本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及?；鈮A譜或其檢測(cè)試劑在2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起。糖尿病時(shí)長(zhǎng)期存在的高血糖，導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止2010年，全球糖尿病患者已達(dá)2.85億，我國(guó)20歲以上成年人糖尿病患病率為9.7％，總數(shù)達(dá)到9420萬(wàn)。2型糖尿病是目前我國(guó)最常見(jiàn)的糖尿病類(lèi)型，大概超過(guò)90％的糖尿病患者都屬于2型糖尿病。2型糖尿病的全球流行是造成發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的重要原因。2型糖尿病起病隱匿，早期癥狀不明顯，作為一種可以預(yù)防的疾病，早期預(yù)測(cè)是控制2型糖尿病流行的關(guān)鍵，特別是在那些具有大量前糖或者未診斷糖尿病患者的國(guó)家如中國(guó)。近年來(lái)，有關(guān)糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的研究逐漸增多，主要針對(duì)臨床常見(jiàn)的檢測(cè)指標(biāo)如血液參數(shù)、體質(zhì)指數(shù)等進(jìn)行分析，取得了一些研究成果。但是，目前本領(lǐng)域還沒(méi)有建立起簡(jiǎn)單、可靠的2型糖尿病預(yù)測(cè)體系。為了了解2型糖尿病的生物學(xué)機(jī)制，增加臨床預(yù)測(cè)能力，發(fā)現(xiàn)能預(yù)測(cè)早期病理生理變化的新的生物標(biāo)記物就顯得尤為重要。本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)能夠有效預(yù)測(cè)2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物，建立起簡(jiǎn)單、可靠的2型糖尿病預(yù)測(cè)模型。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供?；鈮A譜或其檢測(cè)試劑在2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)中的應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種?；鈮A或其檢測(cè)試劑的用途，用于制備檢測(cè)2型糖尿病或2型糖尿病易感性的試劑或試劑盒；其中，所述的?；鈮A為酰基碳原子數(shù)≥14的偶數(shù)碳的?；鈮A。在另一優(yōu)選例中，所述?；鈮A的?；荚訑?shù)為14-22，較佳地為14-20。在另一優(yōu)選例中，所述的酰基肉堿包括?；鈮A、?；鈮A衍生物、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的?；鈮A衍生物包括羥基?；鈮A、二羧酸酰基肉堿、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的酰基肉堿選自下組：c14oh、c14:1oh、c16:1、c16:2、c18、c18oh、c18:1、c18:2、c20、c20:4、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的酰基肉堿是存在于哺乳動(dòng)物(如人)血液中的?；鈮A或在哺乳動(dòng)物(如人)血液可檢測(cè)的酰基肉堿。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)包括輔助檢測(cè)和/或早期檢測(cè)。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)為血液檢測(cè)、血漿檢測(cè)、或血清檢測(cè)。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)針對(duì)的檢測(cè)樣品包括血液樣品、血漿樣品、或血清樣品。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)包括對(duì)測(cè)試對(duì)象進(jìn)行2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)是將來(lái)自測(cè)試對(duì)象的樣品的某一?；鈮A含量a1與正常人群的相應(yīng)?；鈮A含量a0相比較，若a1顯著高于a0，則說(shuō)明測(cè)試組2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高；較佳地，所述“顯著高于”指a1/a0≥1.35，較佳地a1/a0≥1.5，更佳地a1/a0≥2.0。在另一優(yōu)選例中，所述的正常人群的數(shù)量為至少100人；較佳地至少300人；更佳地至少500人，最佳地至少1000人。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)試劑包括?；鈮A的質(zhì)譜或核磁共振檢測(cè)試 劑。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)試劑包括?