專利名稱：一種人工肝生物反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人工肝支持系統(tǒng)的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種以納米纖維材料作為肝細(xì)胞培養(yǎng)的人工肝生物反應(yīng)器。
背景技術(shù)：
人工肝臟是借助體外機(jī)械，化學(xué)或生物性裝置，暫時(shí)或部分替代肝臟功能，從而協(xié)助治療肝臟功能不全或相關(guān)疾病。人工肝作為肝功能不全、肝衰竭或相關(guān)疾病的有效輔助治療設(shè)備在臨床中具有極大應(yīng)用潛力。按照人工肝組成及性質(zhì)可以分成三類:非生物型人工肝、生物型人工肝、混合型人工肝。非生物型人工肝治療常用的方法是血液透析、血漿或全血灌流、血液置換和濾過等，主要可以實(shí)現(xiàn)肝臟最基本的解毒功能，該類型人工肝已在臨床廣泛應(yīng)用。生物型人工肝則是將人或動(dòng)物的肝細(xì)胞置于反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)控制細(xì)胞微環(huán)境使其盡可能接近于人體肝臟所處的環(huán)境，使肝細(xì)胞 能正常生存，實(shí)現(xiàn)肝臟的生化功能?；旌闲蜕锶斯じ问巧锱c非生物人工肝技術(shù)的優(yōu)化組合，更好地達(dá)到臨床治療效果。生物型人工肝和混合型人工肝目前尚處于臨床驗(yàn)證階段，臨床應(yīng)用潛力巨大。生物反應(yīng)器是生物型人工肝和混合型人工肝的核心部件，其主要功能是為大量體外培養(yǎng)的肝臟細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境，促使肝臟細(xì)胞保持穩(wěn)定的高水平細(xì)胞活性和肝功能表達(dá)水平。目前生物反應(yīng)器的種類很多，按照細(xì)胞的培養(yǎng)方式可分為(I)中空纖維生物反應(yīng)器；(2)平板單層生物反應(yīng)器；(3)灌注床或支架生物反應(yīng)器；(4)包被懸浮生物反應(yīng)器。納米纖維主要是指在三維尺度上有兩維的尺寸處于納米范圍(小于0.1um)內(nèi)的線(管)狀材料，具有極高的比表面積、高孔隙率和相互連通的三維網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，相對于傳統(tǒng)技術(shù)制備的支架材料能夠更好的模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為細(xì)胞的生長提供良好的生長微環(huán)境。資料表明納米纖維膜有利于肝細(xì)胞球狀體的形成以及球狀體生物活性的保持，培養(yǎng)在納米纖維膜上的肝細(xì)胞其合成白蛋白、尿素的能力均大于利用傳統(tǒng)模式培養(yǎng)的肝細(xì)胞。目前，人工肝生物反應(yīng)器在細(xì)胞培養(yǎng)方面存在很多問題，諸如生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的肝細(xì)胞密度過低達(dá)不到人體所需的2 SXKTcells/m2，肝細(xì)胞容易從培養(yǎng)基質(zhì)上脫落從而造成肝細(xì)胞隨循環(huán)的培養(yǎng)液流走和在生物反應(yīng)器內(nèi)分布不均勻造成人工肝功能下降，以及培養(yǎng)液中氧氣供量不足造成的肝細(xì)胞死亡等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞流失率高的問題，提供一種可用于大批量肝細(xì)胞培養(yǎng)的人工肝生物反應(yīng)器。該人工肝生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)了肝細(xì)胞的大規(guī)模黏附生長，納米纖維的類生物體蛋白纖維結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖及提高活性，從而可以在很大程度上提高肝細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的密度以及生物活性。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種人工肝生物反應(yīng)器，包括外殼，所述外殼內(nèi)設(shè)有中空支架和內(nèi)置平板，內(nèi)置平板由多層平板組成，每層平板中間開有圓孔，用于中空支架穿過固定，平板與平板之間隔開固定于中空支架上。