重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的構(gòu)建和修飾方法及其凍干注射劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的構(gòu)建和修飾方法及其凍干注射劑的制備方法。本發(fā)明重組豬-α干擾素采用大腸桿菌可溶性表達(dá)制備，根據(jù)聚乙二醇的特點(diǎn)，用聚乙二醇修飾重組豬-α干擾素得重組豬長(zhǎng)效-α干擾素，延長(zhǎng)重組豬長(zhǎng)效-α干擾素在豬體內(nèi)的半衰期至44.5h、增強(qiáng)豬的免疫力。本發(fā)明重組豬長(zhǎng)效-α干擾素在細(xì)菌高密度、高容積下表達(dá)優(yōu)良，生產(chǎn)和純化工藝簡(jiǎn)單新穎、成本低，提高了產(chǎn)品收率和純度。本發(fā)明重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑具有成本低、療效顯著、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的構(gòu)建和修飾方法及其凍干注射劑的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的構(gòu)建和修飾方法及其凍干注射劑的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]豬干擾素是研究最早的動(dòng)物干擾素之一，20世紀(jì)80年代就有豬干擾素的相關(guān)報(bào)道。已發(fā)現(xiàn)的豬干擾素包括INF-α、β、ω、δ和INF-Y，現(xiàn)在已完成基因克隆、測(cè)序和定位。近年來，對(duì)豬干擾素的誘導(dǎo)條件和理化活性有了進(jìn)一步的研究，同時(shí)對(duì)豬白細(xì)胞干擾素進(jìn)行了大量的臨床試驗(yàn)。研究表明，它對(duì)豬的許多病毒性傳染病如流行性腹瀉、豬瘟、傳染性胃腸炎等，以及對(duì)牛病毒性腹瀉、小鵝瘟、羔羊腹瀉等都具有顯著療效，試驗(yàn)證實(shí)豬干擾素與牛羊等動(dòng)物之間存在交叉活性。謝海燕等采用PCR技術(shù)克隆得到的IFN - α基因；夏春等克隆得到的豬β干擾素IFN - β基因。曹瑞兵等從經(jīng)ConA誘導(dǎo)培養(yǎng)的豬外周血白細(xì)胞中擴(kuò)增出豬IFN -Y基因，重組豬IFN -Y具有較高的干擾素活性。同時(shí)，萬建青、陳濤等分別成功地在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)出重組干擾素基因，表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的比率在20 %飛0%之間，表達(dá)產(chǎn)物具有抗病毒活性，為基因工程干擾素的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用提供了可能。目前尚未有一種高效的用于治療豬病毒病的干擾素制劑。現(xiàn)有的豬干擾素必須每天重復(fù)用藥，價(jià)格昂貴，治療效果欠佳。今后的發(fā)展趨勢(shì)是尋找一種高效價(jià)格低廉的長(zhǎng)效干擾素制劑，能夠用于臨床，對(duì)人而言，主要用作免疫增強(qiáng)劑和無毒副作用，動(dòng)物主要用于病毒病的治療。目前尚未有豬的長(zhǎng)效干擾素投放市場(chǎng)。我們擬通過基因修飾建立豬長(zhǎng)效干擾素，研制一種有效的制劑，3-5年投放市場(chǎng)。
[0003]干擾素(IFN)是一類具有廣泛生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗病毒、抗腫瘤等多種作用，是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分，豬干擾素是治療豬病毒性疾病的首選藥物。豬是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要項(xiàng)目，發(fā)展養(yǎng)豬生產(chǎn)是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的大問題。困擾養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要問題是疾病問題，而豬的傳染性疾病是對(duì)豬的最大危害，我國(guó)每年因豬的傳染性疾病造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。在豬的傳染病中病毒性疾病占主導(dǎo)地位，約占85%。對(duì)于豬的病毒性傳染病(如豬瘟、口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征等)目前主要靠疫苗進(jìn)行預(yù)防。豬病毒性疾病絕大多數(shù)都有可用的疫苗進(jìn)行預(yù)防。
