專利名稱：：一種植入式人工肝臟的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)、生物醫(yī)學(xué)與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及組織工程與人工器官技術(shù)，具體涉及一種植入式人工肝臟。
背景技術(shù)：
：原位肝移植是迄今公認(rèn)治療各種原因所致的終未期肝功能衰竭唯一有效方法，但由于嚴(yán)重的供肝短缺，大量患者在等待肝移植的過程中死去。肝細(xì)胞移植因價廉、移植細(xì)胞易獲取及凍存方便、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，正日益被人們所關(guān)注(1，2)。最近的研究表明，利用組織工程和干細(xì)胞技術(shù)，可極大的提高移植細(xì)胞的再生和功能發(fā)揮，拓展肝細(xì)胞治療的再生醫(yī)學(xué)空間(3)。目前國內(nèi)外多采用高分子合成的三維多孔可降解生物支架結(jié)合不同來源的細(xì)胞(包括動物或人胚胎干細(xì)胞、骨髓或臍血等來源的成體干細(xì)胞、胎兒或成人原代肝細(xì)胞等)直接進(jìn)行體內(nèi)移植實驗，以期重建人工肝臟(或肝組織)來替代受損的宿主肝臟功能。但目前常用的組織工程支架是各項功能基本同性的多孔材料，整個材料的化學(xué)性質(zhì)和基本物理性能大致均一，沒有特異的生物相應(yīng)性，難以誘導(dǎo)微血管生成并支持移植細(xì)胞的長期存活與肝組織再生，致使植入細(xì)胞無法最終替代器官功能。如能找到一種既可促進(jìn)移植細(xì)胞再生組織，又能迅速誘導(dǎo)再生組織內(nèi)微血管生成并長期支持再生組織存活并發(fā)揮功能，各種原因所致的急慢性肝功能衰竭治療具有極其重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容為克服植入細(xì)胞生物支架復(fù)合體自身缺乏微血管，難以得到外周血液循環(huán)的支持，本發(fā)明設(shè)計了一個全新的模擬人體肝臟結(jié)構(gòu)的植入式人工肝臟。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是-本發(fā)明的一種植入式人工肝臟，它包括聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套，l片以上的三維多孔支架，聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸管封口；三維多孔支架裝在聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套中，聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套兩端用聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸管封口。所述的聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套和聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸管封口材料為經(jīng)生物化和抗凝血處理的聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸材料。所述的植入式人工肝臟的直徑為5-20mm,長度為10-50mm。所述的聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸管封口直徑為1-4mm。所述的三維多孔支架材料是分子量為5—10萬單位的聚乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)、左旋聚乳酸(PLLA)或藻酸鹽，多孔支架為2—10片。所述的多孔支架直徑為4一19ran。所述的多孔支架厚度徑為l一4mm。所述的多孔支架的孔徑為50—500nm。所述的多孔支架設(shè)有特定管腔1-IO個，管腔結(jié)構(gòu)即為孔徑200-500nm的圓形管腔，該管腔是在三維支架中直接激光打孔，無其它材料，主要用于提供內(nèi)皮細(xì)胞生長和誘導(dǎo)微血管生成。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的模擬人體肝臟結(jié)構(gòu)的植入式人工肝臟，可克服組織工程肝的長期血管化難題、促進(jìn)移植組織工程肝的長期成活與功能發(fā)揮。植入式人工肝臟是將干細(xì)胞預(yù)種植至三維可降解生物支架(如PLLA、PLGA、藻酸鹽等)，該支架預(yù)先經(jīng)肝素與膠原生物修飾并包埋能促進(jìn)微血管再生的細(xì)胞因子(如微血管生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子和胰島素樣生長因子等)，并預(yù)種植內(nèi)皮細(xì)胞于該支架特定管道(模擬肝組織中央靜脈)內(nèi)，最大限度模擬肝小葉結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植入干細(xì)胞定向分化至成熟肝細(xì)胞，誘導(dǎo)組織工程肝的微血管再生。同時在三維生物支架外包被生物相容性極佳的生物材料封套，模擬肝包膜結(jié)構(gòu)，該封套與支架之間形成小腔隙，以供血液循環(huán)通過組織工程支架，促進(jìn)包膜內(nèi)工程肝的血管再生并最終生成人工肝臟以替代宿主受損肝臟功能。