本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的試劑盒。

背景技術(shù)：

神經(jīng)干細(xì)胞是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細(xì)胞，它可以通過不對(duì)等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞。根據(jù)分化潛能的時(shí)序分為：主要存在胚胎時(shí)期的神經(jīng)管上皮細(xì)胞、放射狀膠質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)母細(xì)胞，其中，放射狀膠質(zhì)神經(jīng)元主要存在于幼年時(shí)期，可以分裂并同時(shí)產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞或是膠質(zhì)細(xì)胞；神經(jīng)母細(xì)胞主要存在于成年動(dòng)物體中，可以產(chǎn)生神經(jīng)前體細(xì)胞、神經(jīng)元和各類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。根據(jù)部位主要分兩類：神經(jīng)嵴干細(xì)胞和中樞神經(jīng)干細(xì)胞。目前將具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞都統(tǒng)稱為神經(jīng)干細(xì)胞。

在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方面，除了傳統(tǒng)的藥物、手術(shù)及康復(fù)治療外，近年來細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究得到了廣泛開展，主要包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞移植等。2009年，研究者成功的將人胚胎干細(xì)胞注射到脊髓損傷的大鼠體內(nèi)，從而使大鼠恢復(fù)了運(yùn)動(dòng)能力，但直接注射胚脂干細(xì)胞存在形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)證明，利用神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病是有效且安全的選擇，神經(jīng)干細(xì)胞不具有成瘤性，具有向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的潛能；是未分化的原始細(xì)胞，不表達(dá)成熟的細(xì)胞抗原，不被免疫系統(tǒng)識(shí)別，具有低免疫源性；其組織融合性好，可以與宿主的神經(jīng)組織良好融合，并在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活，是最理想的細(xì)胞移植材料。因此，業(yè)內(nèi)一直致力于神經(jīng)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究。

神經(jīng)干細(xì)胞可以由胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和其它干細(xì)胞分化而來。胚胎干細(xì)胞是從哺乳動(dòng)物的囊胚內(nèi)細(xì)胞群和原始的生殖細(xì)胞著床前胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來的一種全能性的多功能神經(jīng)干細(xì)胞，這種細(xì)胞可以在體外進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，因此，提供無(wú)致瘤性、且能夠在體外快速增殖、穩(wěn)定傳代、大量培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞成為目前的當(dāng)務(wù)之急。

神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)一直是一個(gè)比較困難的課題，其難點(diǎn)在于兩點(diǎn)，一是所需試劑和因子的濃度配比需要摸索，花費(fèi)了大量的時(shí)間和精力才能達(dá)到最佳的配方；二是傳統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)是通過懸浮培養(yǎng)神經(jīng)球，觀察神經(jīng)球數(shù)量倍增后，通過離心，擴(kuò)瓶培養(yǎng)達(dá)到傳代的目的。這種懸浮培養(yǎng)的方法，神經(jīng)干細(xì)胞增殪緩慢，而且活力很差，非常容易凋亡，很難收獲大量的神經(jīng)干細(xì)胞。因此這使得相關(guān)的科研工作者很難得到大量的神經(jīng)干細(xì)胞來進(jìn)行相關(guān)的研究工作。為解決傳統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)是通過懸浮培養(yǎng)神經(jīng)球，觀察神經(jīng)球數(shù)量倍增后，通過離心，擴(kuò)瓶培養(yǎng)達(dá)到傳代的目的，這種懸浮培養(yǎng)的方法，神經(jīng)干細(xì)胞增殖緩慢，而且活力很差，非常容易凋亡，很難收獲大量的神經(jīng)干細(xì)胞等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的試劑盒。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的試劑盒，包括神經(jīng)組織保存液、神經(jīng)組織洗滌液、神經(jīng)組織分解液、細(xì)胞洗滌液、原代細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞消化液、繼代細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞凍存液；其中，繼代細(xì)胞培養(yǎng)液為神經(jīng)干細(xì)胞的含血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由loooml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、50～250ug/ml的胎牛血清、10～20ng/ml的bfgf、10～20ng/ml的egf、0.5～2.5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5～2.5mmol/ml的丙酮酸鈉混合組成，所述神經(jīng)組織保存液為含有鏈霉素50～250ug/ml、青霉素50～250ug/ml的rpmi-1640、dmem、q-mem、dmem/f12中的一種或兩種以上混合的培養(yǎng)基，神經(jīng)組織洗滌液為含有青霉素50～250ug/ml、鏈霉素50～250ug/ml的生理鹽水、pbs、d-hanks中的一種，神經(jīng)組級(jí)分解液為含膠原酶i／膠原酶iv1～2mg/ml、脫氧核糖核酸10.1～0.2mg／ml的dmem、dmem/f12、mem、rpmi-1640中的一種或兩種以上混合的培養(yǎng)基，細(xì)胞洗滌液為pbs/d-hanks，原代細(xì)胞培養(yǎng)液為神經(jīng)干細(xì)胞的無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由loooml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10～20ng/ml的bfgf、10～20ng/ml的egf、15～25ug/ml的b27、10～15ug/ml的n2、0.5～2.5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5～2.5mmol/ml的丙酮酸鈉混合組成，細(xì)胞消化液為含1.5～2.5mg/ml的胰蛋白酶、0.1～0.25mg/ml的edta的pbs，細(xì)胞凍存液為含dms050～200mg／ml的神經(jīng)干細(xì)胞胎牛血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：提供的試劑盒進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)更加方便，成本較低，神經(jīng)干細(xì)胞的活性較強(qiáng)，培養(yǎng)過程中更加穩(wěn)定，成功率較高，可以大批量培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描迷。