在上述人工肝生物反應(yīng)器中，所述內(nèi)置平板為2 150層圓形平板，每層平板直徑20mm 400 mm,厚lmm 10 mm ;平板與平板之間的層距0.5 mm 20 mm。在上述人工肝生物反應(yīng)器中，所述圓孔為直徑lmnT50mm的圓孔。在上述人工肝生物反應(yīng)器中，所述內(nèi)置平板的每層平板上雕刻有一定數(shù)量的鏤空孔，小孔直徑為0.1 mm^lO mm，相鄰的兩個(gè)小孔的圓心距為5在上述人工肝生物反應(yīng)器中，整個(gè)反應(yīng)器高度為50mnT2000 mm，有效體積為10mL 10000 mL。在上述人工肝生物反應(yīng)器中，所述中空支架的上下兩端分別設(shè)有營養(yǎng)液進(jìn)出口。在上述人工肝生物反應(yīng)器中，還設(shè)有納米纖維膜，納米纖維膜平鋪于內(nèi)置平板的表面之上。在上述人工肝生物反應(yīng)器中，所述的納米纖維膜的材料為殼聚糖、海藻酸鹽、纖維素、瓊脂糖、聚乳酸、聚丙烯酸、聚己內(nèi)酯、多聚賴氨酸、聚乙烯醇或其混合材料。在上述人工肝生物反應(yīng)器中，所述納米纖維膜的纖維直徑在30 nnT400 nm之間，孔隙率85%。在上述人工肝生物反應(yīng)器中，所述中空支架的側(cè)面上設(shè)有若干側(cè)孔，側(cè)孔均勻地分布在內(nèi)置平板的中間部位，側(cè)孔尺寸為長0.1 mnT50mm，寬為0.lmnT50mm，側(cè)孔的作用是細(xì)胞加樣及培養(yǎng)液循環(huán)出口，側(cè)孔的長度從中空支架的上端開始逐漸減小，以保證不同壓強(qiáng)下側(cè)孔出液量的均一性。在上述人工肝生物反應(yīng)器中，所述外殼為中空圓柱形，上端設(shè)有進(jìn)氣孔，孔大小為lmm-50mm ;設(shè)有取樣孔，孔大小為lmm-50mm ;設(shè)有進(jìn)液孔；下端設(shè)有出液孔，孔大小為1mm-10Omnin在上述人工肝生物反應(yīng)器中，所述內(nèi)置平板之間利用T型托架隔開，T型托架高度為lmm-30mm，可以保證兩個(gè)平板之間的中空支架有一層側(cè)孔，T型托架下端可以緊密插入平板中的圓孔。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:本發(fā)明的人工肝生物反應(yīng)器該生物反應(yīng)器引入納米纖維膜，實(shí)現(xiàn)了利用納米纖維膜極高的比表面積、高孔隙率和相互連通的三維網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，相對于傳統(tǒng)技術(shù)制備的支架材料能夠更好的模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為肝細(xì)胞的生長提供良好的微環(huán)境，利于細(xì)胞黏附、生長，可達(dá)到固定肝細(xì)胞進(jìn)而提高生物型人工肝的肝細(xì)胞密度，并且有利于促進(jìn)肝細(xì)胞球狀體的形成。針對肝細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)液供氧不足及循環(huán)的 問題，在反應(yīng)器內(nèi)置平板上進(jìn)行鏤空孔的雕刻，小孔的作用是增加細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面積及加速培養(yǎng)液循環(huán)速度，進(jìn)一步提高肝細(xì)胞的生物活性及功能的發(fā)揮。該生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)新穎，肝細(xì)胞在平板上分布均勻，微環(huán)境一致，且制備方法在技術(shù)上均能實(shí)現(xiàn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為人工肝生物反應(yīng)器核心器件；
