶。
[0056] 控制序列還可以是編碼與多肽的N-末端連接并指導(dǎo)多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌通路的 信號(hào)肽的信號(hào)肽編碼區(qū)。多核苷酸的編碼序列的5'_端可以固有地包含在翻譯閱讀框中與 編碼多肽的編碼序列的區(qū)段天然地連接的信號(hào)肽編碼序列?？商娲?，編碼序列的5'_端可 以包含對(duì)于該編碼序列而言是外源的信號(hào)肽編碼序列。在編碼序列不天然地包含信號(hào)肽編 碼序列的情況下，可能需要外源信號(hào)肽編碼序列?？商娲兀庠葱盘?hào)肽編碼序列可簡(jiǎn)單地 替換天然的信號(hào)肽編碼序列以便增強(qiáng)該多肽的分泌。然而，可以使用指導(dǎo)所表達(dá)多肽進(jìn)入 宿主細(xì)胞的分泌通路的任何信號(hào)肽編碼序列。
[0057] 用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是獲得自以下各項(xiàng)的基因的信號(hào) 肽編碼序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維 素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、柔毛腐質(zhì)霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0058] 控制序列還可以是編碼位于多肽的N-末端處的前肽的前肽編碼序列。生成的多肽 被稱(chēng)為前體酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情況下被稱(chēng)為酶原(zymogen))。多肽原通常 是無(wú)活性的并且可以通過(guò)催化切割或自身催化切割來(lái)自多肽原的前肽而轉(zhuǎn)化為活性多肽。 前肽編碼序列可以從以下各項(xiàng)的基因獲得:枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿 菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(W0 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及 釀酒酵母因子。
[0059] 在信號(hào)肽序列和前肽序列二者都存在的情況下，該前肽序列定位成緊鄰多肽的Ν-末端并且該信號(hào)肽序列定位成緊鄰該前肽序列的Ν-末端。
[0060] 還可能希望地是添加調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)序列相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)多肽 的表達(dá)。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例是使得基因的表達(dá)響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)節(jié)化合物的存 在)而開(kāi)啟或關(guān)閉的那些。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、米曲霉TAKA 淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、里氏木霉纖維二糖水解酶I啟動(dòng)子以及里氏 木霉纖維二糖水解酶II啟動(dòng)子。調(diào)控序列的其他實(shí)例是允許基因擴(kuò)增的那些。在真核系統(tǒng) 中，這些調(diào)控序列包括在甲氨蝶呤存在下被擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因以及用重金屬擴(kuò)增 的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)控序列可操作地連接。
[0061 ] 表達(dá)載體
[0062]本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的多核苷酸、啟動(dòng)子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)的重組 表達(dá)載體。不同的核苷酸和控制序列可以連接在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載 體可以包括一個(gè)或多個(gè)便利的限制酶切位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)處插入或取代編碼該多肽 的多核苷酸?？商娲?，該多核苷酸可以通過(guò)將該多核苷酸或包括該多核苷酸的核酸構(gòu)建 體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體中來(lái)表達(dá)。在產(chǎn)生該表達(dá)載體時(shí)，該編碼序列位于該載體中，這 樣使得該編碼序列與該供表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接。
[0063] 重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)粒或病毒），其能夠方便地進(jìn)行重組DNA程 序，并且能夠引起多核苷酸的表達(dá)。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載體 的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可以是線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。