利用該發(fā)明進(jìn)行移植治療急性肝功能衰竭(AHF)具有組織再生能力強(qiáng)，再生肝組織可長期成活并有效替代宿主受損肝臟功能，為組織工程干細(xì)胞移植治療各種原因所致的急性肝功能衰竭提供新的途徑。圖1為本發(fā)明的實施例的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明的實施例1的兩組細(xì)胞的生長曲線圖。圖3為本發(fā)明的實施例1的白蛋白(ALB)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)結(jié)果圖。圖4為本發(fā)明的實施例1的尿素(Urea)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)結(jié)果圖。圖5為本發(fā)明的實施例2的逆轉(zhuǎn)錄PCR的結(jié)果圖。圖6為本發(fā)明的實施例2的免疫印跡的結(jié)果圖。圖7為本發(fā)明的實施例2的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測白蛋白(ALB)的結(jié)果圖。圖8為本發(fā)明的實施例2的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測尿素(Urea)的結(jié)果圖。具體實施例方式以下通過實施例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行描述如附圖1所示，本發(fā)明包括包括聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套l，1片以上的三維多孔支架2，聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸管封口3;三維多孔支架2裝在聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套1中，聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套1兩端用聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸管封口3。具體實施例1(植入式人工肝臟和單層貼壁法培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞的比較)聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套1長15mm，三維多孔支架2材料為PLGA，PLGA分子量為7萬單位。多孔支架2直徑9mm,厚度為3mm,孔徑為100—200nm，設(shè)有特定管腔(管腔結(jié)構(gòu)即為孔徑200-500mn的圓形管腔，該管腔是在三維支架中直接激光打孔，無其它材料，主要用于提供內(nèi)皮細(xì)胞生長和誘導(dǎo)微血管生成。)6—8個，孔徑為400nm，4片多孔支架2組疊而成。聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸管封口3直徑為2mm。按常規(guī)分離得到的大鼠原代肝細(xì)胞，以10、ells/ml密度接種至含15。/。FBS的DMEM的培養(yǎng)基中，用注射器將細(xì)胞注入PLGA三維多孔支架中，每片支架的細(xì)胞量為106cells，在常溫下以1000g的離心力離心5分鐘，使細(xì)胞均勻分散至支架。在37。C、5%(:02條件下培養(yǎng)過夜使細(xì)胞粘附于多孔支架，然后在無菌條件下將含有細(xì)胞的4片多孔支架層層疊起，裝入聚乙醇酸封套后，在37°C、5%(:02條件下繼續(xù)培養(yǎng)。每間隔2—3天置換新鮮培養(yǎng)基，共分化培養(yǎng)2周。將同批分離的大鼠肝細(xì)胞以10^ells/ml接種至培養(yǎng)瓶進(jìn)行單層貼壁培養(yǎng)，每瓶細(xì)胞量為106cdlS，培養(yǎng)條件與上述相同。各重復(fù)3組，每隔2天分別收集人工肝臟內(nèi)和單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)胞支架復(fù)合體及培養(yǎng)液上清，檢測肝細(xì)胞代謝功能和分析生長曲線。結(jié)果如圖2、圖3、圖4:圖2表示了兩組細(xì)胞的生長曲線結(jié)果結(jié)果顯示，人工肝臟組大鼠原代肝細(xì)胞成活時間達(dá)60天，而對照組僅存活28天。圖3表示白蛋白(ALB)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)結(jié)果結(jié)果顯示人工肝臟組分泌的白蛋白明顯高于對照組。圖4表示尿素(Urea)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)結(jié)果結(jié)果顯示人工肝臟組合成的尿素明顯高于對照組。由圖2—4表明，相比普通單層貼壁培養(yǎng)法，利用植入式人工肝臟進(jìn)行肝細(xì)胞培養(yǎng)可明顯延長原代肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)時間，培養(yǎng)肝細(xì)胞的代謝功能也明顯高于對照組。說明了本發(fā)明所具有的明顯優(yōu)勢。具體實施例2(植入式人工肝臟和單層貼壁法分化大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)至肝細(xì)胞的比較)聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套1長15mm，三維多孔支架2材料為PLGA，PLGA分子量為7萬單位。