[0004]近年來，隨著豬病毒新毒株、變異株的不斷出現(xiàn)，我國(guó)豬病毒病的防治面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，目前的預(yù)防和治療措施已經(jīng)不能有效地控制疫病的發(fā)展，其危害日益嚴(yán)重，因此迫切需要一種有效的防治措施和高效的藥物。對(duì)動(dòng)物的病毒性傳染病的治療只有依靠高免血清或病毒干擾制劑。由于受價(jià)格和動(dòng)物適應(yīng)性的影響，目前尚無可供的高免血清用于豬病毒性疾病的治療。雖然已經(jīng)研究出可以用于治療病毒性疾病的干擾素制劑，如聚肌胞、豬干擾素等，但這些產(chǎn)品存在嚴(yán)重缺陷，這類藥品半衰期短、療效差、價(jià)格高。對(duì)患病動(dòng)物每天必須重復(fù)用藥，增加了用藥的成本，往往達(dá)不到預(yù)期效果，使這類藥物的應(yīng)用受到嚴(yán)重的制約。到目前為止，還沒有一種有效而實(shí)用的藥物用于豬病毒性疾病的治療，所以研制高效的抗病毒藥物是治療豬病毒性疾病的重要手段，是防治豬病毒性傳染病發(fā)展養(yǎng)豬生產(chǎn)所必須。本課題擬研制一種長(zhǎng)效的豬病毒干擾素制劑，3天注射一次，對(duì)豬病毒性疾病具有良好效果，對(duì)發(fā)展養(yǎng)豬生產(chǎn)，保障市場(chǎng)供給和穩(wěn)定市場(chǎng)物價(jià)具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)意義。
[0005]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的構(gòu)建和修飾方法，以及提供一種療效好、價(jià)格低的重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑，不需要每天對(duì)患病動(dòng)物重復(fù)用藥。
[0007]本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:一種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素CrpoIFN- α)，其特征在于:先使用原核表達(dá)系統(tǒng)可溶性表達(dá)豬-α干擾素，再使用聚乙二醇修飾重組豬-α干擾素得重組豬長(zhǎng)效-α干擾素(rpoIFN- α )；
所述聚乙二醇修飾劑為甲氧基聚乙二醇丙醛或甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺。
[0008]本發(fā)明還提供一種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
1)引物設(shè)計(jì):根據(jù)GenBank中登錄號(hào)Μ28623.1的豬干擾素的基因序列，利用Primer5.0生物軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增豬干擾素成熟肽基因的引物:
上游引物:5’ -GGAATTCTGTGACCTGCCTCAG-3’，
下游引物:5’ -CCGCTCGAGTCACTCCTTCTTCCTGAGT-3，；
2)豬肝臟基因組DNA提取:用DNA抽提試劑盒對(duì)豬肝臟基因組DNA進(jìn)行提??；
3)豬-α干擾素成熟肽基因的克隆:根據(jù)步驟1)、2)所得引物與豬肝臟基因組DNAjlJ用PCR擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)豬-α干擾素成熟肽基因進(jìn)行克隆；
4)DNA電泳:采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)步驟3)所得豬-α干擾素成熟肽基因進(jìn)行電泳分離，并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收，得到PCR回收產(chǎn)物；
5)提取質(zhì)粒:用質(zhì)粒提取試劑盒對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行提?。?br> 6)質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物的雙酶切:對(duì)步驟4)所得PCR回收產(chǎn)物和步驟5)所得質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切；
7)DNA片段的連接:將步驟6)所得雙酶切后的PCR回收產(chǎn)物與載體質(zhì)粒在Τ4連接酶的作用下進(jìn)行連接；
