甘肅棘豆產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌Undifilum oxytropis的定向分離及鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種甘肅棘豆產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌Undifilumoxytropis的定向分離及鑒定方法。從甘肅棘豆中分離內(nèi)生真菌Undifilumoxytropis時(shí)，不可避免的會(huì)分理出其他種屬的菌株，影響分離效率。本發(fā)明用蒸餾水、乙醇、無(wú)菌水和次氯酸鈉依次清洗甘肅棘豆的莖和成熟種子，再將組織剪成小塊置于PDA平板上，平板中充滿CO2并用保鮮膜密封，光照下室溫培養(yǎng)，待切口處長(zhǎng)出菌絲后，挑取頂端菌絲轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基上純化，刮取菌絲，隨后將菌株接種至試管斜面冷藏；提取分離菌株的基因組DNA，在GeneBank中進(jìn)行序列比對(duì)。本發(fā)明從瘋草中只分離得到一種菌，減少其他種屬內(nèi)生真菌的干擾，方法簡(jiǎn)便易行，保存過(guò)程中菌株不易發(fā)生變異或菌株活性減低。
【專利說(shuō)明】甘肅棘豆產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌Undifi Ium oxytropis的定
向分離及鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種甘肅棘豆產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌Undifilum oxytropis的定向分離及鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]內(nèi)生真菌(fungal endophyte)是指生活史或其中某一段時(shí)期生活在活的植物組織內(nèi)，對(duì)植物組織不引起明顯病害癥狀的真菌，包括腐生真菌、潛伏性病原真菌和菌根菌。目前研究發(fā)現(xiàn)，瘋草毒素與瘋草內(nèi)生真菌關(guān)系密切。一方面瘋草內(nèi)生真菌協(xié)助瘋草產(chǎn)生毒素，從而增強(qiáng)了瘋草的毒性，減少了動(dòng)物對(duì)瘋草的采食；另一方面，內(nèi)生真菌可以提高瘋草的抗逆性，這使得瘋草在干旱半干旱的草原上生命力顯得極其頑強(qiáng)，加大了防治的難度。
[0003]最初，人們認(rèn)為瘋草毒素苦馬豆素是瘋草在生長(zhǎng)過(guò)程中自身合成的代謝產(chǎn)物，但深入研究發(fā)現(xiàn)，苦馬豆素是由瘋草攜帶的內(nèi)生真菌合成的。人們對(duì)瘋草中苦馬豆素的來(lái)源認(rèn)識(shí)有了更新，認(rèn)為瘋草內(nèi)苦馬豆素的含量與內(nèi)生真菌的種類、數(shù)量及定植部位等關(guān)系密切。現(xiàn)已證實(shí)，能合成苦馬豆素的真菌主要有豆類絲核菌屬Ieguminicola')^金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae )和埃里磚格孢屬iEmbelIisia，現(xiàn)已更名為
尤其是內(nèi)生真菌Undifilum oxytropis合成力最優(yōu)。
[0004]在對(duì)瘋草進(jìn)行內(nèi) 生真菌分離時(shí),不僅會(huì)分離得到內(nèi)生真菌Undifilum oxytropis,還會(huì)不可避免的得到其他種屬的菌株，如下表1，嚴(yán)重影響了分離效率，造成了時(shí)間和精力上的損失。
[0005]表1分離瘋草攜帶的內(nèi)生真菌的多樣性
【權(quán)利要求】
1.甘肅棘豆產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌的定向分離及鑒定方法,其特征在于: 由以下步驟實(shí)現(xiàn): 步驟一:分離: 將甘肅棘豆的莖和成熟種子用蒸餾水沖洗干凈，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液漂洗30S、無(wú)菌水沖洗3次、有效氯的質(zhì)量百分含量為2%的次氯酸鈉溶液漂洗3 min、無(wú)菌水沖洗3-5次后，再將組織剪成5_X 5_小塊，分別置于PDA平板上，平板中充滿CO2并用保鮮膜密封，在光照條件下于室溫培養(yǎng)，待切口處長(zhǎng)出菌絲后，挑取頂端菌絲轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上純化2-3次，刮取菌絲，隨后將菌株接種至試管斜面，4°C冰箱保存?zhèn)溆茫? 步驟二:ITS序列比對(duì): (1)刮取新鮮菌絲80mg，用去離子水沖洗干凈后，再用無(wú)菌水沖洗一次，用濾紙將菌絲表面水吸干后放入1.5mL離心管內(nèi)，加入液氮迅速研磨至粉末； (2)向管內(nèi)加入預(yù)熱65°C的2XCTAB緩沖液500μ L，振蕩混勻，置于65°C水浴鍋中溫育30min,中間搖晃2_3次； (3)放置至室溫后，加入500μ L的萃取混合液，振蕩混勻后，室溫靜置5min，期間持續(xù)輕搖；
(4)4°C，12000 r/min,離心 15min ； (5)吸取上清，再加入500μ L的CTAB提取液，混勻，于65°C再溫育15min ； (6)加入500μ L的萃取混合液,振蕩混勻，12000 r/min, 4°C離心15min ； (7)取上清加入1/10體積、pH5.2、摩爾體積濃度為3mol/L的NaAC，再加入500 μ L的異戍醇，輕搖即出現(xiàn)沉淀，-20°C放置30min以上；4°C, 13000 r/min,離心15min ;棄上清,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的冷乙醇溶液100 μ L洗滌沉淀兩次，室溫下風(fēng)干； (8)用ρΗ8.0的TE緩沖液或滅菌的雙蒸水溶解，于4°C貯存；以真菌rDNA擴(kuò)增的通用引物 ITSl (5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’)和 ITS4 (5，-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3，)為上、下游引物，擴(kuò)增其核糖體rDNA-1TS保守序列； 進(jìn)行擴(kuò)增的 PCR反應(yīng)體系為 50 μ L =TaKaRa Taq DNA聚合酶 2.5UU0XPCR Buffer 5 μ L,MgCl2 3ML、Dntp 4 μ L、ITSl 和 ITS4 引物各 2 μ L、模板 DNA 0.5 μ L,加雙蒸水至 50 μ L ； 反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min ； (9)95°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸lmin,30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸1min使其完全反應(yīng)； (10)將PCR產(chǎn)物加入質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為15g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行分析，真菌5.8S rDNA-1TS序列的長(zhǎng)度一般為500-700bp，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)定的5.8S rDNA-1TS序列用BLAST與GenBank中的5.8S rDNA-1TS序列進(jìn)行同源性比較，應(yīng)用Clustal X 1.83 vers1n和MEGA 5.0軟件，分別采用鄰接法和最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行種屬歸類，自展法檢測(cè)進(jìn)化樹，自展數(shù)據(jù)集為1000次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘肅棘豆產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌Undifilumoxytropis的定向分離及鑒定方法，其特征在于: 步驟一中，所述的PDA培養(yǎng)基的配方如下: 馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸懼水I 000 mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甘肅棘豆產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌Undifilum oxytropis的定向分離及鑒定方法，其特征在于: 步驟二的(3)和(6)中，所述萃取混合液由質(zhì)量比為25:24:1的Tris飽和酚、氯仿和異戊醇混合而成 。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK104031849SQ201410318819
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月7日
【發(fā)明者】路浩, 楊曉雯, 趙寶玉, 曹丹丹, 薛瑞旭, 權(quán)海云 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)