；鈮A特異性抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的?；鈮A特異性抗體偶聯(lián)有或帶有可檢測(cè)標(biāo)記。在另一優(yōu)選例中，所述可檢測(cè)標(biāo)記選自下組：生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光團(tuán)、同位素或酶。在另一優(yōu)選例中，所述?；鈮A特異性抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括點(diǎn)樣于測(cè)試板上的所述檢測(cè)試劑以及使用說(shuō)明書(shū)。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括檢測(cè)配套的樣品前處理試劑以及使用說(shuō)明書(shū)。在另一優(yōu)選例中，所述的說(shuō)明書(shū)記載了檢測(cè)方法以及根據(jù)a1值預(yù)測(cè)2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括酰基肉堿的標(biāo)準(zhǔn)品。在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)準(zhǔn)品選自下組：2h9-肉堿(d9-c0)、2h3-乙酰肉堿(d3-c2)、2h3-丙酰肉堿(d3-c3)、2h3-丁酰肉堿(d3-c4)、2h9-戊酰肉堿(d9-c5)、2h3-辛酰肉堿(d3-c8)、2h9-十四酰肉堿(d9-c14)、2h3-十六酰肉堿(d3-c16)、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述2h9-肉堿(d9-c0)的濃度為152.0nmol/ml在另一優(yōu)選例中，所述2h3-乙酰肉堿(d3-c2)的濃度為38.0nmol/ml。在另一優(yōu)選例中，所述2h3-丙酰肉堿(d3-c3)的濃度為7.6nmol/ml。在另一優(yōu)選例中，所述2h3-丁酰肉堿(d3-c4)的濃度為7.6nmol/ml。在另一優(yōu)選例中，所述2h9-戊酰肉堿(d9-c5)的濃度為7.6nmol/ml。在另一優(yōu)選例中，所述2h3-辛酰肉堿(d3-c8)的濃度為7.6nmol/ml。在另一優(yōu)選例中，所述2h9-十四酰肉堿(d9-c14)的濃度為7.6nmol/ml。在另一優(yōu)選例中，所述2h3-十六酰肉堿(d3-c16)的濃度為15.2nmol/ml。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)包括氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(gc-ms/ms)檢測(cè)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-ms/ms)檢測(cè)或核磁共振法(mri)檢測(cè)。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還可以包括?；荚訑?shù)＜14的?；? 堿或其檢測(cè)試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的?；荚訑?shù)＜14的酰基肉堿選自下組b：c0、c3dc、c4、c5、c5oh、c8:1、c10、c10dc、c12dc、c12、c12oh、c12:1、3-脫羥基肉堿、3-脫氫肉堿、或其組合。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)測(cè)試的酰基肉堿為選自下組的?；鈮A：游離肉堿、短鏈酰基肉堿、長(zhǎng)鏈?；鈮A、c8:1、c10、c14oh、和c14:1oh時(shí)，若a1顯著高于a0，則說(shuō)明測(cè)試組2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)測(cè)試的酰基肉堿為選自下組的?；鈮A：肉堿前體、c10dc、c12dc、c12、c12oh、c12:1時(shí)，若a1顯著低于a0，則說(shuō)明測(cè)試組2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高，較佳地，所述“顯著低于”指a0/a1≥1.35，較佳地a0/a1≥1.5，更佳地a0/a1≥2.0。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測(cè)2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其特征在于，包括：(a)用于檢測(cè)樣品中?；鈮A含量的試劑，其中所述樣品包括血液樣品、血漿樣品、或血清樣品，所述的酰基肉堿包括?；荚訑?shù)≥14的偶數(shù)碳的?；鈮A；(b)?；鈮A標(biāo)準(zhǔn)品；(c)使用說(shuō)明書(shū)。在另一優(yōu)選例中，所述的說(shuō)明書(shū)中注明了本發(fā)明第三方面所述的方法。