8)感受態(tài)細(xì)胞的制備:挑取活化的大腸桿菌于LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)，直至0D_值達(dá)到0.6^0.8，取培養(yǎng)液用Cacl2法制備感受態(tài)細(xì)胞；
9)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化:將步驟7)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到新鮮制備的步驟8)所得感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37 1:培養(yǎng)過夜；
10)陽性克隆的鑒定:取步驟9)中含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落經(jīng)PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步鑒定，取通過PCR鑒定為陽性的克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、提取質(zhì)粒、雙酶切、酶切產(chǎn)物鑒定，鑒定為陽性即表示載體構(gòu)建成功；
11)重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá):挑選步驟10)制備得的陽性克隆于100mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 0C >180 r/min培養(yǎng)過夜，直至OD6tltl值為0.6?0.8時(shí)，加入f 5mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷溶液lmL，22 °C下誘導(dǎo)Γ?Ο h，將誘導(dǎo)結(jié)束后得到的培養(yǎng)液于10000 r/min的離心速度下離心I min,收集菌體沉淀,稱取菌體沉淀的重量,并加入菌體沉淀重量3?10倍體積的裂解液，吹打使菌體重懸，預(yù)冷后超聲破碎，將超聲破碎后的液體于4 0CuOOOO r/min的離心速度下離心10 min，取離心上清液，加入與離心上清液等體積的2XLoading Buffer (上樣緩沖液)，取上述混合溶液于100 °C下煮沸10 min,得重組豬-α干擾素粗品；
12)重組豬-α干擾素粗品的純化:將步驟11)所得重組豬-α干擾素粗品過鎳離子金屬螯合親和層析柱進(jìn)行分離純化，用洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集每個(gè)梯度的洗脫峰，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定目標(biāo)蛋白，將經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定為重組豬-α干擾素的水溶液用透析袋除鹽，置于-80 °C超低溫冰箱中預(yù)凍4 h，在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h，即得精制重組豬-α干擾素。
[0009]一種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的修飾方法，包括如下步驟:
1)用磷酸鹽緩沖液將上述制得的精制重組豬-α干擾素配置成重組豬-α干擾素的磷酸鹽反應(yīng)溶液；
2)在反應(yīng)溫度4°C條件下，將聚乙二醇修飾劑添加到步驟I)所述含重組豬-α干擾素的磷酸鹽反應(yīng)溶液中，再加入氰基氫硼化鈉，攪拌均勻，進(jìn)行修飾反應(yīng)；
3)向步驟2)所述溶液中加入過量的甘氨酸終止反應(yīng)，得反應(yīng)液；
4)將步驟3)所得反應(yīng)液過SP陽離子交換層析柱，用洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)各洗脫峰物質(zhì)用SDS-PAGE電泳鑒定目標(biāo)產(chǎn)物，收集得單聚乙二醇修飾重組豬長(zhǎng)效-α干擾素水溶液，將所得重組豬長(zhǎng)效干擾素水溶液用透析袋除鹽，置于-80 °C超低溫冰箱中預(yù)凍4h，在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h，即得修飾的重組豬長(zhǎng)效-α干擾素；
其中，步驟I)所述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為4.(Γ10.0，磷酸鹽緩沖溶液中重組豬- α干擾素的濃度為1.2^2.0mg/mL ；
