專利名稱：金耳與寄主真菌粗毛韌革菌的dna分子鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌菌種的DNA分子鑒定方法，更具體地說涉及一種金耳與寄主真菌 粗毛韌革菌的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列的分子鑒定方法。
背景技術(shù)：
金耳7>>ewe//a做ra"Z/a/6a Bandoni et Zang野生分布稀有，為中國特有種。由于生活的特 殊性決定了金耳菌必須寄生于粗毛韌革菌(&ereww; ir幼加/M(Willd.)Fr.)表面，共同形成異質(zhì) 復(fù)合體，因此少量寄主真菌的存在是金耳菌賴以正常生長發(fā)育的基礎(chǔ)。由于粗毛韌革菌具有 強大的分解和利用木質(zhì)纖維素等碳水化合物的能力，在金耳的生長發(fā)育史中極易處于生長優(yōu) 勢，采用傳統(tǒng)的營養(yǎng)體繁殖手段得到的往往是粗毛韌革菌的菌絲培養(yǎng)物，但被誤認為是金耳 菌絲，采用這種粗毛韌革菌培養(yǎng)物進行深層發(fā)酵難以獲得真正意義上的金耳產(chǎn)物。為了克服 這種技術(shù)弊病，中國專利(ZL200410022376.9)報道用金耳栽培種的制備方法，將栽培的金 耳的酵母狀孢子菌種和寄主真菌粗毛韌革菌分別培養(yǎng)后，按比例混合接種生產(chǎn)金耳子實體(即 擔子果)。這就要求培養(yǎng)前須對培養(yǎng)物做出準確鑒定，但單純采用形態(tài)學特征還不能判斷菌種 的準確性。中國專利(ZL2004I0022377.3)公開了一種金耳酵母狀孢子的培養(yǎng)方法，以克服 金耳子實體產(chǎn)量低的弱點，以尋找金耳的可替代資源，該專利也存在金耳的酵母狀孢子菌種 的鑒定問題。
基于DNA序列的分子標記技術(shù)，能達到準確鑒定金耳菌種的目的。核糖體DNA在細胞 中以一種協(xié)同方式進化，在個體和群體內(nèi)有著較好的均質(zhì)性，因此個體的核糖體DNA通常 具有種代表性。真菌核內(nèi)一個典型的核糖體DNA重復(fù)單位約為8 12kb。不同的選擇壓力作 用于核糖體DNA區(qū)域，造成3種核糖體基因及間隔區(qū)有不同的進化速度，有的序列比較保 守，有的序列進化比較快。核糖體大亞基基因是一段由保守區(qū)與高變區(qū)相互鑲嵌的DNA片 段，內(nèi)部還存在一些進化速率相對較快的變異區(qū)域，如Dl、 D2區(qū)等，這些區(qū)域的鑒定適合 從種到屬的分類鑒定，是很好的分子標記，也就是金耳菌與粗毛韌革菌的核基因組核糖體大 亞基基因Dl/D2區(qū)序列是不相同的。以核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)基因序列分析和分子探針 形式應(yīng)用于金耳菌種和寄主菌種的鑒定中，對菌種的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列進行測 序，獲得其序列，就可通過對比核糖體大亞基基因D1/D2區(qū)序列來達到準確鑒定金耳菌種和 寄主真菌粗毛韌革菌種的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足與問題，提供了一種金耳與寄主真菌粗毛韌革菌的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列的分子鑒定方法。
為達到本發(fā)明的目的，本發(fā)明人從金耳主產(chǎn)區(qū)采集了數(shù)個金耳樣品，所有金耳樣品均經(jīng) 過真菌分類專家鑒定。所測的金耳樣品和組成金耳子實體的寄主真菌粗毛韌革菌的核糖體大 亞基基因Dl/D2區(qū)序列見序列表，以測得的序列作為菌種鑒定的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū) 序列，金耳的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列長度為638bp，如SEQIDNO.l所示；寄主真 菌粗毛韌革菌的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列長度為607bp，如SEQ ID N0.2所示。金耳 核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)G+C含量為49%,寄主真菌粗毛韌革菌核糖體大亞基基因Dl/D2 區(qū)G+C含量為52%。
本發(fā)明首先建立了一套金耳及寄主真菌粗毛韌革菌的高質(zhì)量基因組DNA的制備方法，然 后對其核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列進行了測序，獲得了核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列， 最終可通過對比其核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列來鑒定金耳菌種和寄主真菌粗毛韌革菌 種，其鑒定方法主要包括以下步驟
(1) 提取待鑒定金耳子實體的基因組DNA;