在另一優(yōu)選例中，所述的酰基肉堿標(biāo)準(zhǔn)品選自下組：2h9-肉堿(d9-c0)、2h3-乙酰肉堿(d3-c2)、2h3-丙酰肉堿(d3-c3)、2h3-丁酰肉堿(d3-c4)、2h9-戊酰肉堿(d9-c5)、2h3-辛酰肉堿(d3-c8)、2h9-十四酰肉堿(d9-c14)、2h3-十六酰肉堿(d3-c16)、或其組合。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測(cè)2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括步驟：(a)提供受試者的測(cè)試樣品；(b)測(cè)定所述樣品中?；鈮A的含量為a1；(c)將步驟(b)與正常人群樣品的?；鈮A含量a0相比較，若a1顯著高于a0，則說(shuō)明測(cè)試組2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高；其中，所述的?；鈮A為?；荚訑?shù)≥14的偶數(shù)碳的?；鈮A。在另一優(yōu)選例中，所述的方法可通過(guò)氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(gc-ms/ms)檢測(cè)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-ms/ms)、核磁共振(mri)檢測(cè)。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)的樣品包括血液樣品、血漿樣品、血清樣品。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說(shuō)明圖1顯示了血漿?；鈮A間的相關(guān)關(guān)系。圖2顯示了新發(fā)2型糖尿病的roc預(yù)測(cè)曲線(xiàn)。圖中，藍(lán)色線(xiàn)：傳統(tǒng)模型包括年齡、性別、地域、城鄉(xiāng)、吸煙、飲酒、體力活動(dòng)、家族史、bmi、空腹血糖、hba1c和收縮壓，auc＝0.73(95％ci0.70-0.76)；紅色線(xiàn)：傳統(tǒng)模型+特定?；鈮A，auc＝0.89(95％ci0.87-0.90)。圖3顯示了預(yù)測(cè)模型的參數(shù)相關(guān)性。其中圖3a顯示了北京與上海預(yù)測(cè)模型的參數(shù)相關(guān)性，圖3b顯示了上海與全人群預(yù)測(cè)模型的參數(shù)相關(guān)性，圖3c顯示了北京與全人群預(yù)測(cè)模型的參數(shù)相關(guān)性，圖3d顯示了全人群的lambda.min與lambda.1se預(yù)測(cè)模型的參數(shù)相關(guān)性。圖4顯示了北京、上海交叉驗(yàn)證的新發(fā)2型糖尿病roc預(yù)測(cè)曲線(xiàn)。其中圖4a顯示了北京參數(shù)預(yù)測(cè)上海新發(fā)2型糖尿病的roc曲線(xiàn)，圖4b顯示了上海參數(shù)預(yù)測(cè)北京新發(fā)2型糖尿病的roc曲線(xiàn)。圖中，模型1：傳統(tǒng)模型包括年齡、性別、城鄉(xiāng)、吸煙、飲酒、體力活動(dòng)、家族史、bmi、空腹血糖、hba1c和收縮壓；模型2、3：模型1+特定?；鈮A。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入地研究，首次發(fā)現(xiàn)，?；鈮A譜特別是長(zhǎng)鏈酰基 肉堿可以作為有效的預(yù)測(cè)2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物。本發(fā)明通過(guò)對(duì)2103名居民的長(zhǎng)達(dá)6年的追蹤研究，采用靶向代謝組學(xué)策略，確定了酰基肉堿譜特別是長(zhǎng)鏈?；鈮A與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，可以作為有效的預(yù)測(cè)2型糖尿病的標(biāo)志物，并且能夠顯著提升傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因素對(duì)于新發(fā)2型糖尿病的預(yù)測(cè)能力，為臨床診療進(jìn)行有利的指導(dǎo)。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。酰基肉堿肉堿(carnitine)是一種類(lèi)氨基酸，屬于季銨陽(yáng)離子復(fù)合物，可以通過(guò)生物合成方法從賴(lài)氨酸及蛋氨酸兩種氨基酸合成產(chǎn)生，在體內(nèi)與脂肪代謝成能量有關(guān)。研究表明，肉堿在轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線(xiàn)粒體內(nèi)膜進(jìn)行β氧化的過(guò)程中起到重要作用。酰基肉堿為肉堿代謝的中間產(chǎn)物，早期被應(yīng)用于篩選在脂肪酸氧化方面的基因缺陷。目前在肥胖和糖尿病動(dòng)物中的研究發(fā)現(xiàn)酰基肉堿可能反映輕度的脂肪酸氧化障礙和“線(xiàn)粒體應(yīng)激”。酰基肉堿根據(jù)與其結(jié)合的脂?；奶兼滈L(zhǎng)度可以分為短(碳鏈≤6)、中(碳鏈7-14)、長(zhǎng)鏈(碳鏈≥16)3類(lèi)。