本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及病態(tài)胎盤附著(morbidlyadherentplacenta，map)的生物學(xué)指標(biāo)篩選方法及其應(yīng)用、試劑盒和裝置。

背景技術(shù)：

病態(tài)胎盤附著map是一組胎盤絨毛不同程度侵入子宮肌層的疾病，根據(jù)胎盤的植入深度的異常分為：胎盤粘連(placentaaccreta)、胎盤植入(placentaincreta)和胎盤穿透(placentapercreta)。map主要表現(xiàn)為分娩后胎盤難以完整剝離，容易導(dǎo)致產(chǎn)時(shí)及產(chǎn)后嚴(yán)重大出血，是導(dǎo)致圍產(chǎn)期緊急子宮切除和孕產(chǎn)婦死亡的主要原因，產(chǎn)婦死亡率達(dá)到7-10％。前置胎盤患者更易發(fā)生胎盤植入，有研究發(fā)現(xiàn)前置胎盤患者并發(fā)胎盤植入高達(dá)10％。隨著近十年來子宮下段剖宮產(chǎn)率的上升，據(jù)報(bào)道m(xù)ap的發(fā)病率也從原來的0.04％上升為0.2％。大量研究已證實(shí)前置胎盤和剖宮產(chǎn)史是map的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。如果產(chǎn)前能從有高危因素的孕婦中明確診斷出map，合理制定安全個(gè)體化的分娩方案將最大減少map的并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)。

目前產(chǎn)前診斷map主要以影像學(xué)檢查b超和磁共振成像(mri)為主。文獻(xiàn)1提出采用綜合、量化的b超評價(jià)方法。文獻(xiàn)2作了有關(guān)超聲回顧性的分析，結(jié)論是對于不同的胎盤的植入深度沒有統(tǒng)一的超聲描述，以至于影響判斷超聲篩查和診斷map的準(zhǔn)確性。當(dāng)超聲可疑有胎盤植入不能明確或者胎盤位于子宮后壁的顯示不清的時(shí)候，mri是目前產(chǎn)前診斷map最重要的依據(jù)。隨著國內(nèi)外通過mri檢查診斷、預(yù)測map發(fā)生的研究增多，文獻(xiàn)3指出mri也有診斷陷阱，隨著妊娠晚期子宮增大肌層變薄會(huì)造成植入假陽性的診斷，相反，晚期胎盤影像學(xué)異質(zhì)性結(jié)構(gòu)消失，則造成假陰性的診斷。另外，產(chǎn)前難以區(qū)分三種類型的map，目前通常需要產(chǎn)時(shí)術(shù)中或產(chǎn)后組織病理檢查才能明確區(qū)分。因此，產(chǎn)前診斷如何診斷出map的同時(shí)明確辨別植入深度是有效管理map疾病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵，也是難點(diǎn)。

目前國際上還沒有公認(rèn)的診斷map的血清學(xué)指標(biāo)。近年來有研究嘗試尋求敏感和特異性高的map血清生物學(xué)指標(biāo)，并取得了一定進(jìn)展，但也存在一定局限。有些指標(biāo)檢測后沒有得到預(yù)想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比如血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、胎盤生長因子(pigf)等，還有些指標(biāo)已經(jīng)被證實(shí)沒有診斷意義比如肌酸酐激酶(ck)、胎兒游離dna(cffdna)。文獻(xiàn)4提出了通過測量從懷孕受試者收集的體液樣品尤其是羊水和血漿中選自胎盤衍生基因組pls-001至pls-050的一種或多種基因的表達(dá)水平以評估胎盤功能和診斷與胎盤功能異常有關(guān)的疾病的手段，但胎盤功能異常與病態(tài)胎盤附著map是不同的疾病，并且該研究也沒有比較胎盤粘連與其他類型病態(tài)胎盤附著是否存在差異。因此尋找一種敏感和特異性高的生物學(xué)指標(biāo)迫在眉睫。該指標(biāo)應(yīng)滿足：首先能在有高危險(xiǎn)因素的孕婦中能診斷出map，其次還能進(jìn)一步辨別胎盤異常附著的深度。

人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞具有獨(dú)特的類似于腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，但滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲受到精細(xì)的調(diào)控，具有嚴(yán)格的時(shí)空限制。最近10年中趨化因子及各自受體成為腫瘤生物學(xué)行為研究的熱點(diǎn)之一。趨化因子是對某些細(xì)胞具有定向趨化作用的小分子蛋白質(zhì)。根據(jù)近氨基端半胱氨酸的數(shù)量、位置和排列方式被分為cc、cxc、c、c3xc四類。趨化因子cxcl12，又稱基質(zhì)細(xì)胞源性因子1(stromalcell-derivedfactor-1，sdf-1)，主要由基質(zhì)細(xì)胞和骨髓細(xì)胞分泌，具有持續(xù)表達(dá)性，與同源受體cxcr4和孤兒受體cxcr7結(jié)合對誘導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)發(fā)揮其獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)。滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與侵襲功能異常、蛻膜螺旋動(dòng)脈重鑄不良是先兆子癇、胎兒宮內(nèi)生長遲緩、自然流產(chǎn)等妊娠相關(guān)疾病的主要原因之一。文獻(xiàn)5的研究提出，cxcl12/cxcr4/cxcr7生物軸在胎盤早期著床和胚胎的生長發(fā)育中的作用越來越受到重視，其對滋養(yǎng)細(xì)胞的分化、增殖和侵襲的調(diào)節(jié)也已得到證實(shí)，文獻(xiàn)5對cxcl12介導(dǎo)的信號(hào)通路進(jìn)行了較為系統(tǒng)的回顧和總結(jié)，異常的cxcl12/cxcr4/cxcr7表達(dá)導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞的功能異常，將導(dǎo)致早期妊娠失敗(自然流產(chǎn))、子癇前期。文獻(xiàn)6的研究證實(shí)了這一觀點(diǎn)，cxcl12在先兆子癇患者的血清和胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)了異常表達(dá)。

文獻(xiàn)5雖提及胎盤植入但其實(shí)際是指胎盤早期著床(placentaimplantation)即正常妊娠的建立(孕12周以前)，本發(fā)明研究的map胎盤植入指的是胎盤過度侵襲(placentalexcessiveinvasion)，map主要表現(xiàn)為孕中晚期大量異生的血管和過度侵襲的絨毛，區(qū)別于文獻(xiàn)5提到的人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞植入著床的嚴(yán)格時(shí)空限制性。因此，其他研究cxcl12/cxcr4/cxcr7在腫瘤細(xì)胞和早期滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲調(diào)控中起重要作用可作為本發(fā)明的相關(guān)背景技術(shù)，因?yàn)閏xcl12在不同妊娠相關(guān)疾病中和不同妊娠階段的生物學(xué)作用是不同的。目前現(xiàn)有技術(shù)中沒有對cxcl12/cxcr4/cxcr7在map胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞和血清中的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)研究的報(bào)道，也沒有研究表明趨化因子cxcl12可以用于預(yù)測和診斷map。