多孔支架2直徑9mm，厚度為3mm,孔徑為100—200nm，設(shè)有特定管腔6—8個，孔徑為400nm，4片多孔支架2組疊而成。聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸管封口3直徑為2mm。按常規(guī)分離得到的大鼠BMSCs按107cdlS/ml密度接種至含肝細(xì)胞生長因子的IMDM(購自Invitrogen公司)培養(yǎng)基中，用注射器將細(xì)胞注入PLGA三維多孔支架中，每片支架的細(xì)胞量為106cdlS，在常溫下以1000g的離心力離心5分鐘，使細(xì)胞均勻分散至支架。在37。C、5%<:02條件下培養(yǎng)過夜使細(xì)胞粘附于多孔支架，然后在無菌條件下將含有細(xì)胞的4片多孔支架層層疊起，裝入聚乙醇酸封套后，在37。C、5。/。C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)。每間隔一天置換新鮮培養(yǎng)基，共分化培養(yǎng)3周。將同批分離的BMSCs以10^dls/ml接種至培養(yǎng)瓶進(jìn)行單層貼壁培養(yǎng)，每瓶細(xì)胞量為106cdlS，培養(yǎng)條件與上述相同。各重復(fù)3組，每隔一周分別收集人工肝臟內(nèi)和單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)胞支架復(fù)合體及培養(yǎng)液上清，檢測肝細(xì)胞的特異性功能基因及表達(dá)產(chǎn)物，比較兩組分化成肝細(xì)胞的時間與分化肝細(xì)胞的功能。結(jié)果如下如圖5、圖6、圖7、圖8::圖5表示了逆轉(zhuǎn)錄PCR的結(jié)果第一道為空白對照，2—4道為植入式人工肝組分化1一3周，5—7道為單層貼壁組分化1一3周，8道陽性對照，9道為DNA標(biāo)記。結(jié)果顯示人工肝組在一周后即表達(dá)ALB(白蛋白)和AFP(甲胎蛋白)，而對照組在第二周才表達(dá)。圖6表示了免疫印跡的結(jié)果第一道為空白對照，2—4道為植入式人工肝組分化l一3周，5—7道為單層貼壁組分化1一3周，8道陽性對照，9道為DNA標(biāo)記。結(jié)果顯示人工肝組在一周后即表達(dá)ALB和細(xì)胞色素P450，而對照組在第二周才表達(dá)。圖7表示了酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測白蛋白(ALB)的結(jié)果結(jié)果顯示人工肝組在一周后即檢測到ALB，而對照組在第二周檢測到，且人工肝臟組明顯高于對照。圖8表示了酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測尿素(Urea)的結(jié)果結(jié)果顯示人工肝組在一周后即檢測到尿素，而對照組在第二周檢測到，且人工肝臟組明顯高于對照。由圖5—8表明，相比普通單層貼壁分化培養(yǎng)法，利用植入式人工肝臟進(jìn)行肝細(xì)胞分化可明顯縮短分化時間，分化肝細(xì)胞的代謝功能明顯比前者強(qiáng)。說明了本發(fā)明所具有的明顯優(yōu)勢。具體實施例3(植入式人工肝臟和直接注射法進(jìn)行細(xì)胞移植治療AHF大鼠的比較)聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套1長15mm,三維多孔支架2材料為PLGA，PLGA分子量為7萬單位。多孔支架2直徑9mm，厚度為3mm，孔徑為100—200nm，設(shè)有特定管腔6—8個，孔徑為400nm，4片多孔支架2組疊而成。聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸管封口3直徑為2mm。按常規(guī)分離得到的大鼠BMSCs按107cellS/ml密度接種至含肝細(xì)胞生長因子的IMDM(購自Invitrogen公司)培養(yǎng)基中，用注射器將細(xì)胞注入PLGA三維多孔支架中，每片支架的細(xì)胞量為106Cells。在常溫下以1000g的離心力離心5分鐘，使細(xì)胞均勻分散至支架。在37。C、5WC02條件下培養(yǎng)過夜使細(xì)胞粘附于多孔支架，然后在無菌條件下將含有細(xì)胞的4片多孔支架層層疊起，裝入聚乙醇酸封套后，在37。C、5。/。C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)。每間隔一天置換新鮮培養(yǎng)基，7天后將收集到的大鼠內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)聚乙醇酸封口管注入聚乙醇酸封套與多孔支架之間的腔隙，并將該人工肝臟植入至經(jīng)肝大部切除所致的急性肝衰竭模型小鼠腹腔，同時將腸系膜動、靜脈分支連接到人工肝臟的兩端。將同批收集到的等量(4xl06cellS)大鼠BMSCs，在相同的肝細(xì)胞分化培養(yǎng)條件下，在體外單層貼壁分化培養(yǎng)7天，然后收集分化細(xì)胞，采用目前常規(guī)的經(jīng)脾注射移植法移植至AHF小鼠脾內(nèi)作為對照組。各重復(fù)3組，移植手術(shù)后每隔2天觀察移植小鼠的生命體征和肝功能。比較兩組對急性肝衰竭小鼠的治療作用。結(jié)果如下表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表l結(jié)果顯示，相比普通細(xì)胞移植法，植入式人工肝臟組可明顯延長AHF小鼠壽命，明顯改善AHF小鼠的肝功能。