長(zhǎng)鏈脂酰coa在肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶i(cpt1)催化下轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)鏈?；鈮A，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線(xiàn)粒體內(nèi)膜，并在肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶ii(cpt2)催化下重新轉(zhuǎn)變?yōu)橹oa，進(jìn)入β氧化。中鏈?；鈮A的來(lái)源包括長(zhǎng)鏈脂肪酸β氧化的產(chǎn)物，或者中鏈脂肪酸脂?；漠a(chǎn)物。而短鏈?；鈮A尤其是c3和c5則是支鏈氨基酸的代謝產(chǎn)物。糖尿病糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起。糖尿病時(shí)長(zhǎng)期存在的高血糖，導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。2型糖尿病是目前我國(guó)最常見(jiàn)的糖尿病類(lèi)型，大概超過(guò)90％的糖尿病患者都屬于2型糖尿病。2型糖尿病在我國(guó)的流行不僅嚴(yán)重地?fù)p害了國(guó)民健康，同時(shí)也將會(huì)極大的影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。研究表明，糖尿病的“煙囪效應(yīng)”可導(dǎo)致70％的人死于心肌梗塞和中風(fēng)，10％～20％死于腎衰，50％和10％的患者分別患有神經(jīng)性病變和視覺(jué)受損。我國(guó)目前用于心血管和糖尿病治療的相關(guān)費(fèi)用已占約4％ gdp，并將進(jìn)一步增長(zhǎng)。如本文所用，所述的2型糖尿病患者包括臨床確診的2型糖尿病患者、口服降糖藥的患者或空腹血糖≥7.0mmol/l的患者。檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法本發(fā)明涉及定量和定性檢測(cè)人體內(nèi)?；鈮A水平。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人體內(nèi)?；鈮A水平，可以用于預(yù)測(cè)2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在本發(fā)明中，可采用多種方法對(duì)檢測(cè)試劑-樣品之間的反應(yīng)進(jìn)行定性或定量檢測(cè)，優(yōu)選的方法如氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(gc-ms/ms)檢測(cè)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms)、核磁共振法(mri)檢測(cè)。在本發(fā)明中，所述?；鈮A的檢測(cè)劑包括質(zhì)譜或核磁檢測(cè)專(zhuān)用的試劑盒。一種檢測(cè)樣品中?；鈮A含量的方法是利用上述提到的質(zhì)譜分析或核磁共振方法進(jìn)行?；鈮A的定性和定量分析。試劑盒本發(fā)明還提供了一種預(yù)測(cè)2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒?？捎糜诒景l(fā)明的試劑盒通常包括檢測(cè)試劑、各種濃度的?；鈮A標(biāo)準(zhǔn)品和/或預(yù)后判斷說(shuō)明書(shū)。其中，所述的說(shuō)明書(shū)中記載了檢測(cè)方法以及根據(jù)不同樣品測(cè)定值a1判斷aml患者預(yù)后的方法。一種優(yōu)選說(shuō)明書(shū)中記載的判斷預(yù)后方法如下：(a)提供受試者的測(cè)試樣品；(b)測(cè)定所述樣品中的?；鈮A含量為a1；(c)將步驟(b)與正常人群樣品的?；鈮A含量a0相比較，若a1顯著高于a0，則說(shuō)明測(cè)試組2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高；較佳地，所述“顯著高于”指a1/a0≥1.35，較佳地a1/a0≥1.5，更佳地a1/a0≥2.0。通常，所述的正常人群的數(shù)量為至少100人；較佳地至少300人；更佳地至少500人，最佳地至少1000人。正常人群取自200-2000人的人群。一種典型的本發(fā)明的試劑盒可用于檢測(cè)人血液樣品、血漿樣品。其中，所述的血液或血漿樣品可來(lái)自于外周血。本發(fā)明中部分相關(guān)的酰基肉堿包括下表所示的種類(lèi)：本發(fā)明所用?；鈮A標(biāo)準(zhǔn)品包括下表所示的種類(lèi)：2h9-carnitin(d9-c0)2h9-肉堿2h3-acetylcarnitin(d3-c2)2h3-乙酰肉堿2h3-propionylcarnitine(d3-c3)2h3-丙酰肉堿2h3-butyrylcarnitine(d3-c4)2h3-丁酰肉堿2h9-valerylcarnitine(d9-c5)2h9-戊酰肉堿2h3-octanoylcarnitine(d3-c8)2h3-辛酰肉堿2h9-myristoylcarnitine(d9-c14)2h9-十四酰肉堿2h3-palmitoylcarnitine(d3-c16)2h3-十六酰肉堿本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：(a)酰基肉堿能夠顯著提升傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因素對(duì)于新發(fā)2型糖尿病的預(yù)測(cè)能力。