文獻(xiàn)1：cn106308851a；

文獻(xiàn)2：jauniauxe,collinssl,jurkovicd,burtongj.accretaplacentation:asystematicreviewofprenatalultrasoundimagingandgradingofvillousinvasiveness.amjobstetgynecol,2016；215(6):712-721；

文獻(xiàn)3：kilcoynea,shenoy-bhangleas,robertsdj,sisodiarc,gervaisda,leesi.mriofplacentaaccreta,placentaincreta,andplacentapercreta:pearlsandpitfalls.ajramjroentgenol,2017；208(1):214-221；

文獻(xiàn)4：jp2008278886a；

文獻(xiàn)5：cxcl12/cxcr4/cxcr7軸在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中作用機(jī)制的探,王亮等,《國際免疫學(xué)雜志》2014年9月,第37卷,第5期,p376-380

文獻(xiàn)6：schanza,winnvd,fishersj,etal.pre-eclampsiaisassociatedwithelevatedcxcl12levelsinplacentalsyncytiotrophoblastsandmaternalblood.eurjobstetgynecolreprodbiol,2011,157(1):32-37。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問題

針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種敏感和特異性高且能細(xì)分判斷植入深度的map生物學(xué)指標(biāo)及其篩選方法，同時(shí)提供一種利用該生物學(xué)指標(biāo)預(yù)測或診斷map的方法。

本發(fā)明的目的還包括提供檢測該生物學(xué)指標(biāo)的試劑在制備預(yù)測或診斷map試劑盒中的用途。

本發(fā)明的另一目的在于提供含檢測map生物學(xué)指標(biāo)的試劑盒及用于預(yù)測或診斷妊娠個(gè)體病態(tài)胎盤附著map的裝置。

用于解決問題的方案

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種檢測cxcl12的試劑在制備用于預(yù)測或診斷妊娠個(gè)體病態(tài)胎盤附著map即胎盤粘連、胎盤植入、胎盤穿透的試劑盒中的用途。

根據(jù)上述用途，所述預(yù)測或診斷妊娠個(gè)體病態(tài)胎盤附著map的方法包括如下步驟：1)取妊娠個(gè)體的生物樣本；2)利用所述試劑盒檢測生物樣本中cxcl12的量；3)將步驟2)測得的結(jié)果與常規(guī)值進(jìn)行比較，如果cxcl12的量高于常規(guī)值時(shí)，則預(yù)測或診斷所述妊娠個(gè)體發(fā)生病態(tài)胎盤附著map的可能性增加。所述方法的步驟3)還包括根據(jù)檢測得到的所述cxcl12的量來判斷胎盤的植入深度。

根據(jù)上述用途，所述妊娠個(gè)體為前置胎盤患者。

根據(jù)上述用途，所述妊娠個(gè)體選自前置胎盤患者；所述檢測cxcl12的試劑選自生化檢測試劑或基因檢測試劑中的一種或多種，優(yōu)選的生化檢測試劑選自免疫組織化學(xué)、免疫熒光檢測、免疫印跡檢測或者酶免疫eia檢測試劑中的一種或多種；所述基因檢測試劑選自pcr檢測試劑。

根據(jù)上述用途，所述生物樣本為血液樣品，優(yōu)選血漿或血清。

根據(jù)上述用途，所述常規(guī)值是根據(jù)無并發(fā)病態(tài)胎盤附著的前置胎盤患者的cxcl12測量值統(tǒng)計(jì)得出。

根據(jù)上述用途，所述方法能預(yù)測或診斷前置胎盤患者并發(fā)胎盤植入(placentaincreta)或胎盤穿透(placentapercreta)的風(fēng)險(xiǎn)。

進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其包括一種或多種用于檢測cxcl12的試劑，所述試劑選自生化檢測試劑或基因檢測試劑中的一種或多種，優(yōu)選地所述生化檢測試劑選自免疫組織化學(xué)、免疫熒光檢測、免疫印跡檢測或者酶免疫eia檢測試劑中的一種或多種；優(yōu)選地所述基因檢測試劑選自pcr檢測試劑。該試劑盒可以用于預(yù)測或診斷妊娠個(gè)體病態(tài)胎盤附著map即胎盤粘連、胎盤植入、胎盤穿透的風(fēng)險(xiǎn)。

進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了用于預(yù)測或診斷妊娠個(gè)體病態(tài)胎盤附著map即胎盤粘連、胎盤植入、胎盤穿透的裝置，所述裝置包括：可讀介質(zhì)，其用于存儲(chǔ)針對妊娠個(gè)體的臨床資料信息，其中所述臨床資料信息包括用于預(yù)測或診斷妊娠個(gè)體病態(tài)胎盤附著的信息，其包括在取自妊娠個(gè)體的一種或多種血液樣品中cxcl12的量；和計(jì)算裝置，其根據(jù)妊娠個(gè)體的臨床資料信息來預(yù)測或診斷是否存在病態(tài)胎盤附著和/或其深度，優(yōu)選的，所述妊娠個(gè)體為前置胎盤患者。

更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種篩選能用于預(yù)測或診斷病態(tài)胎盤附著map即胎盤粘連、胎盤植入、胎盤穿透的潛在生物標(biāo)記物的篩選方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)收集前置胎盤患者和病態(tài)胎盤附著患者的胎盤組織樣本和血液樣本；

(2)通過生化檢測方法分析判斷所述胎盤組織樣本中胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的各候選生物標(biāo)記物表達(dá)水平；優(yōu)選地，生化檢測方法為免疫組化方法；

(3)結(jié)合患者的臨床數(shù)據(jù)建立影響胎盤植入深度的生物標(biāo)記物模型，判斷和胎盤的植入深度相關(guān)的生物標(biāo)記物；

所述篩選方法還包括步驟(4)或步驟(5)：

(4)通過生化分析法或基因分析法分析步驟(1)中所述血液樣本中的各候選生物標(biāo)記物表達(dá)水平，判斷和胎盤植入深度相關(guān)的生物標(biāo)記物；

(5)通過酶免疫方法eia分析步驟(3)中所獲得的相關(guān)生物標(biāo)記物在步驟(1)中所述血液樣本中的表達(dá)水平；

優(yōu)選地，所述生化分析法選自酶免疫方法eia，更優(yōu)選為elisa，優(yōu)選地，所述基因分析法選自熒光定量pcr法。

如果步驟(4)中所述生物標(biāo)記物和步驟(3)中所述的生物標(biāo)記物相同，或者如果步驟(5)中所述生物標(biāo)記物的表達(dá)水平和步驟(3)中所述的生物標(biāo)記物表達(dá)水平相關(guān)，則所述生物標(biāo)記物能夠預(yù)測或診斷病態(tài)胎盤附著。