(2) 以提取得到的基因組DNA樣品為模板，用針對核糖體大亞基基因D1/D2區(qū)的引物進行聚 合酶鏈式反應(yīng)擴增得到金耳和寄主真菌粗毛韌革菌的核糖體大亞基基因Dl/D2片段產(chǎn)物，擴 增的正向引物Pl為5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，反向引物P2為 5，-GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 3，；將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳；
(3) 對每一條凝膠電泳條帶進行害鵬回收純化，每樣平行重復(fù)5次以上，另設(shè)雙蒸水的聚合酶 鏈式反應(yīng)為空白對照組；
(4) 純化后的DNA進行序列測定，得到金耳的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列和組成金耳子實 體的寄主真菌粗毛韌革菌的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列，其中測序引物是與聚合酶鏈式反 應(yīng)所用引物相同的P1和P2;所有序列至少經(jīng)過正反兩次重復(fù)測定，以保證序列的準確性； 建立的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)的全序列，見序列表；
(5) 將待鑒定菌種的菌體按上述步驟進行分析，得到待鑒定菌種的核糖體大亞基基因D1/D2區(qū)序 列，將此序列與序列表中已經(jīng)確定的金耳或寄主真菌粗毛韌革菌的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū) 序列進行比較判定，得到分析鑒定結(jié)果，判斷是否為金耳菌種或寄主真菌粗毛韌革菌菌種。
本發(fā)明的金耳與寄主真菌粗毛韌革菌的DNA分子鑒定方法中，待鑒定品種的基因組DNA 提取純化的方法，其步驟為取菌體材料加入無菌研缽中，同時加入用pH9.0的0.15mol/L三 羥甲基氨基甲烷溶液7mL與pH為8.0的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液8mL混合后定容至 100mL配制而成的提取緩沖液，迅速徹底研磨混勻，取研磨后的液體加入無菌離心管中，再 依次加入質(zhì)量百分濃度為10%的十二烷基磺酸鈉溶液和氯化節(jié)試劑，混勻，50'C水浴處理，加入等體積的pH為5.0的3mol/L醋酸鈉溶液混勻，冰水浴處理，離心取上清，加入等體積 的無水乙醇析出DNA沉淀，離心棄去無水乙醇，加入70-75%的乙醇洗滌沉淀，離心棄去乙 醇，揮干乙醇用無菌水溶解，瓊脂糖凝膠電泳分析得到基因組DNA樣品。
本發(fā)明的金耳與寄主真菌粗毛韌革菌的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列的分子鑒定方法 中，其步驟(2)中所述的引物為寡核苷酸，所述的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列的聚合酶 鏈式反應(yīng)的反應(yīng)條件如下聚合酶鏈式反應(yīng)的50pL反應(yīng)液含5pL的10x buffer(pH為8.3)、 0.2 mmol/L四種單核苷酸、0.2 nmol/L每種引物、5 U爾LDNA聚合酶0.25 以及100-500 ng DNA模板，其所述核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列的聚合酶鏈式反應(yīng)的反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95°C, 預(yù)變性5分鐘，然后按9fC變性1分鐘，50-60'C退火1分鐘，72'C延伸20秒鐘，循環(huán)36次， 最后在72'C延伸8分鐘，在4'C終止反應(yīng)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比還具有以下有益效果
1、 本發(fā)明建立了一套快速、有效的金耳和寄主真菌粗毛韌革菌高質(zhì)量DNA的提取方法。
2、 本發(fā)明提供了金耳和寄主真菌粗毛韌革菌的核糖體大亞基基因D1/D2區(qū)序列，利用 它們可以對人工培養(yǎng)的金耳菌種和寄主真菌粗毛韌革菌種進行準確鑒定。
3、 本發(fā)明的鑒定方法可以直接用于檢測菌種的序列差異，以準確區(qū)分和鑒定金耳菌種的 真實性和純度，為品系鑒定、品種保護、菌種質(zhì)量控制、有效菌種繁育及金耳的人工栽培提 供可靠技術(shù)。
具體實施例方式
下面提供本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明并不僅僅限定于這些實施例。 實施例l金耳7>ewe//a awra^a/6a Bandoni et Zang的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列的分子 鑒定方法
本實施例取金耳7>ewe//a awrawto/k Bandoni et Zang菌種CGMCC0179 (中國普通微生 物菌種保藏管理中心)，通過以下步驟進行鑒定
(1)基因組DNA的提取，具體方法如下