(b)?；鈮A在2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中可以作為新的早期生物標(biāo)記物。(c)地域交叉驗(yàn)證表明，含酰基肉堿的檢測(cè)模型具有通用性，可以用于不同地域的2型糖尿病預(yù)測(cè)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。通用方法1.調(diào)查對(duì)象實(shí)施例中的調(diào)查對(duì)象為北京和上海的50-70歲社區(qū)居民，對(duì)上述對(duì)象展開(kāi)追蹤研究，目的是研究環(huán)境、遺傳因素及其交互作用在代謝性疾病發(fā)生發(fā)展中 的作用。在2005年，通過(guò)多級(jí)抽樣方法招募了3289名調(diào)查對(duì)象。人口學(xué)資料、生活方式和健康信息采用標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)卷收集。體重、身高和血壓采用標(biāo)準(zhǔn)化體檢采集，并空腹采集外周靜脈血。在2011年，全體調(diào)查對(duì)象受邀參加6年追蹤調(diào)查。調(diào)查問(wèn)卷和體檢過(guò)程在基線(xiàn)調(diào)查的基礎(chǔ)上略作修改?？崭寡?、糖化血紅蛋白(hba1c)和胰島素的檢測(cè)均采用常規(guī)檢測(cè)方法。在3289名基線(xiàn)調(diào)查對(duì)象中有760名失訪(fǎng)(23.1％)，其中554名無(wú)法聯(lián)系上，206名拒絕參加。因此，總共有2529名調(diào)查對(duì)象參加了追蹤調(diào)查。在排除了331名基線(xiàn)糖尿病患者和95名無(wú)?；鈮A數(shù)據(jù)的調(diào)查對(duì)象后，本發(fā)明共納入2103名調(diào)查對(duì)象。2.倫理審查本項(xiàng)研究已通過(guò)中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院營(yíng)養(yǎng)科學(xué)研究所倫理委員會(huì)審查，所有調(diào)查對(duì)象均簽署了知情同意書(shū)。3.?；鈮A譜檢測(cè)實(shí)施例中的血漿?；鈮A譜采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)。穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)(nsk-bset)購(gòu)于cambridgeisotopelaboratories，inc。高效液相色譜級(jí)的乙腈和甲醇購(gòu)于merckkgaa。肉堿鹽酸鹽(c0)，乙酰肉堿鹽酸鹽(c2)和乙酰氯購(gòu)于sigma-aldrich。1-丁醇購(gòu)于cnwtechnologiesgmbh。梯度稀釋內(nèi)標(biāo)溶液后獲得校正曲線(xiàn)[2h9-carnitin(d9-c0)，2h3-acetylcarnitin(d3-c2)，2h3-propionylcarnitine(d3-c3)，2h3-butyrylcarnitine(d3-c4)，2h9-valerylcarnitine(d9-c5)，2h3-octanoylcarnitine(d3-c8)，2h9-myristoylcarnitine(d9-c14)和2h3-palmitoylcarnitine(d3-c16)](表1)。樣品前處理方法參考了vreken等人的方法。血漿樣品和內(nèi)標(biāo)溶液混合物離心后(15min，16000rcf，4℃)，上清液氮吹(45℃)。干燥后重新溶解于新鮮配制的1-丁醇/乙酰氯溶液(9:1，v/v)進(jìn)行丁酯衍生化反應(yīng)(65℃，15min)，再次氮吹(45℃)。干燥物重新溶解于乙腈/水溶液(4:1，v/v)并且離心(15min，16000rcf，4℃)，上清液用于儀器上樣檢測(cè)。色譜分離采用配置了watershsst3色譜柱(3.0×100mm，3.5μm)的agilent1260hplc系統(tǒng)。質(zhì)譜檢測(cè)采 用agilent6410bqqq質(zhì)譜儀，esi+模式。agilentmasshunter軟件(versionb.03.01)用于儀器控制和數(shù)據(jù)采集。表1同位素內(nèi)標(biāo)的線(xiàn)性和校正曲線(xiàn)。血漿酰基肉堿濃度根據(jù)相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的校正曲線(xiàn)計(jì)算獲得。如果沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)，則采用色譜相鄰或者結(jié)構(gòu)相近的同位素內(nèi)標(biāo)的校正曲線(xiàn)進(jìn)行計(jì)算(表2)。表2同位素內(nèi)標(biāo)檢測(cè)?；鈮A譜的動(dòng)態(tài)mrm參數(shù)。