發(fā)明的效果

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明提供了一種篩選和確定map生物標(biāo)記物的方法并分析了所獲得的生物標(biāo)記物在map中的生物學(xué)作用。根據(jù)map的病理特征及待定生物標(biāo)記物在map胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的分布和表達(dá)，結(jié)合臨床病理資料，建立了影響胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞cxcl12表達(dá)的多因素模型；發(fā)現(xiàn)在該模型里胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞cxcl12表達(dá)與胎盤的植入深度密切相關(guān)；本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)map孕婦循環(huán)血cxcl12的升高來源于局部胎盤組織的滋養(yǎng)細(xì)胞，胎盤入侵越深，血和胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞cxcl12水平越高。

(2)本發(fā)明提供了一種利用測定血cxcl12的濃度來預(yù)測或診斷前置胎盤患者并發(fā)map即胎盤粘連、胎盤植入、胎盤穿透的方法，該方法便捷，易于操作，診斷準(zhǔn)確度高且能細(xì)分判斷植入深度。

(3)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)血cxcl12能對胎盤的植入深度進(jìn)行預(yù)測或診斷，填補(bǔ)map生物學(xué)預(yù)測指標(biāo)的空白，本發(fā)明提供的含檢測cxcl12試劑的診斷試劑盒及利用血cxcl12的診斷設(shè)備能在產(chǎn)前有高危因素的孕婦中明確判斷胎盤的植入深度，有利于合理制定map安全個(gè)體化的分娩方案，將最大減少這項(xiàng)產(chǎn)科急危重癥的風(fēng)險(xiǎn)。

附圖說明

圖1為cxcl12/cxcr4/cxcr7在map患者和前置胎盤患者的胎盤中免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果。

圖2為一例孕36⁺²周前置胎盤合并胎盤植入患者的病理和免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果：包括胎盤的植入和非植入部位。圖中英文縮寫中文含義：bv，血管；dc，蛻膜細(xì)胞；db，蛻膜基底；fib，纖維組織；myo，子宮肌層；stbs，合體滋養(yǎng)細(xì)胞；evts，絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞；vill，絨毛。

圖3為孕36周前置胎盤合并胎盤植入和孕35⁺⁴周前置胎盤合并胎盤穿透的兩個(gè)代表病例患者胎盤病理和免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果。圖中英文縮寫中文含義：bv，血管；myo，子宮肌層；stbs，合體滋養(yǎng)細(xì)胞；evts，絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞；ievts，細(xì)胞間絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞；eevts，血管內(nèi)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞；vill，絨毛；abv，異常血管。

圖4為map和前置胎盤孕婦血循環(huán)中cxcl12的水平。

圖5為血cxcl12的濃度和cxcl12胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞免疫組化染色強(qiáng)度評分的相關(guān)性分析，建立血cxcl12水平對map預(yù)測或診斷的roc曲線。其中，roc曲線以特異度1(1-specificity)為橫坐標(biāo)，以靈敏度(sensitivity)為縱坐標(biāo)。

圖6為cxcl12染色的評分指南。

圖7為cxcl12/cxcr4/cxcr7免疫組化的陽性對照和陰性對照。

圖8為篩選能夠預(yù)測妊娠個(gè)體患有病態(tài)胎盤附著的風(fēng)險(xiǎn)和/或診斷病態(tài)胎盤附著的潛在生物標(biāo)記物的方法流程示意圖。

具體實(shí)施方式

以下將參考附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的各種示例性實(shí)施例、特征和方面。為了更好地說明本發(fā)明，在下文的具體實(shí)施方式中給出了眾多的具體細(xì)節(jié)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，沒有某些具體細(xì)節(jié)，本發(fā)明同樣可以實(shí)施。在另外一些實(shí)例中，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法、手段、器材和步驟未作詳細(xì)描述，以便于凸顯本發(fā)明的主旨。

定義

除非另有定義，本發(fā)明所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員所通常理解的相同含義。

術(shù)語“胎盤粘連”(placentaaccreta)是指絨毛膜的絨毛種植在沒有蛻膜介入的子宮肌層,但在子宮肌層與絨毛之間有纖維蛋白樣物質(zhì)和多絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(extravilloustrophoblast，evt)；“胎盤植入”(placentaincreta)是指絨毛在粘連的基礎(chǔ)上進(jìn)一步侵入至子宮肌層內(nèi)；“胎盤穿透”(placentapercreta)是指絨毛組織更進(jìn)一步貫穿子宮漿膜，常侵入膀胱或直腸，該胎盤稱為穿透型胎盤。

術(shù)語“滋養(yǎng)細(xì)胞”即胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，滋養(yǎng)細(xì)胞由異源性細(xì)胞群組成，有3種類型，即：①細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(ctb，cytotrophoblast)；②合體滋養(yǎng)細(xì)胞(stb,syncytiotrophoblast)；③中間型滋養(yǎng)細(xì)胞(it)。絨毛滋養(yǎng)層主要是細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞。中間型滋養(yǎng)細(xì)胞是覆蓋了上述兩種細(xì)胞的形態(tài)和功能特征的獨(dú)立的滋養(yǎng)細(xì)胞類型，其是絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(evts)的主要組成。

術(shù)語“前置胎盤”(placentaprevia，可簡稱pp)是指胎盤附著于子宮下段，甚至胎盤下緣達(dá)到或覆蓋宮頸內(nèi)口，其位置低于胎先露部。

術(shù)語“臨床數(shù)據(jù)”或“臨床資料信息”涉及關(guān)于患者的健康狀態(tài)的全部可得到的數(shù)據(jù)和信息，包括但不僅限于年齡、體重、疾病發(fā)生學(xué)數(shù)據(jù)、既往病史數(shù)據(jù)、手術(shù)情況、通過體外診斷方法如組織病理學(xué)、血液或尿液檢驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)、通過成形方法如mri、超聲波所獲得的數(shù)據(jù)。

本發(fā)明中“受試者”是指人或非人雌性生物體，優(yōu)選受試者是人類，最優(yōu)選是“患者”，本發(fā)明中的患者主要是指map患者或者前置胎盤患者。這包括尚未確定患病、正在檢查的人。

本發(fā)明使用的術(shù)語“預(yù)測或診斷”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員通過其可估計(jì)和/或確定患者是否患有給定的疾病或病狀的可能性的方法。這里的“診斷”是“確定”，但不意味著暗示診斷是100％準(zhǔn)確，在某些實(shí)施方式中“預(yù)測或診斷”可涵蓋預(yù)測該疾病發(fā)生可能性、評估疾病或臨床狀況的嚴(yán)重程度。