[0064] 該載體包含一個(gè)或多個(gè)允許方便地選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞等細(xì)胞的 選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是這樣一種基因，該基因的產(chǎn)物提供了殺生物劑抗性或病毒抗性、 重金屬抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等。
[0065]用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的選擇性標(biāo)記包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰 氨基咪唑-琥珀羧胺合酶）、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶）、amdS(乙酰胺酶）、argB(鳥(niǎo)氨 酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶）、bar(草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶）、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶）、niaD(硝酸還原 酶）、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶）、sC(硫酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶）、以及trpC(鄰氨基苯甲酸 合酶），連同其等效物。優(yōu)選在曲霉屬細(xì)胞中使用的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以 及吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus)bar基因。優(yōu)選在木霉屬細(xì)胞中使用的是 adeA、adeB、amdS、hph 以及pyrG基因。
[0066] 選擇性標(biāo)記可以是如在WO 2010/039889中描述的雙選擇性標(biāo)記系統(tǒng)。在一方面， 雙選擇性標(biāo)記是hph-tk雙選擇性標(biāo)記系統(tǒng)。
[0067] 對(duì)于整合到該宿主細(xì)胞基因組中，該載體可以依靠編碼該多肽的多核苷酸序列或 用于通過(guò)同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件。可替代地，該載 體可以包含用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中的一個(gè)或多個(gè)染色體中的 一個(gè)或多個(gè)精確位置處的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置整合的可能性，這些整合 元件應(yīng)包含足夠數(shù)量的核酸，例如100至10，〇〇〇個(gè)堿基對(duì)、400至10，000個(gè)堿基對(duì)、以及800 至10,000個(gè)堿基對(duì)，這些堿基對(duì)與對(duì)應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重組的 可能性。這些整合元件可以是與宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)的靶序列同源的任何序列。此外，這些 整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，該載體可以通過(guò)非同源重組 整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
[0068] 對(duì)于自主復(fù)制，該載體包括使該載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制 起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語(yǔ)"復(fù)制起點(diǎn) (origin of replication)"或"質(zhì)粒復(fù)制子(plasmid replicator)"意指使得質(zhì)?；蜉d體 可在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。
[0069]在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMA1和ANSI (格姆斯（Gems)等人， 1991，基因（Gene)98:61-67;卡倫(Cullen)等人，1987,核酸研究（Nucleic Acids Res. )15: 9163-9175;W0 00/24883)^1^1基因的分離和包含該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建可以根據(jù)披 露于W0 00/24883中的方法來(lái)完成。
[0070]可以將本發(fā)明的多核苷酸的多于一個(gè)的拷貝插入到宿主細(xì)胞中以增加多肽的產(chǎn) 生。通過(guò)將序列的至少一個(gè)另外的拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中或者通過(guò)包括與該多核苷 酸一起的可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因可以獲得多核苷酸的增加的拷貝數(shù)目，其中通過(guò)在適當(dāng) 的選擇性試劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞可以選擇包含選擇性標(biāo)記基因的經(jīng)擴(kuò)增的拷貝的細(xì)胞，以 及由此該多核苷酸的另外的拷貝。