無菌收集人工培養(yǎng)的待鑒定孢子菌種的培養(yǎng)3天的菌體0.1 g置于已滅菌的研缽中，加 0.5-1 mL提取緩沖液(提取緩沖液為pH9.0的0.15 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液7mL與pH為 8.0的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液8mL混合后定容至lOOmL配制而成)，研磨混勻；將勻 漿后的液體移入無菌Eppendorf管中，力卩入0.1-0.2 mL質(zhì)量百分濃度為10%的十二烷基磺酸 鈉溶液和0.3-0.6 mL氯化芐試劑，充分混勻，5(TC保溫1-2小時；加0.3-0.6 mL 3 mol/L NaOAc
(pH5.0)混勻，冰水浴15-20 min， 6000 r/min室溫離心15-20 min;取上清加等體積無水乙 醇室溫沉淀20-50 min，去上清，10000 r/min室溫離心10-15 min，沉淀用70 °/。乙醇洗一次，風干水溶，4'C保存；1-1.5 。/。Agrose瓊脂糖凝膠電泳(100 V電壓下電泳30-40min)檢測純 度和分子量范圍；提取過程中均以無菌水作空白提取對照，以防止提取和擴增過程中外源 DNA的污染。
(2) 以提取得到的待鑒定孢子菌種的基因組DNA樣品為模板，用針對核糖體大亞基基因Dl/D2 區(qū)的引物分別進行聚合酶鏈式反應(yīng)擴增得到待鑒定孢子菌種核糖體大亞基基因Dl/D2片段產(chǎn) 物，將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳；
其中聚合酶鏈式反應(yīng)擴增核基因組DNA核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)，正向引物為Pl: 5'"GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3';反向引物為P2: 5'~GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。
聚合酶鏈式反應(yīng)的反應(yīng)體系采用50 nL內(nèi)含5 nL的10xbuffer (pH為8.3) ， 0.2 mmol/L 四種單核苷酸，0.2 pmol/L每種引物，5U/piLDNA聚合酶0.25 jiL以及100-500 ng DNA模板， 聚合酶鏈式反應(yīng)在TGradient thermocycler (Whatman BiometraTM)上完成。
聚合酶鏈式反應(yīng)的反應(yīng)條件為95'C預(yù)變性5分鐘，然后按94t:變性1分鐘，50-6(TC退 火1分鐘，72'C延伸20秒鐘，循環(huán)36次，最后在72'C延伸8分鐘，在4'C終止反應(yīng)；每樣 平行重復(fù)5次以上，每次實驗設(shè)陰性對照(不加DNA模板)用于排除非特異的聚合酶鏈式 反應(yīng)產(chǎn)物；擴增產(chǎn)物用1-1.5% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳鑒定(Marker分子量范圍100-1200 bp)。
(3) 對得到的所有凝膠電泳條帶分別進行害帔回收純化，每樣平行重復(fù)5次以上，另設(shè)聚合酶 鏈式反應(yīng)無菌水空白對照組。
(4) 純化后的DNA進行序列測定，確立并得到的待鑒定菌種的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列， 其中測序引物采用聚合酶鏈式反應(yīng)擴增使用的引物Pl和P2，正向引物為Pl: 5，-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3,，反向引物為P2: 5，-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3，；
測序引物與聚合酶鏈式反應(yīng)所用引物相同，所有序列至少經(jīng)過正反兩次重復(fù)測定，以保 證序列的準確性。
(5) 將得到的待鑒定的菌種的核糖體大亞基基因D1/D2區(qū)序列輸入計算機后，用DNAStar軟 件包中的Editseq和Seqman進行編輯，用Megalign中Clustal W方法，與已經(jīng)確定的金耳的 核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列進行比對判定，通過人工比對也可得出同樣的結(jié)論，比對后序列 相同可判定該菌種為金耳7Veme〃fl awra"ria/Z a Bandoni et Zang菌種。
實施例2寄主真菌粗毛韌革菌/ >Www (Willd.)Fr.的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列
的分子鑒定方法
本實施例取菌體形態(tài)為菌絲狀的待鑒定菌種，通過以下步驟進行鑒定 (1)基因組DNA的提取，具體方法如下