本發(fā)明“生物學(xué)指標(biāo)”是指可測量和可量化的生物學(xué)參數(shù)，可指示健康或疾病特征，也可稱為“生物標(biāo)記物”或“生物標(biāo)志物”。常見生物學(xué)指標(biāo)可以是蛋白質(zhì)、肽或核酸分子，本發(fā)明優(yōu)選趨化因子。

本發(fā)明中“植入深度”或“入侵深度”或“侵襲深度”均具有相同的含義，即指胎盤絨毛接觸、侵入子宮肌層或侵入子宮毗鄰器官的程度。

生物學(xué)指標(biāo)的確定

用于篩選能預(yù)測或診斷病態(tài)胎盤附著的潛在生物標(biāo)記物的篩選方法包括使用來自妊娠個(gè)體的生物樣本。生物樣本可以是任何含有選定生物標(biāo)記物的體液或組織樣品。用于本發(fā)明所述方法的示例性生物樣本包括血液、純化的血液制品(如血清、血漿等)、絨毛膜絨毛活組織檢查、胎盤組織樣本。在本發(fā)明的情形下，“血漿”為在離心之后獲得的含抗凝劑血液的基本無細(xì)胞上清液。“血清”為在使血液凝結(jié)之后收集的全血的液體級(jí)分，其不包含血纖維蛋白原，但是一些凝血因子保留下來。

生物樣本中存在的生物學(xué)指標(biāo)的量可以利用任何適合用來測量生物樣本中的蛋白質(zhì)的分析形式來測定。用于該目的的常用的分析形式包括生化檢測或基因檢測，生化檢測包括免疫組化分析、免疫熒光分析、酶免疫測定(eia)、毛細(xì)管電泳免疫測定(ceia)、放射免疫測定(ria)、免疫放射分析(irma)、熒光偏振免疫測定(fpia)等，酶免疫測定(eia)包括酶放大免疫測定技術(shù)(emit)、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、igm抗體捕獲elisa(macelisa)和微粒酶免疫測定(meia)等，優(yōu)選使用免疫組化檢驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)。基因檢測包括pcr檢測法，優(yōu)選熒光定量pcr檢測法。

本發(fā)明篩選能用于預(yù)測或診斷病態(tài)胎盤附著map即胎盤粘連、胎盤植入、胎盤穿透的潛在生物標(biāo)記物的篩選方法，其包括如下步驟：

(1)收集前置胎盤患者和病態(tài)胎盤附著患者的胎盤組織樣本和血液樣本；

(2)通過生化檢測方法分析判斷所述胎盤組織樣本中胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的各候選生物標(biāo)記物表達(dá)水平；優(yōu)選地，生化檢測方法為免疫組化方法；

(3)結(jié)合患者的臨床數(shù)據(jù)建立影響胎盤植入深度的生物標(biāo)記物模型，判斷和胎盤的植入深度相關(guān)的生物標(biāo)記物；

所述篩選方法還包括步驟(4)或步驟(5)：

(4)通過酶免疫方法eia分析步驟(1)中所述血液樣本中的各候選生物標(biāo)記物表達(dá)水平，判斷和胎盤植入深度相關(guān)的生物標(biāo)記物；

(5)通過elisa方法分析步驟(3)中所獲得的相關(guān)生物標(biāo)記物在步驟(1)中所述血液樣本中的表達(dá)水平；

如果步驟(4)中所述生物標(biāo)記物和步驟(3)中所述的生物標(biāo)記物相同，或者如果步驟(5)中所述生物標(biāo)記物的表達(dá)水平和步驟(3)中所述的生物標(biāo)記物表達(dá)水平相關(guān)，則所述生物標(biāo)記物能夠預(yù)測或診斷病態(tài)胎盤附著。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，選擇趨化因子如cxcl12、cxcr4、cxcr7作為候選生物標(biāo)記物。通過回顧性的免疫組化研究，證明了cxcl12/cxcr4/cxcr7在滋養(yǎng)細(xì)胞中起重要作用，map患者的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞與前置胎盤患者相比具有明顯的cxcl12/cxcr4/cxcr7表達(dá)，通過對map深度的詳細(xì)評估，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)趨化因子cxcl12與受體cxcr4和cxcr7在區(qū)分子宮肌層浸潤深度方面有更多的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，cxcl12與臨床特征之間的關(guān)系更為接近。為了進(jìn)一步驗(yàn)證cxcl12在map診斷中的作用，通過前瞻性研究用elisa檢測方法評估了cxcl12的血液水平，與前置胎盤患者相比，map患者血中cxcl12水平不僅升高，而且與胎盤侵襲深度相關(guān)，不同植入深度的孕婦血cxcl12水平不同，植入深度越深，cxcl12水平越高，與滋養(yǎng)層細(xì)胞cxcl12表達(dá)也具有顯著相關(guān)性(r＝0.845，p<0.001)。roc分析顯示，診斷敏感度為78.1％，循環(huán)cxcl12濃度的準(zhǔn)確度為88.2％，證明了血cxcl12可以用于預(yù)測和診斷map的能力并且能夠進(jìn)一步細(xì)分判斷植入的深度。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)趨化因子cxcl12、受體cxcr4和cxcr7的表達(dá)在map的滋養(yǎng)層中不是完全平行的變化。在其他疾病中，一些研究組報(bào)告說，趨化因子及其受體也不是一起改變，例如，cxcr4在乳腺癌組織和胃癌血管中高度表達(dá)，cxcr7在前列腺癌中的表達(dá)增加等。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所有患者的免疫組化染色強(qiáng)度評分或與臨床特征的關(guān)系，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)cxcl12與map中胎盤侵襲深度有顯著相關(guān)性。cxcl12的上調(diào)是map發(fā)展的主要過程。

最近的研究報(bào)道，先兆子癇孕婦的胎盤和母體血清中cxcl12的表達(dá)也有升高。雖然本發(fā)明在map中獲得了類似的結(jié)果，但實(shí)際上cxcl12在這兩種疾病中起著不同的作用。先兆子癇中增加的cxcl12可能參與母體-胎兒界面處的免疫細(xì)胞募集或激活，或者可能由于缺陷滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲導(dǎo)致胎盤缺血而修復(fù)母體或胎盤血管中損傷的內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明認(rèn)為，趨化因子cxcl12介導(dǎo)調(diào)節(jié)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞具有不同的功能：①分化：參與介導(dǎo)細(xì)胞滋養(yǎng)層祖細(xì)胞向具有侵襲特征的絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(evts)分化；②增殖：調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和存活；血管再生：③evts入侵至母體蛻膜深部取代子宮螺旋動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,改造成低阻力高容量特點(diǎn)的胎盤子宮脈管系統(tǒng)。本發(fā)明證實(shí)了cxcl12直接在調(diào)節(jié)過度的滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和調(diào)節(jié)大的異常擴(kuò)張血管中發(fā)揮重要作用。通過本發(fā)明的研究工作可知，趨化因子cxcl12是一種新的可預(yù)測或診斷map的生物學(xué)指標(biāo)，可以預(yù)期針對cxcl12的各種調(diào)節(jié)手段日后可以作為治療map的新穎和有效的手段。