[0071] 用于連接以上所描述的元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的程序是本領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)例如，薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989,同上）。
[0072] 可以將真菌細(xì)胞通過(guò)涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、以及細(xì)胞壁再生的方法 以本身已知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的適合程序描述于EP 238023， 約爾頓(Yelton)等人，1984,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊（Proc.Natl .Acad. Sci.USA)81:1470-1474以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988,生物/技術(shù)(Bio/Technology )6:1419-1422 中。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬物種的適合方法由馬拉迪爾(Malardier)等人，1989,基因（Gene)78: 147-156和W0 96/00787描述。
[0073]生產(chǎn)方法
[0074]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，這些方法包括(a)在有益于產(chǎn)生該多肽 的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞;并且可任選地，（b)回收該多肽。
[0075]這些宿主細(xì)胞是在適合于使用本領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生該多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中 培養(yǎng)的。例如，可以通過(guò)在適合的培養(yǎng)基中和在允許表達(dá)和/或分離該多肽的條件下，進(jìn)行 搖瓶培養(yǎng)，或者在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)，分批，分批 補(bǔ)料，或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。該培養(yǎng)是使用本領(lǐng)域中已知的程序，在適合的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基 中發(fā)生，該培養(yǎng)基包含碳源和氮源及無(wú)機(jī)鹽。適合的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根 據(jù)公開(kāi)的組成(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中）制備。如果多肽分泌到該營(yíng)養(yǎng) 培養(yǎng)基中，那么可直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽不被分泌，那么其可從細(xì)胞裂解液中 進(jìn)行回收。
[0076]可以使用特異性針對(duì)這些多肽的本領(lǐng)域已知的方法來(lái)檢測(cè)該多肽。這些檢測(cè)方法 包括但不限于，特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶測(cè)定 來(lái)確定該多肽的活性。
[0077]可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)回收多肽。例如，該多肽可以通過(guò)常規(guī)程序，包括但 不限于，收集、離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀，從該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基回收。在一方面，回 收包含該多肽的發(fā)酵液。
[0078]可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的多種程序來(lái)純化該多肽以獲得基本上純的多肽，這些程 序包括但不限于:色譜法(例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜、色譜聚焦、以及尺 寸排阻色譜）、電泳程序(例如，制備型等電點(diǎn)聚焦）、差別溶解度(例如，硫酸銨沉淀）、SDS-PAGE、或提取（參見(jiàn)例如，蛋白質(zhì)純化（Protein Purification)，詹森（Janson)和賴(lài)登 (Ryden)編輯，VCH出版社(VCH Publishers)，紐約，1989)。
[0079] 在一個(gè)替代性方面中，沒(méi)有回收該多肽，而是將表達(dá)該多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞 用作該多肽的來(lái)源。
[0080] 發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物