4.2型糖尿病定義新發(fā)2型糖尿病定義為至少包含下述一項(xiàng)：1)自報(bào)醫(yī)生診斷患有糖尿?。?)自報(bào)服用降血糖藥物；3)在追蹤調(diào)查中空腹血糖≥7.0mmol/l。5.統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)協(xié)方差分析比較新發(fā)2型糖尿病患者和對(duì)照的基線(xiàn)血漿?；鈮A和代謝特征。血漿酰基肉堿和胰島素通過(guò)自然對(duì)數(shù)變換以趨近正態(tài)分布。自然對(duì)數(shù)變換后的?；鈮Az值用于計(jì)算短(碳鏈≤6)、中(碳鏈7-14)、長(zhǎng)鏈(碳鏈≥16)3類(lèi)的濃度。等級(jí)相關(guān)分析用于計(jì)算酰基肉堿之間，以及?；鈮A與空腹血糖，hba1c和胰島素的相關(guān)性，p值控制了性別、年齡、地域和城鄉(xiāng)。logistic回歸模型用于分析2型糖尿病的相對(duì)危險(xiǎn)度，并控制了基線(xiàn)的年齡、性別、地域、城鄉(xiāng)、吸煙、飲酒、體力活動(dòng)、家族史、bmi、空腹血糖、hba1c和收縮壓。彈性網(wǎng)絡(luò)回歸模型(elasticnetregressionmodel)(采用r軟件glmnet包)用于構(gòu)建2型糖尿病預(yù)測(cè)模型(hzou,thastie.regularizationandvariableselectionviatheelasticnet.jrstatistsocserb2005；67(2):301-320.)。由于采用軟件預(yù)設(shè)的lambda.1se(更保守)和lambda.min(更優(yōu)化)兩個(gè)參數(shù)構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型的結(jié)果類(lèi)似，在本發(fā)明中發(fā)明人僅報(bào)告了lambda.min的結(jié)果。為了獲得不偏倚的預(yù)測(cè)結(jié)果，發(fā)明人采用了10倍交叉驗(yàn)證。曲線(xiàn)下面積(auc)用于評(píng)估2型糖尿病的預(yù)測(cè)能力。此外，發(fā)明人還采用了區(qū)域交叉驗(yàn)證來(lái)評(píng)估預(yù)測(cè)過(guò)程的穩(wěn)健性。統(tǒng)計(jì)分析采用sasv9.3和rv3.0軟件。雙側(cè)p<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。多重校正采用bonferroni校正方法。實(shí)施例1基線(xiàn)特征研究在6年追蹤過(guò)程中，共有507名(24.1％)新發(fā)2型糖尿病患者。在新發(fā)糖尿病患者和對(duì)照中進(jìn)行了基線(xiàn)特征和血漿?；鈮A濃度的比較(表3)。與對(duì)照相比，新發(fā)糖尿病患者中北京居民和有糖尿病家族史的更多。他們具有更高的基線(xiàn)bmi，收縮壓，空腹血糖，hba1c和胰島素(p<0.05)。在基線(xiàn)血漿?；鈮A方面，新發(fā)糖尿病患者具有更高的c0，c3dc，c4，c5，c5oh，c8:1，c10，c14oh，c14:1oh，c16:1，c16:2，c18，c18oh，c18:1，c18:2，c20和c20:4?；鈮A，同時(shí)具有更低的3-dehydroxycarnitine，3-dehydrocarnitine，c7dc，c10dc，c12，c12oh和c12:1酰基肉堿。表3新發(fā)2型糖尿病病例-對(duì)照的基線(xiàn)特征和血漿?；鈮A譜比較。數(shù)據(jù)為均值±sd。p值控制了性別、年齡、地域和城鄉(xiāng)。*數(shù)據(jù)沒(méi)有控制它本身。數(shù)據(jù)為幾何均數(shù)(95％ci)。校正后顯著。實(shí)施例2?；鈮A和代謝特征基線(xiàn)?；鈮A之間的相關(guān)性見(jiàn)圖1。盡管多數(shù)?；鈮A之間都有相關(guān)性，相關(guān)性最高的酰基肉堿(r>0.7)為中長(zhǎng)鏈種類(lèi)。有趣的是，當(dāng)分析基線(xiàn)?；鈮A與代謝特征間的相關(guān)性時(shí)，發(fā)現(xiàn)其與追蹤調(diào)查的空腹血糖相關(guān)性強(qiáng)于與基線(xiàn)空腹血糖的相關(guān)性(表4)。同樣，基線(xiàn)?；鈮A與空腹血糖6年變化的相關(guān)性也強(qiáng)于與基線(xiàn)空腹血糖的相關(guān)性。相反，基線(xiàn)?；鈮A與hba1c和胰島素的相關(guān)性在基線(xiàn)調(diào)查和追蹤調(diào)查類(lèi)似。表4基線(xiàn)?；鈮A與空腹血糖、hba1c和胰島素的相關(guān)性。控制了性別，年齡，地域和城鄉(xiāng)。*p<0.001；實(shí)施例32型糖尿病預(yù)測(cè)模型在6年追蹤過(guò)程中，2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與c0，c3dc，中鏈(c8:1，c10，c14oh， c14:1oh)和長(zhǎng)鏈(c16:1，c16:2，c18，c18oh，c18:1，c18:2，c20，c20:4)酰基肉堿正相關(guān)，與肉堿前體(3-dehydroxycarnitine，3-dehydrocarnitine)，中鏈二羧酸(c10dc，c12dc)和c12(c12，c12oh，c12:1)酰基肉堿負(fù)相關(guān)(表5)。