預(yù)測或診斷map的方法

基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種預(yù)測或診斷妊娠個(gè)體發(fā)生map即胎盤粘連、胎盤植入、胎盤穿透的方法，其特征是通過檢測血cxcl12的量。具體地，該預(yù)測或診斷妊娠個(gè)體發(fā)生map即胎盤粘連、胎盤植入、胎盤穿透的方法，包括以下步驟：

1)取妊娠個(gè)體的生物樣本；

2)檢測生物樣本中cxcl12的量；

3)將步驟2)測得的結(jié)果與常規(guī)值進(jìn)行比較，如果cxcl12的量高于常規(guī)值時(shí)，則預(yù)測或診斷所述妊娠個(gè)體發(fā)生病態(tài)胎盤附著可能性增加。如果cxcl12的量高于常規(guī)值時(shí)，則預(yù)測或診斷所述妊娠個(gè)體發(fā)生病態(tài)胎盤附著可能性增加。

優(yōu)選地，所述方法的步驟3)還包括根據(jù)檢測得到的cxcl12的量來細(xì)分判斷胎盤的植入深度。

優(yōu)選地，所述妊娠個(gè)體為前置胎盤患者；所述生物樣本為血液樣品，優(yōu)選血漿或血清。

優(yōu)選地，步驟2)的檢測采用生化檢測方法，優(yōu)選酶免疫測定(eia)，其包括酶放大免疫測定技術(shù)(emit)、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、igm抗體捕獲elisa(macelisa)和微粒酶免疫測定(meia)等，更優(yōu)選使用酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)。步驟3)所述常規(guī)值是根據(jù)無并發(fā)病態(tài)胎盤附著的前置胎盤患者的cxcl12測量值統(tǒng)計(jì)得出。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，一種預(yù)測或診斷妊娠個(gè)體發(fā)生map即胎盤粘連、胎盤植入、胎盤穿透的方法，其包括以下步驟：1)取前置胎盤患者的血漿樣本；2)利用elisa檢測血漿中cxcl12的濃度；3)將該濃度與無并發(fā)病態(tài)胎盤附著的前置胎盤患者的血漿中cxcl12平均濃度即常規(guī)值相比較，如果步驟2)測得的濃度高于常規(guī)值時(shí)，則預(yù)測或診斷所述前置胎盤患者發(fā)生病態(tài)胎盤附著可能性增加，并且，根據(jù)檢測得到的cxcl12的濃度還可以細(xì)分判斷胎盤的植入深度，進(jìn)一步地，利用該方法可以準(zhǔn)確預(yù)測或診斷前置胎盤患者并發(fā)胎盤植入或胎盤穿透的風(fēng)險(xiǎn)。

試劑盒及其應(yīng)用

基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還提供了一種檢測生物學(xué)指標(biāo)的試劑在制備用于預(yù)測或診斷病態(tài)胎盤附著map試劑盒中的用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該生物學(xué)指標(biāo)是cxcl12，該試劑盒通過測定獲自妊娠個(gè)體的血液樣品中趨化因子cxcl12的水平來評估病態(tài)胎盤附著。進(jìn)一步優(yōu)選，所述妊娠個(gè)體為前置胎盤患者。利用該試劑盒可用于細(xì)分判斷胎盤的植入深度，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中利用該試劑盒能預(yù)測或診斷前置胎盤患者并發(fā)胎盤植入(placentaincreta)或胎盤穿透(placentapercreta)的風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明還涉及一種用于預(yù)測或診斷妊娠個(gè)體病態(tài)胎盤附著(map)的試劑盒，其包括一種或多種用于檢測生物學(xué)指標(biāo)的試劑，用于測定至少一種生物學(xué)指標(biāo)在取自妊娠個(gè)體的生物樣本中的量，其中至少一種生物學(xué)指標(biāo)選自cxcl12；以及任選用于進(jìn)行測試的說明書。試劑盒還可能包括一種或多種緩沖液、稀釋液、過濾器、注射針或注射器。用于檢測生物學(xué)指標(biāo)的試劑是含有用標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記的標(biāo)記化抗體等，例如免疫組織化學(xué)法、酶免疫測定法、化學(xué)發(fā)光免疫測定法、熒光抗體法或放射免疫測定法等情況下的標(biāo)記化抗體或標(biāo)記化抗體片段。作為標(biāo)記物質(zhì)的具體例，作為酶，可以舉出過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-d-半乳糖苷酶、或葡萄糖氧化酶等，作為熒光物質(zhì)，可以舉出異氰酸熒光素或稀土類金屬螯合物等，作為放射性同位素，可以舉出3h、14c或125i等，此外可以舉出生物素、抗生物素蛋白或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等。酶或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等情況下，其本身單獨(dú)不能產(chǎn)生可以測定的信號(hào)，因此優(yōu)選選擇并含有各自對應(yīng)的適當(dāng)?shù)幕|(zhì)等。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該試劑盒包括一種或多種檢測趨化因子cxcl12的試劑。優(yōu)選地，妊娠個(gè)體為前置胎盤患者。所分析的生物樣本可從全血、外周血或其中部分、血清、edta抗凝血漿、檸檬酸鈉抗凝血漿等中選擇。用于檢測趨化因子cxcl12的試劑可以是例如抗體、部分抗體(antibodyportion)、類抗體材料等。前述抗體、部分抗體、類抗體材料均可以通過本領(lǐng)域常規(guī)方法制備得到。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，檢測趨化因子cxcl12的試劑選自生化檢測試劑或基因檢測試劑中的一種或多種，生化檢測試劑優(yōu)選免疫組織化學(xué)、免疫熒光檢測、免疫印跡檢測或者酶免疫eia檢測試劑中的一種或多種；基因檢測試劑優(yōu)選pcr檢測試劑。

診斷裝置

本發(fā)明還提供用于預(yù)測或診斷妊娠個(gè)體病態(tài)胎盤附著map即胎盤粘連、胎盤植入、胎盤穿透的裝置。該裝置包括：可讀介質(zhì)，其用于存儲(chǔ)針對妊娠個(gè)體的臨床資料信息，其中所述臨床資料信息包括用于預(yù)測或診斷妊娠個(gè)體病態(tài)胎盤附著的信息，其包括在取自妊娠個(gè)體的一種或多種生物樣品中生物學(xué)指標(biāo)的量；和計(jì)算裝置，其根據(jù)妊娠個(gè)體的臨床資料信息來預(yù)測或診斷是否存在病態(tài)胎盤附著和/或其深度。優(yōu)選地，所述妊娠個(gè)體為前置胎盤患者；更優(yōu)選地，生物學(xué)指標(biāo)是cxcl12。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，所述用于預(yù)測或診斷妊娠個(gè)體病態(tài)胎盤附著的信息包括在取自前置胎盤患者的血液樣品(如血漿或血清)中cxcl12的量。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述裝置還可以包括數(shù)據(jù)輸入裝置，其用于輸入一種多種臨床資料信息如年齡、孕齡、孕次、既往分娩情況、末次分娩時(shí)間、剖宮產(chǎn)次數(shù)、孕期相關(guān)病史及檢查、手術(shù)信息如手術(shù)時(shí)間、手術(shù)方式、術(shù)中出血、輸血情況、病理類型等，另外還包括輸入cxcl12在生物樣品(如血漿或血清)中的量。計(jì)算裝置是利用輸入的cxcl12的量和一種或多種選定的參數(shù)來預(yù)測或診斷形成病態(tài)胎盤附著的風(fēng)險(xiǎn)。