[0081] 本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物。發(fā)酵液產(chǎn)物進(jìn)一 步包括在發(fā)酵過(guò)程中使用的另外的成分，例如像，細(xì)胞(包括含有編碼本發(fā)明的多肽的基因 的宿主細(xì)胞，這些宿主細(xì)胞被用于產(chǎn)生感興趣的多肽）、細(xì)胞碎片、生物質(zhì)、發(fā)酵介質(zhì)和/或 發(fā)酵產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，該組合物是含有一種或多種有機(jī)酸、殺滅的細(xì)胞和/或細(xì)胞碎 片以及培養(yǎng)基的細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液。
[0082]如在此使用的術(shù)語(yǔ)"發(fā)酵液"是指由細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)生、不經(jīng)歷或經(jīng)歷最低限的回收 和/或純化的制劑。例如，當(dāng)微生物培養(yǎng)物生長(zhǎng)至飽和，在碳限制條件下孵育以允許蛋白質(zhì) 合成(例如，由宿主細(xì)胞進(jìn)行酶的表達(dá))并且分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中時(shí)，產(chǎn)生發(fā)酵液。發(fā)酵液可 以包含在發(fā)酵結(jié)束時(shí)得到的發(fā)酵材料的未分級(jí)的或分級(jí)的內(nèi)容物。典型地，發(fā)酵液是未分 級(jí)的并且包括用過(guò)的培養(yǎng)基以及例如通過(guò)離心去除微生物細(xì)胞(例如，絲狀真菌細(xì)胞)之后 存在的細(xì)胞碎片。在一些實(shí)施例中，發(fā)酵液包含用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)基、胞外酶以及有活力的 和/或無(wú)活力的微生物細(xì)胞。
[0083]在一個(gè)實(shí)施例中，該發(fā)酵液配制品和細(xì)胞組合物包括第一有機(jī)酸組分(包括至少 一種1-5碳的有機(jī)酸和/或其鹽）以及第二有機(jī)酸組分(包括至少一種6碳或更多碳的有機(jī)酸 和/或其鹽）。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該第一有機(jī)酸組分是乙酸、甲酸、丙酸、其鹽，或前述兩 種或更多種的混合物;并且該第二有機(jī)酸組分是苯甲酸、環(huán)己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、 其鹽，或前述兩種或更多種的混合物。
[0084] 在一方面，該組合物包含一種或多種有機(jī)酸，并且任選地進(jìn)一步含有殺滅的細(xì)胞 和/或細(xì)胞碎片。在一個(gè)實(shí)施例中，從細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液中去除這些殺滅的細(xì)胞和/或細(xì) 胞碎片，以提供不含這些組分的組合物。
[0085] 這些發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物可以進(jìn)一步包括防腐劑和/或抗微生物(例如，抑 菌)劑，包括但不限于山梨醇、氯化鈉、山梨酸鉀、以及本領(lǐng)域中已知的其他試劑。
[0086] 該細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液或組合物可以包含在發(fā)酵結(jié)束時(shí)得到的發(fā)酵材料的未分 級(jí)的內(nèi)容物。典型地，該細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液或組合物包含用過(guò)的培養(yǎng)基以及在微生物細(xì) 胞(例如，絲狀真菌細(xì)胞)生長(zhǎng)至飽和、在碳限制條件下孵育以允許蛋白合成之后存在的細(xì) 胞碎片。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液或組合物含有用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)基、胞外酶和 殺滅的絲狀真菌細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)使細(xì)胞殺滅的全培 養(yǎng)液或組合物中存在的微生物細(xì)胞透性化和/或裂解。
[0087] 如在此描述的全培養(yǎng)液或細(xì)胞組合物典型地是液體，但是可以含有不溶性組分， 例如殺滅的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基組分和/或一種或多種不溶性酶。在一些實(shí)施例中，可以 除去不溶性組分以提供澄清的液體組合物。
[0088] 可以通過(guò)W0 90/15861或W0 2010/096673所述的方法產(chǎn)生本發(fā)明的全培養(yǎng)液配制 品和細(xì)胞組合物。
[0089] 實(shí)例
[0090] 在此我們使用常染色體復(fù)制質(zhì)粒將大基因文庫(kù)轉(zhuǎn)化到絲狀真菌中并且然后使用 雙分裂標(biāo)記物系統(tǒng)確保該文庫(kù)被位點(diǎn)特異性整合到該真菌的染色體中，由此提供穩(wěn)定的且 可比較的表達(dá)產(chǎn)量，甚至在富生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。
[0091] 來(lái)自構(gòu)巢曲霉的熟知的AMA1 (自主維持)序列使得質(zhì)粒在真菌細(xì)胞核中以附加型 復(fù)制成為可能。我們使用的質(zhì)粒包含ΑΜΑ序列以及包括基因文庫(kù)和具有啟動(dòng)子與終止子的 全長(zhǎng)pyrG基因的整合盒，所述盒在每一側(cè)分別側(cè)接niiA和niaD基因的非功能性部分，SP兩 個(gè)基因的5'端和啟動(dòng)子。