步驟2)中所述聚乙二醇修飾劑為甲氧基聚乙二醇丙醛或甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺，所述聚乙二醇修飾劑與重組豬-α干擾素的摩爾比為1:1飛:1，以反應(yīng)溶液的總體積計(jì)，添加的氰基氫硼化鈉濃度為lmg/mL，修飾反應(yīng)時(shí)間為6?30 h。
[0010]步驟4)中所述梯度洗脫，流動(dòng)相A相:50mmol/L、pH值為4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液，流動(dòng)相B相為:在體積為IL的A相中再加入117g氯化鈉而得，B相的梯度濃度為5°/Γ30%(V/V)。
[0011]一種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑，采用重組豬長(zhǎng)效-α干擾素為主要原料，通過添加劑協(xié)同保護(hù)，經(jīng)溶液配制、脫內(nèi)毒素、除雜除菌、分裝、凍干后制得；
所述原料的濃度，以配制溶液的總體積計(jì)為:磷酸氫二鈉0.0Γ0.03 mmol/L，氯化鈉9?15 g/L，凍干保護(hù)劑1%?3% (V/V)，重組豬長(zhǎng)效-α干擾素0.5 X 14?1.5 X 14 U/L，其中重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的比活性為4.41 X 15 U/mg ；
所述重組豬長(zhǎng)效-α干擾素為上述修飾方法制備所得；
所述凍干保護(hù)劑為甘露醇。
[0012]所述重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑的制備方法，包括如下步驟:
I)在無菌操作室內(nèi)，根據(jù)要配制溶液的體積，稱取磷酸氫二鈉、氯化鈉、凍干保護(hù)劑、重組豬長(zhǎng)效-α干擾素，倒入滅菌鹽水瓶中，用超純水定容至要配制的體積；其中，以配制溶液的總體積計(jì)，磷酸氫二鈉、氯化鈉、凍干保護(hù)劑、重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的最終濃度為磷酸氫二鈉0.0Γ0.03mmol/L,氯化鈉9?15g/L，甘露醇1%?3% (V/V)，重組豬長(zhǎng)效-α干擾素0.5 X 14?1.5X104U/L (重組豬長(zhǎng)效_ α干擾素的比活性為4.41 X 15 U/mg)；
2)在步驟I)配置好的藥液中加入內(nèi)毒素脫除劑，攪拌1(T20min ；
3)在已滅菌的布氏漏斗上鋪墊兩層滅菌濾紙，將步驟2)所得藥液通過濾紙，濾除雜質(zhì)；
4)用0.22 μ m不銹鋼鐘罩式濾器過濾步驟3)所得藥液，濾除雜菌；
5)將步驟4)所得濾除雜菌的藥液以每瓶1lOmL的份量，分裝到相應(yīng)的西林瓶中；
6)將步驟5)所得藥液在低于凍干保護(hù)劑最低共熔點(diǎn)8?101:的溫度下，預(yù)凍12 h；
7)將步驟6)預(yù)凍好的藥品，在冷凝器溫度〈-40°C、壓強(qiáng)范圍l(T30Pa的條件下，進(jìn)行升華干燥12h ；
8)將步驟7)所得升華干燥好的藥品在壓強(qiáng)范圍15?30Pa條件下，_15°C進(jìn)行解析干燥4?6 h ；
9)將冷凍干燥機(jī)壓強(qiáng)降至10Pa，將步驟8)所得解析干燥好的藥品在-10 1:繼續(xù)冷凍干燥2h ；
10)將步驟9)凍干后的重組豬長(zhǎng)效-α干擾素注射劑產(chǎn)品，在無菌條件下加塞壓蓋，即得重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑。
[0013]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果:
1、本發(fā)明重組豬-α干擾素采用大腸桿菌可溶性表達(dá)制備，是技術(shù)的核心之一，比已有的技術(shù)產(chǎn)量提高30%，能實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，制備工藝更簡(jiǎn)單，純化更容易。
[0014]2、實(shí)現(xiàn)了重組豬-α干擾素在細(xì)菌高密度、高容積下的高效表達(dá)。
[0015]3、根據(jù)聚乙二醇的特點(diǎn)，精心設(shè)計(jì)了重組豬-α干擾素的修飾方法，是技術(shù)重大創(chuàng)新發(fā)明，用聚乙二醇修飾重組豬-α干擾素，操作簡(jiǎn)便且后續(xù)純化工藝路線新穎。
[0016]3.1根據(jù)重組豬-α干擾素的氨基酸序列特點(diǎn)，分別采用了相對(duì)分子質(zhì)量為20kDa的直鏈型mPEG-ALD (單甲氧基聚乙二醇丙醛)、mPEG_SPA (單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸酯)修飾重組豬-α干擾素。