當(dāng)酰基肉堿根據(jù)鏈長(zhǎng)分類(lèi)后，僅長(zhǎng)鏈?；鈮A與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)(p<0.001)。表5單個(gè)酰基肉堿與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系?？刂屏四挲g、性別、地域、城鄉(xiāng)、吸煙、飲酒、體力活動(dòng)、家族史、bmi、空腹血糖、hba1c和收縮壓。*bonferroni校正后顯著。預(yù)測(cè)模型由彈性網(wǎng)絡(luò)回歸方法構(gòu)建。在預(yù)測(cè)模型中，風(fēng)險(xiǎn)因素每增加一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)模型的2型糖尿病相對(duì)危險(xiǎn)度為2.48(95％ci2.20，2.78)，而全模型(包含了傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因素和特定?；鈮A)的2型糖尿病相對(duì)危險(xiǎn)度為9.41(95％ci7.62，11.62)，其中6.94(95％ci5.73，8.41)歸因于酰基肉堿(表6)。全模型的參數(shù)羅列在表7中。在roc分析中(圖2)，曲線(xiàn)下面積(auc)從傳統(tǒng)模型的0.73(95％ci0.70-0.76)增加到全模型的0.89(95％ci0.87-0.90)。表6新發(fā)2型糖尿病的預(yù)測(cè)模型。表7新發(fā)2型糖尿病預(yù)測(cè)模型的參數(shù)均值。實(shí)施例4地域交叉驗(yàn)證在本實(shí)施例中，通過(guò)地域交叉驗(yàn)證方法，對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)行驗(yàn)證。在本實(shí)施例中，采用樣品和數(shù)據(jù)是分別來(lái)于上海(n＝1110)和北京(n＝993)的樣品(樣品為6年前預(yù)采集的血液樣品)，其中包括的正常人和6年間經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)2型糖尿病患者的數(shù)量分別為909：201(上海)和687：306(北京)。地域交叉驗(yàn)證用于檢驗(yàn)預(yù)測(cè)模型是否能應(yīng)用于其他地域。在根據(jù)地域分層后，運(yùn)用彈性網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建的北京和上海預(yù)測(cè)全模型進(jìn)行交叉驗(yàn)證(圖4)。其中用上海全模型預(yù)測(cè)北京2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的auc為0.82(95％ci0.79-0.84)，用北京全模型預(yù)測(cè)上海2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的auc為0.87(95％ci0.85-0.90)。比較預(yù)測(cè)模型的參數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)上海、北京或全人群的參數(shù)較為一致，運(yùn)用lambda.min或lambda.1se參數(shù)的預(yù)測(cè)模型也較為一致(圖3)。下表總結(jié)了部分?；鈮A含量變化與2型糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)間的關(guān)系注：顯著上升是指將來(lái)自測(cè)試對(duì)象的樣品的某一?；鈮A含量a1與正常人群的相應(yīng)酰基肉堿含量a0相比較，不僅a1大于閾值且a1/a0≥1.35，較佳地a1/a0≥1.5，更佳地a1/a0≥2.0。討論本發(fā)明通過(guò)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)?；鈮A譜，發(fā)現(xiàn)特定?；鈮A(尤其是長(zhǎng)鏈種類(lèi))與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，并且能夠顯著提升傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因素(如bmi和空腹血糖等)對(duì)于新發(fā)2型糖尿病的預(yù)測(cè)能力?；诰_性較高的靶向代謝組學(xué)手段，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)?；鈮A能夠預(yù)測(cè)2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在預(yù)測(cè)模型中加入特定酰基肉堿，能夠顯著提升傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因素(如bmi和空腹血糖等)對(duì)于2型糖尿病的預(yù)測(cè)能力(aucs:0.89vs.0.73，圖2)。