酶促合成咖啡酸甲酯的方法
【專利摘要】酶促合成咖啡酸甲酯的方法，制備步驟為：采用離子液體為反應(yīng)介質(zhì)，以脂肪酶為催化劑，由咖啡酸和甲醇在反應(yīng)介質(zhì)中通過升溫震蕩和超聲輻射2種反應(yīng)條件制得。所述的咖啡酸在甲醇中的濃度為0.1～80g/L，咖啡酸在離子液體中的濃度為0.05～10g/L，反應(yīng)溫度為30～90℃，反應(yīng)時間為0.1～60h，脂肪酶的用量為10～200g/L。該方法反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境友好，克服了傳統(tǒng)的以有機(jī)溶劑為反應(yīng)介質(zhì)底物溶解度較低的缺點，易于生產(chǎn)得率較高的咖啡酸甲酯。
【專利說明】酶促合成咖啡酸甲酯的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物催化領(lǐng)域，具體涉及一種升溫震蕩和超聲輻射條件下咖啡酸甲酯 的脂肪酶促合成方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)：咖啡酸甲酯，英文名稱：Methyl caffeate，化學(xué)名稱：(E)-甲基-3-(3， 4_二輕基）丙烯酸酯，分子式：CltlH ltlO4,分子量：194. 18。
[0003] 近年來，咖啡酸及其衍生物已經(jīng)被廣泛運用到食品、化妝品、保健品和制藥 行業(yè)中。但由于咖啡酸水溶性強(qiáng)，脂溶性差，無法直接應(yīng)用于油脂含量較高的食品 中。而咖啡酸燒基酯具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性（Archives of Internal Medicine, 2009, 169(7) :708-715)，而且具有較好的脂溶性。其中咖啡酸甲酯是抱莖寥和水 茄提取物中的一類咖啡酸烷基酯，它的分子極性適中，對幼蟲發(fā)育以及食量具有抑制作用 (Journal of Pest Science, 2013, 86 (3) 579-589)，還具有很強(qiáng)的抗炎、利膽、抗癌、抗氧化、 抗病毒和凝血等功效，而且也可以用于合成天然藥物和食品添加劑（如咖啡酸丙酯和咖啡 酸苯乙酯）的中間原料。目前，獲得咖啡酸甲酯的方法多為提取法，然而，提取法因受其步 驟繁瑣、產(chǎn)率低等因素的限制而無法實現(xiàn)大批量的制備。因此亟需尋找一種天然高效的合 成用于食品以及醫(yī)藥行業(yè)的咖啡酸甲酯的方法。
[0004] 已報道的咖啡酸烷基酯的制備方法大都以有機(jī)溶劑為反應(yīng)介質(zhì)，以傳統(tǒng)的酸為催 化劑，在恒溫震蕩條件下進(jìn)行酯化或轉(zhuǎn)酯化，其中專利CN103086880A的發(fā)明專利公開了一 種以對甲苯磺酸為催化劑合成咖啡酸丙酯的方法。而對于咖啡酸甲酯的合成，Shin等人采 用硫酸催化法催化咖啡酸和甲醇酯化合成咖啡酸甲酯（Biochemical Pharmacology, 2004， 68 (12)，2327-2336)，反應(yīng)IOh后得率達(dá)到71. 0%。專利CN101585770A的發(fā)明專利公開了一 種用濃硫酸在微波條件下催化咖啡酸和甲醇反應(yīng)合成咖啡酸甲酯，反應(yīng)4min，收率為94%。 也有文獻(xiàn)報道（Journal of the Serbian Chemical Society, 2013, 78 (7) :1023-1034)用 對甲苯磺酸催化咖啡酸和甲醇合成咖啡酸甲酯，反應(yīng)4h后產(chǎn)物得率為84. 0%。然而傳統(tǒng)的 酸催化法具有反應(yīng)時間長、副產(chǎn)物過多、催化劑對設(shè)備的腐蝕性強(qiáng)、產(chǎn)品分離過程復(fù)雜以及 易揮發(fā)出污染環(huán)境的氣體等缺點（Journal of Molecular Catalysis A:Chemical, 2005, 2 34(1-2) :107-110)。因此，急需尋求出一種在溫和條件下能夠解決上述技術(shù)缺陷的新型、綠 色的反應(yīng)介質(zhì)和催化劑。