無菌收集人工培養(yǎng)的待鑒定菌絲菌種的培養(yǎng)5-7天的菌體0.1 g置于已滅菌的研缽中，加0.5-1 mL提取緩沖液(提取緩沖液為pH9.0的0.15 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液7mL與pH為 8.0的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液8mL混合后定容至100mL配制而成)，研磨混勻；將勻 漿后的液體移入無菌Eppendorf管中，加入0.1-0.2 mL質(zhì)量百分濃度為10%的十二烷基磺酸 鈉溶液和0.3-0.6 mL氯化芐試劑，充分混勻，50 "C保溫1-2小時；加0.3-0.6 mL 3 mol/LNaOAc (pH5.0)混勻，冰水浴15-20 min， 6000 r/min室溫離心15-20 min;取上清加等體積無水乙 醇室溫沉淀20-50 min，去上清，10000 r/min室溫離心10-15 min，沉淀用70%乙醇洗一次， 風干水溶，4。C保存；1-1.5 。/。Agrose瓊脂糖凝膠電泳(100 V電壓下電泳30-40min)檢測純 度和分子量范圍；提取過程中均以無菌水作空白提取對照，以防止提取和擴增過程中外源 DNA的污染。
(2) 以提取得至啲待鑒定菌絲菌種的基因組DNA樣品為模板，用針對核糖體大亞基基因D1/D2 區(qū)的引物分別進行聚合酶鏈式反應(yīng)擴增得到待鑒定菌絲菌種核糖體大亞基基因Dl/D2片段產(chǎn) 物，將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳；
其中聚合酶鏈式反應(yīng)擴增核基因組DNA核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)，正向引物為Pl: 5'~GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3，；反向引物為P2: 5'~GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 3'。
聚合酶鏈式反應(yīng)的反應(yīng)體系采用50 fiL內(nèi)含5pL的10x buffer (pH為8.3) ， 0.2 mmol/L 四種單核苷酸，0.2 pmol/L每種引物，5U/jaLDNA聚合酶0.25pL以及100-500ng DNA模板；聚 合酶鏈式反應(yīng)在TGradient thermocycler (Whatman BiometraTM)上完成。
聚合酶鏈式反應(yīng)的反應(yīng)條件為95'C預(yù)變性5分鐘，然后按94'C變性1分鐘，50-6(TC退 火1分鐘，72'C延伸20秒鐘，循環(huán)36次，最后在72'C延伸8分鐘，在4'C終止反應(yīng)；每樣 平行重復(fù)5次以上，每次實驗設(shè)陰性對照(不加DNA模板)用于排除非特異的聚合酶鏈式 反應(yīng)產(chǎn)物；擴增產(chǎn)物用1-1.5% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳鑒定(Marker分子量范圍100-1200 bp)。
(3) 對得到的所有凝膠電泳條帶分別進行割膠回收純化，每樣平行重復(fù)5次以上，另設(shè)聚合酶 鏈式反應(yīng)無菌水空白對照組。
(4) 純化后的DNA進行序列測定，確立并得到的待鑒定菌種的核糖體大亞基基因D1/D2 區(qū)序列，其中測序引物采用聚合酶鏈式反應(yīng)擴增使用的引物P1和P2，正向引物為P1: 5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，反向引物為P2: 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3';
測序引物與聚合酶鏈式反應(yīng)所用引物相同，所有序列至少經(jīng)過正反兩次重復(fù)測定，以保 證序列的準確性。
(5) 將所得待鑒定菌種的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列輸入計算機后，用DNAStar軟件包 中的Editseq和Seqman進行編輯，用Megalign中Clustal W方法，與已經(jīng)確定的金耳寄主真 菌粗毛韌革菌的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列進行比對判定，通過人工比對也可得出同樣的結(jié)論，比對后序列相同可判定待鑒定菌種為寄主真菌粗毛韌革菌Ww^wm (WiUd.)Fr.菌種。 實施例3
本實施例取菌體形態(tài)為酵母狀的待鑒定菌種，通過以下步驟進行鑒定
(1) 基因組DNA的提取，具體方法如下 無菌收集待鑒定的孢子菌種的培養(yǎng)3天的菌體0.1 g置于已滅菌的研缽中，加0.5-1 mL
提取緩沖液(提取緩沖液為pH9.0的0.15 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液7mL與pH為8.0的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液8mL混合后定容至100mL配制而成)，研磨混勻；將勻漿后的液體 移入無菌Eppendorf管中，加入0.1-0.2 mL質(zhì)量百分濃度為10%的十二垸基磺酸鈉溶液和 0.3-0.6 mL氯化節(jié)試劑，充分混勻，50 。C保溫1-2小時；加0.3-0.6 mL 3 mol/LNaOAc (pH 5.0) 混勻，冰水浴15-20 min, 6000 r/min室溫離心15-20 min;取上清加等體積無水乙醇室溫沉淀 20-50 min，去上清，10000 r/min室溫離心10-15 min，沉淀用70%乙醇洗一次，風干水溶，4°C 保存；1-1.5 。/。Agrose瓊脂糖凝膠電泳(100V電壓下電泳30-40min)檢測純度和分子量范圍； 提取過程中均以無菌水作空白提取對照，以防止提取和擴增過程中外源DNA的污染。