[0017]3.2優(yōu)化重組豬-α干擾素的聚乙二醇修飾條件，使用mPEG-ALD (單甲氧基聚乙二醇丙醛)、mPEG_SPA (單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸酯)大量修飾重組豬-α干擾素，采用SP陽離子交換層析法純化單聚乙二醇修飾偶聯(lián)物，SDS-PAGE檢測(cè)修飾產(chǎn)物，使用細(xì)胞模型及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)重組豬長(zhǎng)效-α干擾素生物活性進(jìn)行了研究。
[0018]4、本發(fā)明重組豬長(zhǎng)效-α干擾素在豬體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)時(shí)間提高14倍。
[0019]5、本發(fā)明重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、成本低，能有效提高動(dòng)物的免疫力，治療豬的病毒性疾病，包括隱性感染，如豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病、豬偽狂犬、豬流行性腹瀉等。

【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0021]一種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素(rp0IFN- α )，先使用原核表達(dá)系統(tǒng)可溶性表達(dá)豬-α干擾素，再使用聚乙二醇修飾重組豬-α干擾素得重組豬長(zhǎng)效-α干擾素(rp0IFN-α X
[0022]實(shí)施例1:一種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素構(gòu)建和PEG修飾。
[0023](一)重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的構(gòu)建:
1、引物設(shè)計(jì):
利用Primer 5.0,根據(jù)GenBank中登錄號(hào)M28623.1的豬IFN- α基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增豬-α干擾素成熟肽基因的引物。上游引物5’端添加EcoR I限制性酶切位點(diǎn)和ATG起始密碼子，下游引物5’端添加Xho I限制性酶切位點(diǎn)。
[0024]上游引物為5’ -GGAATTCTGTGACCTGCCTCAG-3’ ；
下游引物為 5’ -CCGCTCGAGTCACTCCTTCTTCCTGAGT-3’。
[0025]弓丨物送經(jīng)Takara公司合成。
[0026]2、豬肝臟基因組DNA的提取:用組織/細(xì)胞DNA (小量)抽提試劑盒(WatsonB1technologies, Inc)對(duì)豬肝臟基因組DNA進(jìn)行提取。
[0027]2.1稱取豬肝臟組織20 mg左右(最大起始量:25 mL)，移入1.5 mL EP離心管中。
[0028]2.2在冰袋上，用配備的組織搗碎棒將組織徹底搗碎。
[0029]2.3加入200 μ L DLT液，渦旋震蕩，使組織碎片重懸。65 °C溫浴，并不斷晃動(dòng)，直至無組織碎片存在。
[0030]2.4 加入 200 μ L DT 液，8 μ LRNase A (核糖核酸酶)和 25 μ L Proteinase K(蛋白酶K)，迅速溫和地來回顛倒離心管徹底混勻。65 °C水浴30 min，并不時(shí)晃動(dòng)。
[0031]2.5以12000 r/min離心5 min，將上清移入離心管中。
[0032]2.6加入200 μ L無水乙醇，混勻后加到吸附柱中，12000 r/min離心30 S。將吸附柱移入一個(gè)干凈的收集管中。
[0033]2.7 加入 500 μ L Wash buffer,靜止 I min 后，12000 r/min 離心 30 S。取出吸附柱，倒掉收集管中的液體后放回。
[0034]2.8重復(fù)步驟7 —次。
[0035]2.9 12000 r/min 離心 I min。
[0036]2.10取出吸附柱放入1.5 mL離心管中。還慢在柱中白色吸附膜中央加入滴加60μ LElut1n buffer, 65。。靜置 5 min 后，12000 r/min 離心 I min。
[0037]2.11 將收集管(DNA)-20 °C保存。
[0038]3、豬α -干擾素成熟肽基因的克隆:
PCR反應(yīng)體系
Ex Taq DNA 聚合酶0.5 μ L,
10Χ擴(kuò)增緩沖液5 yL，Mg2+ 4 yL ,
4種dNTP混合物4 μ L，
引物I (上游引物)I UL，
引物2 (下游引物)I yL，
模板 DNAIuL,
雙蒸水33.75 μ L，
將上述溶液混勻后稍離心，再置于PCR儀中:
PCR反應(yīng)條件 95 °C預(yù)變性5 min