[0092] 將該質(zhì)粒文庫(kù)轉(zhuǎn)化到pyrG、niiA、niaD負(fù)型米曲霉宿主菌株(Colsl392)中并且首 先在具有尿素的基本培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。這意味著僅針對(duì)pyrG的存在（即單獨(dú)成功的轉(zhuǎn)化） 進(jìn)行選擇，因?yàn)楫?dāng)該菌株使用尿素作為氮源時(shí)，不需要功能性niiA和niaD基因。經(jīng)轉(zhuǎn)化的質(zhì) 粒將很可能以附加型存在，隨著真菌細(xì)胞生長(zhǎng)具有從細(xì)胞核中丟失的傾向。
[0093]當(dāng)鑒定出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子時(shí)，將大量的孢子涂布至補(bǔ)充有NaN03的基本培養(yǎng)基的板上。 在整合盒已經(jīng)成功地重組到宿主細(xì)胞的染色體中并在該過(guò)程中重構(gòu)niiA和niaD位點(diǎn)的情 況下，僅孢子可以發(fā)芽和存活。
[0094]基因組位點(diǎn)特異性整合確保這些轉(zhuǎn)化子是穩(wěn)定的并提供更高的且更一致的表達(dá) 水平，其進(jìn)而允許從基因文庫(kù)中選擇感興趣的單個(gè)基因。
[0095]實(shí)例1.基于ΑΜΑ的整合質(zhì)粒的構(gòu)建
[0096] 如下制備保留ΑΜΑ序列和允許整合到米曲霉(C01sl392)的染色體中的niiA和niaD 中的區(qū)域兩者的質(zhì)粒。
[0097] 將ΑΜΑ區(qū)域插入pBGMH14中從而產(chǎn)生pBAC3155。
[0098] 在PCR反應(yīng)中，使用pENI4286(即ρΕΝΙ1298的衍生物（披露于W0 2008138835中））作 為模板以及寡核苷酸291012J4和291012J5將ΑΜΑ序列分離為PCR片段：
[0099] 291012jvi4：gccgcaattgtggctgcaggtcgaccatgccg(SEQ ID N0:1)
[0100] 291012jvi5：gccgcaattgaatgataccacagtctagttgac(SEQ ID N0:2)
[0101] 將該AM序列PCR片段使用商業(yè)克隆試劑盒進(jìn)行克隆并且然后轉(zhuǎn)化到ToplO大腸桿 菌細(xì)胞中。制備DNA制劑用于克隆并且用Mfel限制性?xún)?nèi)切酶切割。也將載體pBGMH14(W0 2013/119302)用Mfel切割并且用小牛腸磷酸酶處理。將切割載體和包含ΑΜΑ的片段從瓊脂 糖凝膠純化并連接過(guò)夜。將該連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHlOb中，并且DNA制劑由所得的 大腸桿菌克隆構(gòu)成。將DNA制劑進(jìn)行測(cè)序并用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRV切割以鑒別正確的克隆。 將所得的質(zhì)粒命名為PBAC3155，參見(jiàn)圖1。
[0102] 將脂肪酶基因插入PBAC3155中從而產(chǎn)生pBGMH0021。
[0103] 質(zhì)粒pBAC3155包含PacI/Nt.BbvCI尿嘧啶特異性切除試劑或USER?盒（漢森 (Hansen)等人，2011，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl .Environ.Microbiol · )77(9) :3044-51)， 該盒在一側(cè)側(cè)接米曲霉niaD基因的一部分并且在另一側(cè)側(cè)接米曲霉niiA基因的一部分 (USER?商標(biāo)屬于新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(New England Biolabs)，美國(guó)）。尿嘧啶特異性切除 酶在尿嘧啶位置處產(chǎn)生單核苷酸缺口。該酶是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂 解酶內(nèi)切核酸酶VIII的混合物。UDG催化尿嘧啶堿基的切除，從而形成無(wú)堿基(無(wú)嘧啶）位 點(diǎn)，而保持磷酸二酯骨架的完整。內(nèi)切核酸酶VIII的裂解酶活性在無(wú)堿基位點(diǎn)的3'和5'側(cè) 破壞磷酸二酯骨架，這樣使得釋放無(wú)堿基的脫氧核糖?？梢杂肞acI和Nt.BbvCI使PPacI/ Nt.BbvCI USER?盒線性化;然后具有相容的突出端的PCR產(chǎn)物可以克隆到這個(gè)位點(diǎn)。
[0104] 我們將包含來(lái)自米曲霉的N A 2 t p i啟動(dòng)子、編碼疏棉狀嗜熱絲孢菌 (T. lanuginosus)脂肪酶的基因以及轉(zhuǎn)錄終止子的片段克隆到Pac Ι/Nt.BbvCI USER?盒 中。使用兩種包含尿嘧啶的引物BGMH155和BGMH156將該片段從作為模板的pENI4286 (pENI 1298的衍生物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0105] BGMH155：ggacttaauagcgagagagttgaacctggacg(SEQ ID NO:3)
[0106] BGMH156:gggtttaaucagatggcccgagaggactattccga(SEQ ID N0:4)
[0107] 將加下劃線的序列用于USER?輔助克隆到PBAC315 5中的Pac I /Nt. BbvC I USER?盒 中。