(2) 以提取得到的待鑒定孢子菌種的基因組DNA樣品為模板，用針對核糖體大亞基基因D1/D2 區(qū)的引物分別進行聚合酶鏈式反應(yīng)擴增得到待鑒定孢子菌種核糖體大亞基基因Dl/D2片段產(chǎn) 物，將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳；
其中聚合酶鏈式反應(yīng)擴增核基因組DNA核糖體大亞基基因D1/D2區(qū)，正向引物為P1: 5'~GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3';反向引物為P2: 5'~GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。
聚合酶鏈式反應(yīng)的反應(yīng)體系采用50jiL內(nèi)含5[iL的10x buffer (pH為8.3) , 0.2 mmol/L 四種單核苷酸，0.2 nmol/L每種引物，5U/nLDNA聚合酶0.25pL以及100-500ng DNA模板，聚 合酶鏈式反應(yīng)在TGradient the皿ocycler (Whatman BiometraTM)上完成。
聚合酶鏈式反應(yīng)的反應(yīng)條件為95'C預(yù)變性5分鐘，然后按94'C變性1分鐘，50-6(TC退 火1分鐘，72'C延伸20秒鐘，循環(huán)36次，最后在72'C延伸8分鐘，在4'C終止反應(yīng)；每樣 平行重復(fù)5次以上，每次實驗設(shè)陰性對照(不加DNA模板)用于排除非特異的聚合酶鏈式 反應(yīng)產(chǎn)物；擴增產(chǎn)物用1-1.5% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳鑒定(Marker分子量范圍100-1200 bp)。
(3) 對得到的所有凝膠電泳條帶分別進行割膠回收純化，每樣平行重復(fù)5次以上，另設(shè)聚合酶 鏈式反應(yīng)無菌水空白對照組。
(4) 純化后的DNA進行序列測定，確立并得到的待鑒定菌種的核糖體大亞基基因Dl/D2區(qū)序列， 其中測序引物采用聚合酶鏈式反應(yīng)擴增使用的引物Pl和P2，正向引物為Pl: 5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，反向引物為P2: 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3';
測序引物與聚合酶鏈式反應(yīng)所用引物相同，所有序列至少經(jīng)過正反兩次重復(fù)測定，以保證序列的準確性。
(5)將得到的待鑒定的菌種的核糖體大亞基基因D1/D2區(qū)序列輸入計算機后，用DNAStar軟 件包中的Editseq和Seqman進行編輯，用Megalign中Clustal W方法，與已經(jīng)確定的金耳的 核糖體大亞基基因D1/D2區(qū)序列進行比對判定，通過人工比對也可得出同樣的結(jié)論，比對后序列 相同可判定該菌種為金耳做ra"Ha/6fl Bandoni et Zang菌種。卿U跳E LISTING
〈110〉江蘇同源堂生物工程有限公司
〈120〉金耳與寄主真菌粗毛韌革菌的DNA分子鑒定方法
<腸2
〈210>1
<211>638
〈212〉廳
<213>金耳(7)r附e〃a fl"n2"rt'a/6a Bandoni et Zang)
<400>1
ttgcatatca3tasgcggagtcccctagtascggcgsgtg60
3gCtC333tttgtaatctggC3tcctc3gggtgtccgsgttgtaatctac120
agasgtgttttccgtgccgg3ccgtgtccasgtcccttgg180
gac33tcccg七3Cttg3C3Cgatgaccggtgctctgtgat3C3Ctttct3cg3gtcg3gt240
tgtttggg33tgcsgctcaa33tgggtggtgwbtccatctsttggcgsg300
cgaacaagtaccgtgagggsgcactttgga33g3g3gtt3360
gaasttgttggattgaagtcsgtcgtgscctctggattca420
gccgactctgtcggtgtatttcctctggtcgggtcs3C3tcsgtttggstcgstgg3t33480
ggatggtggg33cgtggc3cctccgggtgtgttatagccc3ccgtcgc3tgcstcggccc540
3g3ctg3gg33tgcsgctcgccttt3tggccggggttcgcccacgttcgagcttsggstg600
ttgacataatggcttt3saicgscccgtctt638
〈210〉2
〈211〉607
〈212〉DNA
〈213〉粗毛韌革菌(S""wm Wra^wm (Willd.)Fr.)