[0005] 目前在離子液體中酶促酯化和轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸酯類化合物因其反應(yīng)介質(zhì)污染 小、反應(yīng)選擇性強(qiáng)、條件溫和等優(yōu)點受到越來越多的關(guān)注。本課題組專利CN103088078A的 發(fā)明公開了一種用脂肪酶進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸丙酯的方法，該方法反應(yīng)條件溫和，對環(huán) 境友好，克服了傳統(tǒng)的脂肪酶催化合成效率和底物溶解度低的缺點，純度可達(dá)94. 36%，為 咖啡酸甲酯的合成提供了很好的思路。然而，由于咖啡酸甲酯的特殊的結(jié)構(gòu)，利用咖啡酸甲 酯和丙醇轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸丙酯的條件并不適用于咖啡酸甲酯的合成，而且咖啡酸在離子 液體中很難溶解，需要在離子液體中加入咖啡酸的甲醇溶液進(jìn)行酶促酯化反應(yīng)合成咖啡酸 甲酯，因此，簡單地類推咖啡酸丙酯的合成方法并不適用于咖啡酸甲酯的合成，合成體系需 要重新建立。
[0006] 近幾年來，超聲輻射的方法因反應(yīng)條件溫和而被用于有機(jī)化學(xué)合成過程中，它可 以在酶促反應(yīng)過程中提高傳質(zhì)速率以及底物與酶的接觸機(jī)會，并且固定化酶在超聲波條件 下具有更好的耐熱性（Ultrasonics，1992, 30(180-185))，盡管超聲輔助還未被廣泛的用于 酶促合成反應(yīng)過程中，但是有報道稱它可以被用于植物留醇和酰基供體的酶促酯化反應(yīng)過 程中（Ultrasonics sonochemistry, 2012, 19 (1015-1020))。因此，超聲福射作為一種輔助 條件，有望被越來越多的應(yīng)用于酶促反應(yīng)過程中。
[0007] 綜上，本發(fā)明的目的在于，針對有機(jī)溶劑存在污染嚴(yán)重等問題，提供一種綠色高效 的酶促反應(yīng)體系，其中所采用的離子液體不僅能提高酶促反應(yīng)的選擇性，而且具有較高的 熱穩(wěn)定性、安全可靠 。構(gòu)建升溫震蕩和超聲輻射方式2種反應(yīng)條件，這為今后快速制備藥物 中間體-咖啡酸甲酯提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 解決的技術(shù)問題：為解決上述缺陷，本發(fā)明旨在提供一種酶促合成咖啡酸甲酯的 方法。該方法操作簡便，反應(yīng)時間短，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物得率高，對環(huán)境友好，從而可以克 服傳統(tǒng)的脂肪酶催化合成效率和底物溶解度低的缺點，易于生產(chǎn)高純度咖啡酸甲酯，為推 動其在醫(yī)藥、食品等工業(yè)中的廣泛應(yīng)用具有十分重要的意義。
[0009] 技術(shù)方案：酶促合成咖啡酸甲酯的方法，制備步驟為：以離子液體為反應(yīng)介質(zhì)，月旨 肪酶為催化劑，采用咖啡酸與甲醇反應(yīng)合成咖啡酸甲酯，所述的咖啡酸在甲醇中的濃度為 0. 1?80g/L，咖啡酸在離子液體中的濃度為0. 05?10g/L，反應(yīng)溫度為30?90°C，反應(yīng)時 間為0. 1?60h，脂肪酶的用量為10?200g/L，包括升溫震蕩和超聲輻射2種輔助反應(yīng)條 件。
[0010] 所述酶促合成咖啡酸甲酯的方法，在密封容器中加入離子液體，再加入咖啡酸、甲 醇和脂肪酶，加熱振蕩反應(yīng)得到咖啡酸甲酯，振蕩器轉(zhuǎn)速為80?140rpm。