[0108] 最終體積為50μ1的擴(kuò)增反應(yīng)由以下組成：100ng的每種引物、模板DNA(10ng PENI4286)、1ΧΡ/^Τηγ/)〇_? C、反應(yīng)緩沖液、2.5μ1 的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的共混物（各以 10mM)以及2.5單位的P/wrwr/)〇_?Cx熱啟動(dòng)DNA聚合酶。將PCR反應(yīng)編程為：1個(gè)循環(huán)，在95°C 下持續(xù)2分鐘;40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在95°C下持續(xù)30秒、55°C下持續(xù)30秒、以及72°C下持續(xù)4 分鐘；以及最終延長(zhǎng)，在72 °C下持續(xù)10分鐘。
[0109] 在PCR擴(kuò)增之后，添加5μ1的10X NEBuffer 4和20單位的Dpn I并且在37°C下孵育1 小時(shí)。在80°C下持續(xù)20分鐘使Dpn I失活。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，并且將50ng的PCR產(chǎn)物、 10ng的PacI/Nt.BbvCI消化的pBAC3155以及1單位的USER?酶以10μ1的總體積在37°C下孵育 20分鐘，隨后在25°C下孵育20分鐘。接著將10μ1轉(zhuǎn)化到0NESHOT?T0P10感受態(tài)細(xì)胞中。將 所得的質(zhì)粒命名為pBGMHOO 21，參見(jiàn)圖2。
[0110] 實(shí)例2.用pBGMH0021對(duì)絲狀真菌菌株C0LS1392進(jìn)行轉(zhuǎn)化
[0111] 將質(zhì)粒PBGMH0021轉(zhuǎn)化到⑶LS1392中，將其涂布在10mM尿素板上;選擇轉(zhuǎn)化子，即 菌株BGMH1000,其中pBGMH0021作為附加型質(zhì)粒存在。
[0112] 將多個(gè)轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到具有10mM尿素的新板上，并且六天后，通過(guò)向每個(gè)板中添加 l〇ml的水來(lái)收獲孢子。將lml孢子(孢子量/ml:約l，5x 107個(gè))轉(zhuǎn)移到含有NaN03的板上。將這 些板在37°C下孵育六天，從而提供10-100個(gè)菌落/板。
[0113] 因?yàn)楫?dāng)沒(méi)有尿苷存在于這些板中時(shí)，pyrG、niiA和niaD對(duì)于菌株在作為僅有的氮 源的NaN03上生長(zhǎng)而言都需要是功能性的，所以出現(xiàn)的菌落必須已經(jīng)修復(fù)了niiA與niaD兩 者并且已經(jīng)引入了pyrG基因。要想讓這成為可能，同源重組必須已經(jīng)在niiA與niaD兩者中 發(fā)生，在該過(guò)程中重構(gòu)兩個(gè)基因座。將一個(gè)菌株選擇為BGMH1001。
[0?14]最后，在包含尿苷的板上選擇pyrG-突變型菌株，即Cols 1300。
[0115]
[0116] 實(shí)例3.來(lái)自附加型與整合型表達(dá)盒的脂肪酶產(chǎn)量的比較
[0117] 使在實(shí)例2中構(gòu)建的菌株在200μ1 YPM-培養(yǎng)基(+尿素）中的MTP中在34°C下生長(zhǎng)3 天。將來(lái)自附加型基于AMA1質(zhì)粒攜帶的表達(dá)盒(菌株BGMH1000)和來(lái)自染色體位點(diǎn)特異性整 合的表達(dá)盒(菌株BGMH1001/C0LS1300)的柔毛腐質(zhì)霉脂肪酶的表達(dá)水平通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行 比較。
[0118] SDS-PAGE凝膠的照片示于圖3中。通過(guò)箭頭指示脂肪酶條帶；泳道1-3示出了附加 型基于AMA1質(zhì)粒的表達(dá)，然而泳道4-6示出了通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的染色體整合盒表達(dá)的顯著 更粗的脂肪酶條帶。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中對(duì)基因文庫(kù)進(jìn)行位點(diǎn)特異性染色體整合的方法，該 方法包括以下步驟： a) 提供一種多核苷酸構(gòu)建體，該多核苷酸構(gòu)建體包括自主復(fù)制序列和整合盒，所述盒 包括該基因文庫(kù)和第一選擇性標(biāo)記，其中該盒在一側(cè)側(cè)接第二選擇性標(biāo)記的非功能性部分 并且在另一側(cè)側(cè)接第三選擇性標(biāo)記的非功能性部分； b) 提供一種絲狀真菌宿主細(xì)胞，該絲狀真菌宿主細(xì)胞在其染色體中包括該第二選擇性 標(biāo)記的非功能性部分以及該第三選擇性標(biāo)記的非功能性部分，其中該第二和第三選擇性標(biāo) 記的染色體非功能性部分與該多核苷酸構(gòu)建體中的對(duì)應(yīng)的非功能性部分之間的正確重組 將產(chǎn)生第二和第三功能性染色體選擇性標(biāo)記； c) 用該多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化該宿主細(xì)胞并且針對(duì)該第一選擇性標(biāo)記在該宿主細(xì)胞中 的存在進(jìn)行選擇，由此分離出被成功轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;并且然后 d) 針對(duì)第二和第三功能性選擇性標(biāo)記的存在進(jìn)行選擇，由此獲得具有該基因文庫(kù)的正 確位點(diǎn)特異性染色體整合的宿主細(xì)胞。