<400〉2
CCCt3gt33Ctgcgagtgaagcgggaa33gCtC333ttt3aaatctggcggtcttctggc60
cgtccgsgttgtagtctggag33gcgttttccgcgttggsccgtgt3C33gtttcctgg3120
acggagcgtcatagagggtgagaatcccgtctttgsc3cgg3tccc33tgctttgtg3tg180
cgctctca33gsgtcgagttgtttggga3tgcagctcaaaatgggtggtg33ttCC3tCt240
sttggcgsgsgsccgstsgcga3C3sgtaccgtgsgggs3300
cactttggaaagagagttaascagtacgtg333ttgttgscttgs3gtc3360
gtcgcgtcggccggg3Ctcsgccttgcstccgcttggtgtsctttccggtcgscgggccs420
gc3tc3gttttgsccgcgag3t333ggcggagggaatgtggctctctcgggagtgttata480
gcccttcgtcagatgtcgcggttgggactgaggaactcagcscgccttt3tggccggggc540
tcgcccacgtscgtgcttsggatgctggcgt33tggctttaaacgacccgtcttgaaaca600
cgg3cc權(quán)利要求
1、一種金耳與寄主真菌粗毛韌革菌的核糖體大亞基基因D1/D2區(qū)序列，其特征在于，所述的金耳的核糖體大亞基基因D1/D2區(qū)，具有SEQ ID NO.1所示的序列；寄主真菌粗毛韌革菌的核糖體大亞基基因D1/D2區(qū)，具有SEQ ID NO.2所示的序列。
2、 一種利用權(quán)利要求1所述的序列鑒定金耳與寄主真菌粗毛扨革菌的方法，包括以下步驟(1) 提取待鑒定人工培養(yǎng)菌種的菌體的基因組DNA;(2) 以步驟(1)提取得到的DNA樣品為模板，用針對核糖體大亞基基因D1/D2區(qū)的引物 進行聚合酶鏈式反應(yīng)擴增得到待鑒定菌種的核糖體大亞基基因Dl/D2片段產(chǎn)物，將產(chǎn)物進行 瓊脂糖凝膠電泳純化；(3) 將步驟(2)純化后的DNA進行序列測定，獲得待鑒定菌種的核糖體大亞基基因Dl/D2 區(qū)序列；(4) 將步驟(3)得到的序列與SEQIDNO.l和SEQ ID N0.2的序列分別進行比較，判斷是 否為金耳菌種或寄主真菌粗毛韌革菌菌種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種金耳與寄主真菌粗毛韌革菌的核糖體大亞基基因D1/D2區(qū)序列的分子鑒定方法。金耳的核糖體大亞基基因序列如SEQ ID NO.1所示；寄主真菌粗毛韌革菌的核糖體大亞基基因D1/D2區(qū)序列如SEQ ID NO.2所示。所說的鑒定方法是提取得到待鑒定菌種的核糖體大亞基基因D1/D2區(qū)序列，將此序列與SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列進行比較判定，判斷是否為金耳菌種或寄主真菌粗毛韌革菌菌種。利用本發(fā)明方法可以對人工培養(yǎng)的金耳菌種和寄主真菌粗毛韌革菌種進行準確鑒定。為品系鑒定、品種保護、菌種質(zhì)量控制、有效菌種繁育及金耳的人工栽培提供可靠技術(shù)。
文檔編號C12Q1/68GK101314795SQ20081012443
公開日2008年12月3日 申請日期2008年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月16日
發(fā)明者俞建國, 劉春卉, 瞿偉箐, 馬維新 申請人:江蘇同源堂生物工程有限公司