94°C 變性 45 s 61 °C退火45 s (溫度梯度PCR后，選定)，
72 °C延伸 I min,
循環(huán)30次，
最后72 °C延伸7 min,
4、DNA電泳:
1.0%瓊脂糖凝膠的制備:稱取1.0 g瓊脂糖，加入100 mLl X TAE緩沖液。電磁爐加熱溶解，冷卻60 °C左右時(shí)，加入5 μ L的EB母液。混勻后倒入插好梳子的電泳模板中。室溫自然凝固后(約30 min)，將膠連同電泳板放入電泳槽中。加入電泳緩沖液，使其沒過膠面。
[0039]加樣5 μ L DNA提取物加I μ L 6XDNA上樣緩沖液，混勻后上樣。
[0040]電泳恒壓110 V電泳約30 min。指示劑遷移到適當(dāng)位置，停止電泳。
[0041]成像將凝膠置于紫外能下觀察將凝膠置于紫外燈下觀察，照相。
[0042]5、目的片段的回收:
5.1在凝膠成像系統(tǒng)中，切下目的DNA片段。轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中。5.2稱量出凝膠塊質(zhì)量，按I g凝膠加入I ml Binding Buffer的比例加入Binding Buffer潤(rùn)旋振蕩后，65 °C溫浴7 min至凝膠完全融化，期間顛倒震蕩。
[0043]5.3轉(zhuǎn)移700 μ L DNA脂糖溶液到HiBindTM DNA柱子中，將其放入2 mL收集管中，10，000 g離心I min，取出柱子，棄去收集管中液體。5.4將柱子重新套回收集管中，力口300 μ L Binding Buffer 至 HiBind DNA 柱子中；靜置 I min, 10，000 g 離心 I min,棄去收集管中液體。
[0044]5.5將柱子放回收集管中。加入700 μ L SPff Wash buffer。室溫下靜置Imin后
10,000g離心I min。棄去收集管中濾出液。
[0045]5.6重復(fù)步驟5 —次。
[0046]5.7將柱子重新放回收集管，13，000 g離心I min，清除殘留在柱中的液體。5.8把柱子放入1.5 mL離心管，滴加30 μ L洗脫液至柱子膜中央。室溫靜置I min后，13，000g離心I min，濾出液即為是目的DNA溶液，-20 °C保存?zhèn)溆谩?、質(zhì)粒的提取:用OmegaB1-Tek的的質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid Mini Kit I )對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行提取。
[0047]6.1在含Amp (氨芐青霉素)的LB平板上，挑取陽性克隆。轉(zhuǎn)接到5 mL含Amp (氨芐青霉素)(工作濃度為100 yg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中。37 °C振蕩(轉(zhuǎn)速為300 r/min)培養(yǎng)12 h。6.2取5 mL菌液，批次放入1.5 mL EP管中。10000 g離心I min。6.3棄去上清，向EP管中加含RNase A的溶液I 250 μ L。渦漩振蕩使菌體重懸。
[0048]6.4加入250 μ L溶液II至離心管中，快速溫和顛到數(shù)次，直至裂解液變澄清。
[0049]6.5加350 μ L溶液III至離心管中，快速溫和顛倒數(shù)次，白色絮狀沉淀出現(xiàn)。
[0050]6.6 13000 g離心10 min。6.7輕輕吸取上清(避免沉淀和細(xì)胞碎片的吸入)，移入已套好2 mL離心管的吸附柱中。室溫10000 g離心I min。6.8棄去濾過液。向吸附柱中加入500 μ L Buffer HB。10000 g離心lmin,除去蛋白質(zhì)殘留。
[0051]6.9棄去濾過液。700 μ L Wash Buffer (已按照說明加入100%乙醇稀釋過)清洗吸收柱，10000 g離心I min。
[0052]6.10重復(fù)步驟8，再加700 μ L Wash Buffer清洗吸收柱。6.11 13000 g離心2min取出吸附柱中殘留的乙醇。6.12將吸收柱放入干凈1.5 mL離心管，滴加30 μ L TE緩沖液在吸附柱濾膜中央。靜置I min后13000 g離心I min。
[0053]7、質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的雙酶切:
取一個(gè)干凈、滅菌的200 μ L的EP管，按下表加入各種試劑水15 μ L,
1XH buffer5 μ L,
PCR產(chǎn)物(或質(zhì)粒DNA)25 μ L，
EcoR I限制性酶2.5 μ L，
Xho I 限制性酶2.5 yL,
總體積50 μ L,
PCR產(chǎn)物，37 °C保溫2 11;質(zhì)粒0嫩，37 °C保溫過夜，
8、DNA片段的連接:
連接反應(yīng)體系如下:
PCR回收產(chǎn)物7.0 μ L,