說明本發(fā)明在治療急性肝衰竭小鼠的實驗研究中所具有的獨(dú)特優(yōu)勢。綜上所述本發(fā)明設(shè)計將干細(xì)胞預(yù)種植至經(jīng)肝素與膠原生物修飾的三維可降解生物支架，并預(yù)種植內(nèi)皮細(xì)胞于該支架特定管道(模擬肝組織中央靜脈)內(nèi)，最大限度模擬肝小葉結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植入干細(xì)胞定向分化至成熟肝細(xì)胞，誘導(dǎo)組織工程肝的長期微血管化并最終生成人工肝臟以替代宿主受損肝臟功能。利用該發(fā)明進(jìn)行移植治療急性肝功能衰竭(AHF)具有組織再生能力強(qiáng)，再生肝組織可長期成活并有效替代宿主受損肝臟功能，為組織工程干細(xì)胞移植治療各種原因所致的急性肝功能衰竭提供新的途徑。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1、一種植入式人工肝臟，其特征在于它包括聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套，1片以上的三維多孔支架，聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸管封口；三維多孔支架裝在聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套中，聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套兩端用聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸管封口。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種植入式人工肝臟，其特征在于所述的聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套和聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸管封口材料為經(jīng)生物化和抗凝血處理的聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸材料。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種植入式人工肝臟，其特征在于所述的植入式人工肝臟的直徑為5-20腿，長度為10-50mm。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種植入式人工肝臟，其特征在于所述的聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸管封口直徑為1-4mm。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種植入式人工肝臟，其特征在于所述的三維多孔支架材料是分子量為5—10萬單位的聚乳酸/乙醇酸共聚物、左旋聚乳酸或藻酸鹽，多孔支架為2—10片。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種植入式人工肝臟，其特征在于所述的多孔支架直徑為4—19mm。7、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種植入式人工肝臟，其特征在于所述的多孔支架厚度徑為l一4mm。8、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種植入式人工肝臟，其特征在于所述的多孔支架的孔徑為50—500nm。9、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種植入式人工肝臟，其特征在于所述的多孔支架設(shè)有特定管腔1-10個，是孔徑為200-500nm的圓形管腔，所述管腔是在三維支架中激光打孔得到。全文摘要本發(fā)明公開了一種植入式人工肝臟，它包括聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套，1片以上的三維多孔支架，聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸管封口；三維多孔支架裝在聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套中，聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套兩端用聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸管封口。本發(fā)明的有益之處在于本發(fā)明最大限度模擬肝小葉結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植入干細(xì)胞定向分化至成熟肝細(xì)胞，誘導(dǎo)組織工程肝的微血管再生；同時在三維生物支架外包被生物相容性極佳的生物材料封套，模擬肝包膜結(jié)構(gòu)，該封套與支架之間形成小腔隙，以供血液循環(huán)通過組織工程支架，促進(jìn)包膜內(nèi)工程肝的血管再生并最終生成人工肝臟以替代宿主受損肝臟功能。文檔編號A61L27/38GK101428154SQ20081016261公開日2009年5月13日申請日期2008年12月4日優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日發(fā)明者君李,李蘭娟申請人:浙江大學(xué)