因此，作為體內(nèi)檢測(cè)線(xiàn)粒體fao障礙的簡(jiǎn)單替代方法，特定酰基肉堿有可能作為預(yù)測(cè)2型糖尿病發(fā)病的早期生物標(biāo)記物。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)長(zhǎng)鏈?；鈮A均與新發(fā)2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)。長(zhǎng)鏈脂肪酸主要在線(xiàn)粒體內(nèi)進(jìn)行氧化。長(zhǎng)鏈脂酰coa在肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶i(cpt1)催化下轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)鏈?；鈮A，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線(xiàn)粒體內(nèi)膜，并在肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶ii(cpt2)催化下重新轉(zhuǎn)變?yōu)橹oa，進(jìn)入β氧化。作為β氧化的早期指標(biāo)，長(zhǎng)鏈酰基肉堿的累積可能反映了較為嚴(yán)重的fao障礙和線(xiàn)粒體過(guò)載。此外，長(zhǎng)鏈?；鈮A還能調(diào)節(jié)心臟組織的鈣外流和腎臟細(xì)胞herg通道。因此，除了作為線(xiàn)粒體功能障礙的指標(biāo)，長(zhǎng)鏈酰基肉堿可能還有其他生理功能。與長(zhǎng)鏈?；鈮A不同，中鏈酰基肉堿與糖尿病的關(guān)系并不一致。可能的解釋為中鏈?；鈮A的來(lái)源包括長(zhǎng)鏈脂肪酸β氧化的產(chǎn)物，或者中鏈脂肪酸脂酰 化的產(chǎn)物。事實(shí)上，以前的某些研究中觀察到了中鏈脂肪酸具有促炎性作用，但在另一些研究中則觀察到了中鏈脂肪酸的抗菌和抗炎作用。因此，中鏈?；鈮A在代謝紊亂疾病中所起的作用仍有待闡明。另一方面，左旋肉堿前體3-dehydroxycarnitine和3-dehydrocarnitine，在本發(fā)明中與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)。另一項(xiàng)有趣發(fā)現(xiàn)是奇數(shù)碳與偶數(shù)碳的二羧酸酰基肉堿與2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)不同。丙二酰肉堿(c3dc)是反映丙二酰coa水平的指標(biāo)。丙二酰coa可以通過(guò)抑制線(xiàn)粒體cpt1和脂肪酸氧化來(lái)調(diào)控哺乳動(dòng)物的能量代謝。值得注意的是，胰島素抵抗的肥胖和2型糖尿病患者具有較高的肌肉丙二酰coa水平。然而，目前仍不清楚丙二酰coa的積累(表現(xiàn)為c3dc水平升高)，是否體現(xiàn)了機(jī)體對(duì)于過(guò)量β氧化和線(xiàn)粒體應(yīng)激的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而通過(guò)抑制cpt1活性來(lái)實(shí)現(xiàn)底物從脂肪酸向葡萄糖轉(zhuǎn)變，進(jìn)而緩解脂肪誘導(dǎo)的胰島素抵抗。盡管如此，本發(fā)明中的c3dc與糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的正相關(guān)關(guān)系仍提示了丙二酰coa在糖尿病發(fā)病過(guò)程中的作用。與奇數(shù)碳不同，偶數(shù)碳二羧酸來(lái)源于脂肪酸的ω氧化，并進(jìn)一步進(jìn)入β氧化。干預(yù)研究發(fā)現(xiàn)，癸二酸和十二烷二酸能夠改善2型糖尿病患者的血糖控制和能量利用。與這些研究一致，本發(fā)明觀察到的c10dc和c12dc?；鈮A與2型糖尿病發(fā)病負(fù)相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步支持了癸二酸和十二烷二酸對(duì)于2型糖尿病的改善作用。本發(fā)明采用的彈性網(wǎng)絡(luò)回歸模型在高維數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性方面具有優(yōu)勢(shì)。此外，本發(fā)明結(jié)果在北京和上海這兩個(gè)生活方式和環(huán)境因素均不同的大城市進(jìn)行了交叉驗(yàn)證?？傊景l(fā)明發(fā)現(xiàn)?；鈮A能夠顯著提升傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因素對(duì)于新發(fā)2型糖尿病的預(yù)測(cè)能力，提示?；鈮A在2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中可以作為新的早期生物標(biāo)記物。這表明，基于本發(fā)明特定酰基肉堿的含量，可以輔助性地預(yù)先評(píng)估對(duì)象患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12