2XT4DNA連接酶緩沖液 1.0 μ L， pET32a Vector1.0 μ L,
T4DNA 連接酶1.0 μ L,
共計(jì)10.0 μ L，
混勻離心，16 1:放置過夜(以上均在冰上操作)。
[0054]9、感受態(tài)細(xì)胞的制備:
9.1受體菌的培養(yǎng):從含LB平板上挑去活化的DH5 α大腸菌落，轉(zhuǎn)接到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)過夜。次日，將菌液按照1:100的比例接種到100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 °〇培養(yǎng)，直至00_值達(dá)到0.6?0.8。9.2感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法):9.2.1培養(yǎng)液冰上預(yù)冷10 min后，4 °C 3000 g離心10 min。9.2.2棄去上清，用10 mL
0.05 mol/L的CaCl2溶液(已4°C預(yù)冷)輕輕吹打，使細(xì)胞懸浮。冰上預(yù)冷30 min。4 V3000 g離心10 min。9.2.3棄去上清，加入4 mL含15%甘油的0.05 mol/L的CaCl2溶液(已4 °C預(yù)冷)輕輕吹打，使細(xì)胞懸浮。將裝有細(xì)胞懸液的錐形瓶置于冰上。9.2.4將感受態(tài)細(xì)胞裝入無菌、已預(yù)冷的1.5 mL EP管(200 yL/支)，-70 °C保存。
[0055]9.3感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化:
9.3.1將經(jīng)過滅菌的1.5 mL的EP放入-20 °C的冰箱預(yù)冷，然后每管加入200 μ L的感受態(tài)細(xì)胞；再加入連接產(chǎn)物5 μ L ;冰浴40?60 min。放置同時(shí)設(shè)立對(duì)照，陽性對(duì)照為Control Insert DNA連接產(chǎn)物；空白對(duì)照為酶切后的空載體。
[0056]9.3.2將EP管放入42 °C水浴鍋中預(yù)熱好的架子上，計(jì)時(shí)90 s (此時(shí)不能搖動(dòng))
9.3.3計(jì)時(shí)結(jié)束后，將EP迅速放入冰浴中2?3 min。
[0057]9.3.4將連接產(chǎn)物放入到800 μ L的無菌LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，150 r/min培養(yǎng)I h，使細(xì)菌復(fù)原，并是其抗生素基因得以表達(dá)。
[0058]9.3.5轉(zhuǎn)移100 μ L的培養(yǎng)液，在含有Amp (氨芐青霉素)的LB平板上涂布(如菌濃過大，可以將涂布量降低)。
[0059]9.3.6將平板室溫放置，直至液體被吸干(轉(zhuǎn)化前，先將平板從4 °C拿出，再倒置放入培養(yǎng)箱，這樣避免了對(duì)轉(zhuǎn)化菌的再刺激)。
[0060]9.3.7 37 1:培養(yǎng)過夜，次日可觀察到轉(zhuǎn)化克隆的出現(xiàn)。
[0061]10、陽性克隆的鑒定:
10.1菌落PCR鑒定:
以Amp (氨芐青霉素)平板上出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化克隆為模板，挑取5個(gè)以上，按照先前的PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增；通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。
[0062]10.2雙酶切鑒定:
將經(jīng)過鑒定為陽性的克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。將其加入含Amp (氨芐青霉素)的LB液體培養(yǎng)中，37 °C, 180 r/min，培養(yǎng)過夜。達(dá)到一定菌濃后，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒雙酶切，37 °C，2 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0063]水3 yL，
1XH bufferI μ L,
PCR產(chǎn)物(或質(zhì)粒DNA)5 μ L，
EcoR I0.5 μ L，
Xho I0.5 μ L，
總體積10 μ Lo
[0064]測(cè)序鑒定:
將雙酶切為陽性的質(zhì)粒，送TaKaRa公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GeneBank中登錄號(hào)為Μ28623.1的豬IFN-α成熟肽基因序列進(jìn)行比對(duì)。