本發(fā)明所述的實(shí)施例為用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的試劑盒，包括神經(jīng)組織保存液、神經(jīng)組織洗滌液、神經(jīng)組織分解液、細(xì)胞洗滌液、原代細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞消化液、繼代細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞凍存液；繼代細(xì)胞培養(yǎng)液為神經(jīng)干細(xì)胞的含血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由loooml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、50ug/ml的胎牛血清、long／ml的bfgf、long／ml的egf、0.5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5mmol/ml的丙酮酸鈉混合組成。繼代細(xì)胞培養(yǎng)液為獲得的神經(jīng)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)液，使神經(jīng)干細(xì)胞得以貼壁培養(yǎng)，具有更強(qiáng)的活性。

所述的神經(jīng)組織保存液為含有鏈霉素50ug/ml、青霉素50ug／ml的rpmi-1640、dmem、a-mem、dmem/f12中的一種或兩種以上混合的培養(yǎng)基。神經(jīng)組織保存液的作用是保證神經(jīng)組織在取樣后的活性以及滅菌。

神經(jīng)組織洗滌液為含有青霉素50ug/ml、鏈霉素50ug/ml的生理鹽水、pbs、d-hanks中的一種。神經(jīng)組織洗滌液的作用是洗滌神經(jīng)組織并除去血液以及滅菌。

神經(jīng)組織分解液為含膠原酶i／膠原酶ivlmg／ml、脫氧核糖核酸io.img／ml的dmem、dmem/f12、mem、rpmi-1640中的一種或兩種以上混合的培養(yǎng)基。神經(jīng)組織分解液的作用是消化神經(jīng)組織，獲得單細(xì)胞懸液。

細(xì)胞洗滌液為pbs/d-hanks。細(xì)胞洗滌液的作用是洗滌獲得的干細(xì)胞去除各種液體殘留。

原代細(xì)胞培養(yǎng)液為神經(jīng)干細(xì)胞的無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由loooml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、long／ml的bfgf、long／ml的egf、15ug/ml的b27、loug／ml的n2、0.5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5mmol/ml的丙酮酸鈉混合組成。原代細(xì)胞培養(yǎng)液為無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基，用于懸浮神經(jīng)干細(xì)胞形成神經(jīng)球。

細(xì)胞消化液為含1.5mg/ml的胰蛋白酶、0.img／ml的edta晌pbs。細(xì)胞消化液的作用是細(xì)胞傳代時(shí)，消化貼壁的神經(jīng)干細(xì)胞。

細(xì)胞凍存液為含dms050mg/ml的神經(jīng)干細(xì)胞胎牛血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基。細(xì)胞凍存液的作用是凍存獲得的神經(jīng)干細(xì)胞。

本發(fā)明提供的試劑盒中所選用的各種試劑都是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)確定下來的，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的最佳配方，使用該試劑盒，可在較短時(shí)間獲得大量神經(jīng)干細(xì)胞，并且具有低成本、易操作、效率高等特點(diǎn)，將在干細(xì)胞相關(guān)研究及其臨床試驗(yàn)中發(fā)揮重要作用，具有非常好的發(fā)展前景。

經(jīng)過試驗(yàn)得知，使用實(shí)施例提供的試劑盒約2cff13的腦組織，可以在3周內(nèi)(21天)獲得pl代神經(jīng)干細(xì)胞2.3×107個(gè)，至p3代可得1×109個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞，因此可以表明利用本試劑盒可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的神經(jīng)干細(xì)胞。