圖2為人工肝生物反應(yīng)器核心器件剖視圖，箭頭方向?yàn)闋I養(yǎng)液流動(dòng)方向。圖3為人工肝生物反應(yīng)器內(nèi)置平板俯視 圖4為人工肝生物反應(yīng)器內(nèi)置平板3D具體實(shí)施例方式如圖1 一 4所不,一種人工肝生物反應(yīng)器,包括外殼I,外殼I內(nèi)設(shè)有中空支架2和內(nèi)置平板3,內(nèi)置平板3由多層平板組成,每層平板中間開有圓孔,圓孔為直徑lmnT50 mm的圓孔，用于中空支架2穿過固定，平板與平板之間隔開固定于中空支架2上。多層平板3為2 150層圓形平板，每層平板直徑20mnT400 mm，厚ImnTlO mm ;平板與平板之間的層距
0.5 mnT20 mm。內(nèi)置平板3的每層平板上雕刻有若干鏤空孔，鏤空孔直徑為0.1 mnTlO mm,相鄰的兩個(gè)鏤空孔的圓心距為5 mnT50mm。鏤空孔的作用是增加細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面積及加速培養(yǎng)液循環(huán)速度，進(jìn)一步提高肝細(xì)胞的生物活性及功能的發(fā)揮。整個(gè)反應(yīng)器高度為50mnT2000 mm，有效體積為10 mL 10000 ml。中空支架2的上下兩端分別設(shè)有營養(yǎng)液進(jìn)出口。利用靜電紡絲技術(shù)將天然材料如殼聚糖、海藻酸鹽、纖維素、瓊脂糖或人工合成的聚合物如聚乳酸、聚丙烯酸、聚己內(nèi)酯、多聚賴氨酸、聚乙烯醇或上述混合材料制備成納米纖維膜4。納米纖維膜4平放于多層平板3之上，作為細(xì)胞附著的載體。納米纖維膜4的纖維直徑在30 nnT400 nm之間，孔隙率85%。中空支架2為一直徑I mnT50 mm的空心圓柱。在中空支架2的柱體側(cè)面上還開有2 1000條縱長的側(cè)孔5，側(cè)孔5均勻地分布在每層平板的中間部位，側(cè)孔5尺寸為長0.1mnT50mm，寬為0.lmm^50mm,側(cè)孔5的作用是細(xì)胞加樣及培養(yǎng)液循環(huán)出口，側(cè)孔5的長度從中空支架2的上端開始逐漸減小 ，以保證不同壓強(qiáng)下小孔出液量的均一性。外殼I為中空圓柱形，上端設(shè)有進(jìn)氣孔，孔大小為lmm-50mm ;設(shè)有取樣孔，孔大小為lmm-50mm ;設(shè)有進(jìn)液孔；下端設(shè)有出液孔，孔大小為Imm-lOOmm。內(nèi)置平板3之間利用T型托架隔開，T型托架高度為lmm-30mm，可以保證兩個(gè)平板之間的中空支架有一層側(cè)孔5，T型托架下端可以緊密插入平板中的圓孔。納米纖維膜4的制備:選擇不同的溶劑將聚合物溶解制備成靜電紡絲溶液。根據(jù)聚合物溶液的不同性質(zhì)制定不同的靜電紡絲條件(電壓、接受距離、注射速度)，然后進(jìn)行紡絲，在紡絲過程中通過移動(dòng)接受器的位置和控制紡絲的時(shí)間對納米纖維膜的形狀和厚度進(jìn)行調(diào)節(jié)。將不同材料的納米纖維膜進(jìn)行相應(yīng)的改性和消毒，制備成能放置于細(xì)胞培養(yǎng)液中作為細(xì)胞生長基質(zhì)的納米纖維膜。實(shí)施例1:以殼聚糖和半乳糖化殼聚糖材料作為納米纖維支架的原材料來制作此新型生物反應(yīng)器。納米纖維支架的具體制備方法:將殼聚糖和半乳糖化殼聚糖溶解在70%的甲酸溶液，濃度為3-5wt%。在攪拌條件下向上述溶液中加入10wt%(PE0/半乳糖化殼聚糖)的PE0，溶解3小時(shí)并離心除去溶液中的氣泡。隨后將溶液裝入5ml玻璃注射器，注射器針頭為6號。在微量注射泵的推動(dòng)下以lml/h的速度推射溶液。在針頭和收集板的兩端施加15kV的電壓，收集器和針頭之間的距離為15cm。最終，電紡纖維被收集在生物反應(yīng)器內(nèi)置平板上，隨后置于40°C的真空條件下干燥兩天除去殘留的甲酸。
實(shí)施例2:以PLGA作為納米纖維支架的原材料來制作此新型生物反應(yīng)器
納米纖維支架的具體制備方法:將PLGA溶解在氯仿中制備成濃度為21.5%的溶液，隨后將溶液充入配有6號針頭的一次性注射器中。在收集板與針頭之間施加10-15kV的直流電壓，利用微量注射泵以lml/h的速度將溶液從注射器中推出。針頭和踏板之間的距離為10-15cm。當(dāng)紡絲完成后，將覆蓋有PLGA電紡纖維的內(nèi)置平板取下并置于真空干燥器中兩天除去殘留的溶劑。生物反應(yīng)器的封裝:將內(nèi)置平板3固定于中空支架2上，整個(gè)地放入反應(yīng)器外殼I內(nèi)，加上蓋子，即制人工肝 生物反應(yīng)器。
權(quán)利要求