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中該基因文庫(kù)包括編碼感興趣的親本多肽的基因的修 飾的、突變的或變體版本或由其組成;優(yōu)選地，該感興趣的親本多肽是一種酶;更優(yōu)選地，其 是半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖 酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移 酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、 變位酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中該絲狀真菌宿主細(xì)胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗 霉屬、煙管霉屬、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬、隱球菌屬、線黑粉菌科、鐮孢屬、 腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新美鞭菌屬、鏈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌 屬、射脈菌屬、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬、裂褶菌屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉 屬、栓菌屬或木霉屬細(xì)胞。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中該絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日 本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌、干擬蠟菌、卡內(nèi)基擬蠟菌、淺黃擬蠟菌、潘 諾希塔擬蠟菌、環(huán)帶擬蠟菌、微紅擬蠟菌、蟲(chóng)擬蠟菌、狹邊金孢子菌、嗜角質(zhì)金孢子菌、盧克 諾文思金孢子菌、糞狀金孢子菌、租金孢子菌、昆士蘭金孢子菌、熱帶金孢子菌、褐薄金孢子 菌、灰蓋鬼傘、毛革蓋菌、桿孢狀鐮孢、谷類(lèi)鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、 異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮 孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀 絲霉、粗糙鏈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、射脈菌、刺芹側(cè)耳、土生梭孢殼霉、長(zhǎng)絨毛栓菌、 變色栓菌、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉細(xì)胞。5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中該絲狀真菌宿主細(xì)胞具有增加的同源重 組與非同源重組(HR/NHR)比率;優(yōu)選地，非同源末端連接(NHEJ)途徑的一種或多種組分被 抑制或者同源重組(HR)途徑的一種或多種組分被過(guò)表達(dá);最優(yōu)選地，酵母KU70基因的等效 物被失活。6. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中該自主復(fù)制序列是來(lái)自構(gòu)巢曲霉的AMA1 序列或其功能衍生物。7. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中這些選擇性標(biāo)記是pyrG、niiA和niaD。8. -種用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中對(duì)基因文庫(kù)進(jìn)行位點(diǎn)特異性染色體整合的多核苷 酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括自主復(fù)制序列和整合盒，所述盒包括該基因文庫(kù)和第一選擇性 標(biāo)記，其中該盒在一側(cè)側(cè)接第二選擇性標(biāo)記的非功能性部分并且在另一側(cè)側(cè)接第三選擇性 標(biāo)記的非功能性部分。9. 如權(quán)利要求8所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中該基因文庫(kù)包括編碼感興趣的親本多肽 的基因的修飾的、突變的或變體版本或由其組成;優(yōu)選地，該感興趣的親本多肽是一種酶； 更優(yōu)選地，其是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊 精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、 甘露糖苷酶、變位酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、 核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。10. 如權(quán)利要求8或9所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中該自主復(fù)制序列是來(lái)自構(gòu)巢曲霉的 ΑΜΑ1序列或其功能衍生物。11. 如權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中這些選擇性標(biāo)記是pyrG、 niiA和niaD〇
【文檔編號(hào)】C12N15/90GK105992821SQ201480065689
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2014年12月3日
【發(fā)明人】B·G·漢森, C·L·奧爾森, J·維恩
【申請(qǐng)人】諾維信公司