實(shí)施例

以下列舉實(shí)施例來說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，該例子僅是示例性的說明，并非窮盡性的說明。

1、研究方法和研究對象

本發(fā)明進(jìn)行了兩項(xiàng)獨(dú)立研究。第一部分研究(sub-study1)是一項(xiàng)回顧性病例對照設(shè)計(jì)。第二部分研究(sub-study2)是一項(xiàng)前瞻性病例對照設(shè)計(jì)。

①第一部分回顧性研究：對2010年1月至2015年12月廣西醫(yī)科大學(xué)一附院術(shù)中判斷及術(shù)后病理確診為病態(tài)胎盤附著(包括粘連型、植入型、穿透型)和前置胎盤(對照組)的孕婦，對其胎盤組織進(jìn)行免疫組化檢驗(yàn)，分析cxcl12/cxcr4/cxcr7在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)水平。

②第二部分前瞻性研究：對2016年1月至2016年12月廣西醫(yī)科大學(xué)一附院和南寧市第一人民醫(yī)院術(shù)前b超和mri術(shù)前診斷前置胎盤和(或)病態(tài)胎盤附著(包括粘連型、植入型、穿透型)的孕婦，術(shù)前留取靜脈血elisa法檢測血cxcl12，術(shù)后對胎盤組織進(jìn)行免疫組化檢測cxcl12。術(shù)中判斷及術(shù)后病理確診病態(tài)胎盤附著(包括粘連型、植入型、穿透型)的孕婦為實(shí)驗(yàn)組，前置胎盤作為對照組。

③納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：前置胎盤組、病態(tài)胎盤附著組因病情需要行剖宮產(chǎn)術(shù)終止妊娠，剖宮產(chǎn)時(shí)均未臨產(chǎn)、胎膜早破。病態(tài)胎盤附著、前置胎盤的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第24版《威廉姆斯產(chǎn)科學(xué)》。病態(tài)胎盤附著病理學(xué)診斷為胎盤種植處子宮內(nèi)膜缺乏蛻膜化,在切除的子宮標(biāo)本或者在胎盤基板上發(fā)現(xiàn)胎盤絨毛直接侵犯子宮肌層。前置胎盤合并病態(tài)胎盤附著者納入病態(tài)胎盤附著組。均排除其它如心臟病、妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病、滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、急慢性感染性疾病等內(nèi)外科合并癥及妊娠并發(fā)癥。所有孕婦均無抽煙、喝酒，飲食與生活習(xí)慣無特殊。所有入組研究對象均獲知情同意并簽署知情同意書，同時(shí)報(bào)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2、臨床資料和標(biāo)本采集及處理

1)孕前臨床資料收集：臨床資料收集：年齡、孕齡、孕次、既往分娩情況、末次分娩時(shí)間、剖宮產(chǎn)次數(shù)、手術(shù)方式、孕期陰道流血及保胎用藥情況、孕期相關(guān)病史及檢查等；

2)手術(shù)相關(guān)信息和病理分類記錄：手術(shù)時(shí)間，手術(shù)方式，術(shù)中出血，輸血情況，病理類型等；

3)術(shù)后胎盤組織采集和保存、備用：備好裝入適量福爾馬林液標(biāo)本袋，記錄患者信息。待手術(shù)臺(tái)護(hù)士測量、檢查胎盤工作完成后，用無菌手術(shù)組織剪，按不同分組不同取材部位分為：胎盤植入分別留取胎盤附著植入處、胎盤附著非植入處，全層切片，前置胎盤作為對照組胎盤剪取胎盤母體面胎盤組織，避開出血、鈣化及梗死區(qū)，中性福爾馬林液中固定24h用于免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察；

4)術(shù)前血標(biāo)本采集和保存、備用：術(shù)前未用藥和輸血前靜脈采血3ml至edta管抗凝，30min內(nèi)離心機(jī)1000rmin離心15min分離血漿，再次在2-8℃低溫離心機(jī)10000r/min離心10min將血漿中血小板完全去除。分離好的血漿分裝至5份250μlep管，-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

3、實(shí)驗(yàn)主要儀器和試劑

實(shí)驗(yàn)主要儀器：

80℃超低溫冰箱(美國beckman公司)；高速離心機(jī)(各種型號(hào))(美國beckman公司)；低溫微型離心機(jī)(美國eppendorf公司)；蛋白定量酶標(biāo)儀(美國biorad公司)；光學(xué)顯微鏡(日本olympus公司)；as325切片機(jī)(英國shandon公司)；移液器(10μl、100fik1000p-l)(德國eppendorf公司)；垂直電泳儀(美國biorad公司)；恒溫水浴槽(美國vwrscientificinc公司)；精密電子天平(瑞士ab204)；一次性吸頭、離心、ep管(上海)；-20℃、4℃冰箱(海爾集團(tuán))；超凈工作臺(tái)(蘇州蘇凈公司)；紫外分光光度儀(beckman公司)；轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門其林貝爾儀器)。

主要試劑：

anti-sdf1抗體(ab9797)美國abcam公司；anti-cxcr4抗體(ab1670)美國abcam公司；anti-cxcr7抗體(ab113410)美國abcam公司；人cxcl12試劑盒(dsa00)美國r&dsystems公司；山羊igg，多克隆抗體-同型對照(ab37373)美國abcam公司；兔igg，單克隆抗體[epr25a]-同型對照(ab172730)美國abcam公司；anti-cytokeratin-7抗體美國invitrogen公司；anti-vimentinantibody美國invitrogen公司；citrate檸檬酸鹽緩沖液碧云天；pbs磷酸鹽緩沖液碧云天；化學(xué)發(fā)光顯影試劑碧云天；sds裂解液碧云天；抗體稀釋液(zli-9029)北京中杉；邁新粘附載玻片福州邁新；免洗蓋玻片福州邁新；pappen免疫組化筆北京中杉。