1.一種人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于包括外殼(I)，所述外殼(I)內(nèi)設(shè)有中空支架(2)和內(nèi)置平板(3)，內(nèi)置平板(3)由多層平板組成，每層平板中間開有圓孔，用于中空支架(2)穿過固定，平板與平板之間隔開固定于中空支架(2)上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于:所述內(nèi)置平板(3)為2 150層圓形平板，每層平板直徑20mnT400 mm,厚ImnTlO mm ;平板與平板之間的層距0.5 mnT20mm;所述內(nèi)置平板(3) 的每層平板上雕刻有一定數(shù)量的鏤空孔，小孔直徑為0.1 mnTlO mm,相鄰的兩個(gè)小孔的圓心距為5 mnTOmm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于:所述圓孔為直徑lmnT50_的圓孔。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于，整個(gè)反應(yīng)器高度為50mnT2000 _，有效體積為 10 mL 10000 mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于:所述中空支架(2)的上端為營養(yǎng)液進(jìn)口，下端封閉。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于:還設(shè)有納米纖維膜(4)，納米纖維膜(4)平鋪于內(nèi)置平板(3)的表面之上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于:所述的納米纖維膜(4)的材料為殼聚糖、海藻酸鹽、纖維素、瓊脂糖、聚乳酸、聚丙烯酸、聚己內(nèi)酯、多聚賴氨酸、聚乙烯醇或其混合材料；所述納米纖維膜(4)的纖維直徑在30 nnT400 nm之間，孔隙率85%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于:所述中空支架(2)的側(cè)面上沿等角度方向開有設(shè)有2-10個(gè)側(cè)孔(5)，側(cè)孔(5)均勻地分布在每層平板的中間部位，上下兩層側(cè)孔間的距離為側(cè)孔為方形或圓形,方形的尺寸為長0.1 mnT50mm,寬為mm^50mm ;圓形的孔徑為 lmm-50mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于:所述外殼(I)為中空圓柱形，上端設(shè)有進(jìn)氣孔，孔大小為lmm-50mm ;設(shè)有取樣孔，孔大小為lmm-50mm ;設(shè)有進(jìn)液孔；下端設(shè)有出液孔，孔大小為Imm-lOOmm。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于:所述內(nèi)置平板(3)之間利用T型托架隔開，T型托架高度為lmm-30mm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人工肝生物反應(yīng)器，包括外殼，中空支架和內(nèi)置鏤空平板。肝細(xì)胞生物反應(yīng)器由多層鏤空平板組成，每層平板中間開有圓孔，用于中空支架穿過固定，平板與平板之間隔開固定于中空支架上。本發(fā)明的人工肝生物反應(yīng)器該生物反應(yīng)器引入納米纖維膜，實(shí)現(xiàn)了利用納米纖維膜極高的比表面積、高孔隙率和相互連通的三維網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，相對于傳統(tǒng)技術(shù)制備的支架材料能夠更好的模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為肝細(xì)胞的生長提供良好的微環(huán)境，利于細(xì)胞黏附、生長，可達(dá)到固定肝細(xì)胞進(jìn)而提高生物型人工肝的肝細(xì)胞密度，并且有利于促進(jìn)肝細(xì)胞球狀體的形成。該生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)新穎，肝細(xì)胞在平板上分布均勻，微環(huán)境一致。
文檔編號A61M1/20GK103100119SQ20131002661
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月24日
發(fā)明者馮章啟, 蔣慶 申請人:中山大學(xué)