[0011] 所述酶促合成咖啡酸甲酯的方法，在密封容器中加入離子液體，再加入咖啡酸、 甲醇和脂肪酶，借助超聲波輻射反應(yīng)得到咖啡酸甲酯，超聲頻率為5?60kHz，超聲功率為 50 ?1000W。
[0012] 所述的離子液體為[Hmim] [HSO4]、[Bmim] [Tf2N]、[Bmim] [PF6]、[Bmin] [BF4]、 [Emim] [TfOH]、[Toma] Cl、[Toma] [Tf2N]或[Omim] [BF4]。
[0013] 所述脂肪酶為 Novozym435、Lipozyme RM IM 或 Lipozyme TL IM。
[0014] 有益效果：在酶促合成咖啡酸甲酯的體系中選擇合適的離子液體作為反應(yīng)介質(zhì)來 強(qiáng)化合成效率，并且借助超聲輻射的方法，將反應(yīng)時間由傳統(tǒng)的36h縮短為9h，該方法反應(yīng) 條件溫和，反應(yīng)時間短，對環(huán)境友好，克服了傳統(tǒng)的以有機(jī)溶劑為反應(yīng)介質(zhì)底物溶解度較低 的缺點，易于生產(chǎn)高純度的咖啡酸甲酯。此外，整個酶促反應(yīng)工藝基本上無廢棄物產(chǎn)生，無 環(huán)境污染，具有非常良好的工業(yè)應(yīng)用前景，可以滿足迅速發(fā)展的食品業(yè)的需要。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為酶促酯化合成咖啡酸甲酯的反應(yīng)式。

【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0017] 檢測咖啡酸甲酯的高效液相色譜條件為：采用250mmX4. 6mm的AlltimaTM C18柱， 流動相為甲醇：水（V :V) = 65:35,流速為lmL/min，柱溫為30°C，檢測波長為325nm，進(jìn)樣量 為 20 μ L。100%
[0018] 其中，產(chǎn)物咖啡酸甲酯的得率計算方法為：
[0019]

【權(quán)利要求】
1. 酶促合成咖啡酸甲酯的方法，其特征在于制備步驟為：以離子液體為反應(yīng)介質(zhì)，月旨 肪酶為催化劑，采用咖啡酸與甲醇反應(yīng)合成咖啡酸甲酯，所述的咖啡酸在甲醇中的濃度為 0. 1?80g/L，咖啡酸在離子液體中的濃度為0. 05?10g/L，反應(yīng)溫度為30?90°C，反應(yīng)時 間為0. 1?60h，脂肪酶的用量為10?200g/L，包括升溫震蕩和超聲輻射2種輔助反應(yīng)條 件。
2. 如權(quán)利要求1所述酶促合成咖啡酸甲酯的方法，其特征在于：在密封容器中加入離 子液體，再加入咖啡酸、甲醇和脂肪酶，加熱振蕩反應(yīng)得到咖啡酸甲酯，振蕩器轉(zhuǎn)速為80? 140rpm〇
3. 如權(quán)利要求1所述酶促合成咖啡酸甲酯的方法，其特征在于：在密封容器中加入離 子液體，再加入咖啡酸、甲醇和脂肪酶，超聲波輻射反應(yīng)得到咖啡酸甲酯，超聲頻率為5? 60kHz，超聲功率為50?1000W。
4. 如權(quán)利要求1?3任一所述酶促合成咖啡酸甲酯的方法，其特征在于所述的離子液 體為[Hmim][HS04]、[Bmim][Tf 2N]、[Bmim][PF6]、[Bmin][BF4]、[Emim][TfOH]、[Toma]Cl、 [Toma] [Tf2N]或[Omim] [BF4]。
5. 如權(quán)利要求1?3任一所述酶促合成咖啡酸甲酯的方法，其特征在于：脂肪酶為 Novozym435> Lipozyme RM IM 或 Lipozyme TL IM〇
【文檔編號】C12P7/62GK104278060SQ201410507607
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】王俊, 王紗紗, 黎忠健, 盛晟, 吳福安 申請人:江蘇科技大學(xué)