4、主要檢測方法

4.1免疫組織化學(xué)檢測方法：

4.1.1組織脫水及石蠟包埋

(1)水洗：置水龍頭下以自來水流水沖洗10min，這樣可以使組織中的固定液隨時(shí)溢出，洗得更干凈徹底，

(2)標(biāo)本剪裁：標(biāo)本固定24h后肉眼觀察福爾馬林液中標(biāo)本的大體情況(形狀、大小、色澤、表面形態(tài)、解剖層次等)避開鈣化、壞死及積血區(qū)，切取橫斷面全程5-10mm(包括胎盤從母體面到胎兒面的胎盤全程)，裁取胎盤組織約15×15mm大小，置于包埋盒中固定，并做好標(biāo)記。

(3)固定：及時(shí)將所取得組織塊放入適量的甲醛固定液中，在盡量短的時(shí)間內(nèi)使其停止生命活動(dòng)，保持其精細(xì)結(jié)構(gòu)。

(4)脫水：按以下順序依次將固定后的標(biāo)本置入相應(yīng)時(shí)間。50％乙醇(90min)→70％乙醇(90min)→85％乙醇(90min)→95％乙醇(90min)→100％乙醇(60min)→100％乙醇(60min)。

(5)透明：將脫水后的包埋盒浸入二甲苯溶液中靜置60min。

(6)浸蠟：將透明處理后的組織塊浸入透明劑與石蠟的混合液中，并不斷提高石蠟的比例，至石蠟完全替換組織中的透明劑，以便包埋與切片。

(7)包埋：將液態(tài)的石蠟倒入器皿中，并用鑷子將浸好蠟的組織塊夾入器皿中，淺埋在石蠟中并展平，再倒入石蠟中包埋，待石蠟冷卻。

4.1.2免疫組織化學(xué)染色

(1)常規(guī)脫蠟：4μm厚切片90℃烘烤30min→二甲苯脫蠟，3×10min→100％、95％、85％、75％、50％的梯度酒精浸洗二甲苯至水，5×5min→自來水沖洗兩遍。

(2)檸檬酸抗原熱修復(fù)：將切片浸入預(yù)熱至沸騰的0.01m枸櫞酸鹽緩沖液(ph6.0)，繼續(xù)加熱至高壓鍋上汽后計(jì)時(shí)2min，室溫30min自然冷卻，pbs沖洗3×5min。

(3)阻斷過氧化物酶：蒸餾水新鮮配制的3％h2o2，室溫15min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗2×3min，pbs浸洗3×5min。

(4)抗原抗體反應(yīng)：滴加分裝好的抗體cxcl12和cxcr410μl，加入1000μl的一抗稀釋液(1：100比例稀釋)，抗體cxcr75μl，加入1000μl的一抗稀釋液(1：200比例稀釋)，37℃濕盒中孵育1h，pbs浸洗3×3min。滴加envisonsystem鼠兔通用二抗，室溫孵育30min，pbs充分浸洗3×3min。

(5)顯色：新鮮配制dab顯色劑(取1ml蒸餾水，加dab試劑盒中a，b，c試劑各一滴，混勻后至切片)，顯微鏡下觀察顯色效果，控制顯色時(shí)間，以特異性顯色最強(qiáng)，而背景基本不著色為準(zhǔn)，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。

(6)復(fù)染：蘇木素復(fù)染1min→自來水沖洗→1％鹽酸酒精分化→自來水沖洗兩次→飽和碳酸鋰溶液返藍(lán)→自來水沖洗。

(7)脫水、透明、封片：切片分別于濃度為75％、85％、95％、100％的酒精中脫水，4×5min→二甲苯透明，3×10min→中性樹膠封片。

(8)對照設(shè)置：所有標(biāo)本均按試劑盒說明書方法進(jìn)行，每次染色均設(shè)陽性對照和陰性對照。腸癌組織作為cxcl12陽性對照，脾臟作為cxcr4陽性對照，淋巴組織作為cxcr7陽性對照，以山羊和兔igg同型對照第一抗體作為陰性對照。

(9)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定：陽性結(jié)果呈棕黃色顆粒樣染色，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，陽性細(xì)胞數(shù)。陽性細(xì)胞數(shù)比率＜5％，5-25％，26-50％，51-75％，＞75％分別判定為0、1、2、3、4分；每張切片陽性細(xì)胞的著色強(qiáng)度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別判定為0、1、2、3分；根據(jù)兩項(xiàng)積分乘積結(jié)果作為最后綜合評分標(biāo)準(zhǔn)，最后綜合評分為0-7分，＜2分判定為陰性，2-3分判定為為低表達(dá)，4-5分判定為中表達(dá)，6-7分判定為高表達(dá)。評分由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立分別完成。

4.2elisa法檢測方法：

(1)將map和前置胎盤孕婦血漿用校準(zhǔn)品稀釋液rd6q稀釋10倍,備用；

(2)將100ul檢測稀釋液rd1-55加入到96孔板內(nèi)；

(3)將稀釋后的血清標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品100μl加入到96孔板內(nèi)，室溫下孵育2小時(shí)；

(4)用洗滌液清洗各個(gè)小孔4次，每次5分鐘；

(5)將cxcl12conjugate液體加入到96孔板內(nèi)，室溫下孵育2小時(shí)；

(6)用洗滌液清洗各個(gè)小孔4次，每次5分鐘；

(7)將200μl反應(yīng)液加入到96孔板內(nèi)，室溫下解育30分鐘，避光；

(8)加入50μl反應(yīng)終止液到各個(gè)孔內(nèi)，30分鐘內(nèi)在450mn波長下讀數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用spss20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的比較用t檢驗(yàn)，多組間的差異比較用anova單因素方差分析；方差不齊者采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性用pearson相關(guān)分析；多因素分析用多元線性回歸；roc曲線預(yù)測cxcl12的診斷價(jià)值。以p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)施例1：map和前置胎盤患者臨床資料統(tǒng)計(jì)分析

第一部分研究(sub-study1)和第二部分研究(sub-study2)的map和前置胎盤患者的臨床特征總結(jié)在表1和表2中。納入標(biāo)準(zhǔn)包括map的病理診斷或胎盤前置的臨床診斷，沒有過度侵襲的證據(jù)，胎齡在28-40周之間。

表1：sub-study1納入研究對象的臨床特征

*數(shù)據(jù)用median[range]表示,通過kruskal-wallis檢驗(yàn)得到。

數(shù)據(jù)用n[％]表示,通過卡方檢驗(yàn)分析得到。

表2：sub-study2納入研究對象的臨床特征

*數(shù)據(jù)用median[range]表示,通過kruskal-wallis檢驗(yàn)得到。

數(shù)據(jù)用n[％]表示,通過卡方檢驗(yàn)分析得到。

由表1、2可知，剖宮產(chǎn)子宮切除術(shù)的頻率(map：21[53.8％]vspp：0[0％]，p<0.001)，總計(jì)手術(shù)時(shí)間(map：152[66-518]vspp：82[59-169]min，p<0.001)和失血量(map：2000[500-40000]vspp：500[300-1600]ml，p<0.001)map組明顯高。

實(shí)施例2：免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測map和前置胎盤孕婦胎盤cxcl12/cxcr4/cxcr7表達(dá)水平

map病例包括胎盤植入部位(map植入部位，mapimplantedsite)和未植入部位的全層活檢(map-未植入部位，mapno-implantedsite)。map-未植入部位作為內(nèi)部對照，前置胎盤(pp)作為外部對照，胎盤全層活檢。

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，cxcl12/cxcr4/cxcr7主要在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)(圖1.a、d、g)，如細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(ctbs)，合胞體滋養(yǎng)細(xì)胞(stbs)和絨毛膜外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(evts)，另外還包括少量蛻膜細(xì)胞和基質(zhì)(圖2和圖3)。map孕婦胎盤組織中cxcl12/cxcr4/cxcr7的表達(dá)水平與前置胎盤比較明顯增高，侵潤深度越深cxcl12/cxcr4/cxcr7的表達(dá)越明顯(圖1.a、d、g)，同一孕婦的胎盤植入部位和非植入部位表達(dá)無差異(圖1.b、e、h)。免疫組織化學(xué)顯示，增強(qiáng)的cxcl12/cxcr4/cxcr7在滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)，表明趨化因子和受體可能在map中調(diào)節(jié)功能以運(yùn)輸更多的氧和營養(yǎng)物質(zhì)，并獲得更強(qiáng)的侵襲性。

對map病例的植入深度進(jìn)行進(jìn)一步分析時(shí)，由圖1的c、f、i可知，胎盤穿透患者的cxcl12/cxcr4/cxcr7的表達(dá)顯著高于胎盤粘連患者(p＝0.015為cxcl12；p＝0.001為cxcr4；cxcr7為p＝0.012)和前置胎盤患者(cxcl12為p<0.001；cxcr4為p<0.001；cxcr7為p<0.001)。胎盤中cxcl12/cxcr7的表達(dá)高于前置胎盤患者(cxcl12為p<0.001；cxcr7為p＝0.001)，但cxcr4除外(p＝0.079)。cxcl12在胎盤粘連患者中的表達(dá)高于前置胎盤患者(p＝0.036)。然而，cxcr4/cxcr7在胎盤粘連和前置胎盤患者之間的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(cxcr4為p＝1.000；cxcr7為p＝0.391)。即通過對map深度的詳細(xì)評估，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)趨化因子cxcl12與受體cxcr4和cxcr7在區(qū)分子宮肌層浸潤深度方面有更多的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2是為了進(jìn)一步的內(nèi)部比較，通過胎盤植入的病例來說明在植入部位和非植入部位之間的免疫組化結(jié)果。植入部位的特征在于不存在蛻膜層并且通過細(xì)胞角蛋白-7陽性反應(yīng)鑒定大量絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞evts(圖2.c)被滲透入深層子宮肌層(圖2.a-e)。非植入部位的滋養(yǎng)層中的高cxcl12表達(dá)與植入部位(圖2.f-j)一致。圖3給出胎盤植入和穿透病例中免疫組化的代表性結(jié)果。胎盤穿透比胎盤植入在胎盤深層子宮肌層中有更多的異常擴(kuò)張血管(圖3.a，f)。胎盤穿透患者的子宮肌層中evts的cxcl12表達(dá)顯示出比胎盤植入更強(qiáng)的染色(圖3.e、j)。

本發(fā)明的cxcl12染色的評分指南見圖6，cxcl12/cxcr4/cxcr7免疫組化的陽性對照和陰性對照見圖7。

實(shí)施例3：map胎盤組織中cxcl12/cxcr4/cxcr7表達(dá)水平與臨床特征的多因素分析

建立多元線性回歸模型，校正潛在干擾因素，包括年齡、孕次、產(chǎn)次、孕周、剖宮產(chǎn)次數(shù)后，發(fā)現(xiàn)cxcl12表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系更為接近，總的手術(shù)時(shí)間與cxcl12在滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)具有很高的相關(guān)性，與受體cxcr4和cxcr7相比，cxcl12表達(dá)和不同的植入深度(粘連、植入、穿透)更密切相關(guān)，見表3。

表3胎盤組織cxcl12/cxcr4/cxcr7表達(dá)水平與臨床病理特征的多因素分析

實(shí)施例4：map和前置胎盤患者血cxcl12的水平

在分析過程中，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)cxcl12的表達(dá)與胎盤入侵有顯著相關(guān)性，本實(shí)施例比較分析收集的血cxcl12在map和前置胎盤患者中的表達(dá)水平(圖4)。elisa結(jié)果顯示，map患者血中cxcl12的水平與前置胎盤比較明顯增高(2920.06[sd1172.34]vs.1965.92[sd596.98]pg/ml,p＝0.003)，見圖4.a，并且植入深度越深，cxcl12的水平越高。圖4.b顯示胎盤穿透患者的血cxcl12的水平相比胎盤粘連(4167.01[sd576.24]vs.3106.80[sd967.46]pg/ml,p＝0.009)、胎盤植入(4167.01[sd576.24]vs.1985.27[sd915.27]pg/ml,p＜0.001)和前置胎盤患者(4167.01[sd576.24]vs.1965.92[sd596.98]pg/ml,p＜0.001)均顯著增加。胎盤植入患者相比胎盤粘連(3106.81[sd967.46]vs.1985.27[sd915.27]pg/ml,p＝0.001)、前置胎盤患者(3106.81[sd967.46]vs.1965.92[sd596.98]pg/ml,p＜0.001)，血cxcl12的水平有明顯升高。

圖5顯示出血cxcl12水平與胎盤組織cxcl12的表達(dá)密切相關(guān)。根據(jù)血cxcl12升高的特點(diǎn)，因此采用roc曲線檢驗(yàn)血cxcl12預(yù)測或診斷map，靈敏度和特異度分別是78.1％和88.2％，曲線面積是0.813,95％ci:0.689，0.936。圖8是本發(fā)明篩選預(yù)測妊娠個(gè)體患有病態(tài)胎盤附著的風(fēng)險(xiǎn)和/或診斷病態(tài)胎盤附著的潛在生物標(biāo)記物的方法流程示意圖。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞cxcl12的水平與胎盤不同入侵深度有密切關(guān)系，同時(shí)其也與臨床特征具有高的相關(guān)性，通過分析血循環(huán)與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞cxcl12的表達(dá)水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)map患者循環(huán)血cxcl12的升高來源于局部胎盤組織的滋養(yǎng)細(xì)胞，綜合上述實(shí)施例的數(shù)據(jù)足以表明血cxcl12不僅具有預(yù)測或診斷胎盤侵入的能力，還能進(jìn)一步細(xì)分判斷附著的深度。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。