[0065]11、重組豬- α干擾素的誘導(dǎo)表達(dá):
11.1種子菌的活化:
用接種環(huán)挑取少量重組菌株菌液在含有氨芐青霉素的LB平板上劃線，放入37 °C培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)過夜。次日，平板上出現(xiàn)的單菌落即為種子菌。
[0066]11.2種子菌的一次活化:用接種環(huán)挑取種子菌單菌落，接種于5 ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C, 180 r/min，培養(yǎng)過夜。
[0067]11.3種子菌的擴(kuò)大培養(yǎng):將活化的菌液按照1:100的比例接種于50 ml含Amp(氨芐青霉素)的LB液體培養(yǎng)基中37°C，180 r/min，培養(yǎng)過夜。然后，按照同樣的比例放大到5L的錐形瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同樣為37 V，180 r/min。待其OD6tltl值到達(dá)0.6^0.8時(shí)，即可進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0068]11.4重組豬-α干擾素的誘導(dǎo)表達(dá):
?向擴(kuò)大培養(yǎng)的種子菌中加入lmmol/L的異丙基硫代半乳糖苷溶液ImL, 22 °C下誘導(dǎo)4ho將誘導(dǎo)結(jié)束后得到的培養(yǎng)液于10000 r/min的離心速度下離心I min,收集菌體沉淀，稱取菌體沉淀的重量，并加入菌體沉淀重量3倍體積的裂解液，吹打使菌體重懸，預(yù)冷后超聲破碎，將超聲破碎后的液體于4 0CuOOOO r/min的離心速度下離心10 min，取離心上清液，加入與離心上清液等體積的2 X Loading Buffer (上樣緩沖液)，取上述混合溶液于100°C下煮沸10 min,得重組豬-α干擾素粗品；
12、重組豬-α干擾素粗品的純化:
12.1往層析柱中填裝金屬螯合親和層析介質(zhì)；
12.2 依次用超純水、I mol/L NaOH,0.2 mol/L EDTA 溶液各清洗一次。0.1 mol/LNiS04 (內(nèi)含0.3 mol/L NaCl)溶液過柱，掛Ni。再用水清洗一次，除去游離的Ni離子。
[0069]12.3 用平衡 Buffer (50 mmol/L、ρΗ8.0 的 Tris-HCl 緩沖液，內(nèi)含 0.1 mol/LNaCl)平衡，直至紫外檢測(cè)值不變。
[0070]12.4上樣，使裂解液隨流動(dòng)相進(jìn)入金屬螯合親和層析柱；
12.5 用平衡 Buffer (50 mmol/L、ρΗ8.0 的 Tris-HCl 緩沖液，內(nèi)含 0.1 mol/L NaCl)平衡柱子，洗去未與介質(zhì)結(jié)合的雜質(zhì)，紫外檢測(cè)值不變，將其調(diào)零，作為基準(zhǔn)。
[0071]12.6流動(dòng)相A相:50mmol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，流動(dòng)相B相:在體積為IL的A相中加入34 g咪唑而得，B相的梯度濃度為2 9Γ80 % (V/V)，進(jìn)行梯度洗脫，收集每個(gè)梯度的洗脫峰。
[0072]12.7對(duì)每個(gè)洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定目標(biāo)蛋白，將經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定為重組豬-α干擾素的水溶液用透析袋除鹽，置于-80 °C超低溫冰箱中預(yù)凍4 h，在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h，即得精制重組豬-α干擾素。
[0073](二)重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的修飾:
1、用PH值為4.0的磷酸鹽緩沖液，將上述步驟所得的精制重組豬- α干擾素配置成1.2mg/mL的重組豬- α干擾素的磷酸鹽反應(yīng)溶液；
2、在反應(yīng)溫度4°C條件下，將甲氧基聚乙二醇丙醛添加到重組豬-α干擾素的磷酸鹽反應(yīng)溶液中，其中甲氧基聚乙二醇丙醛與重組豬-α干擾素的摩爾比為1:1，再加入氰基氫硼化鈉(以反應(yīng)溶液的總體積計(jì)，氰基氫硼化鈉添加濃度為濃度為lmg/mL)，攪拌均勻，進(jìn)行修飾反應(yīng)6 h ；
3、反應(yīng)結(jié)束后加入過量的甘氨酸終止反應(yīng),得反應(yīng)液；
4、將所得反應(yīng)液過SP陽離子交換層析柱，流動(dòng)相A相:50mmol/L、pH值為4.5的乙酸乙酸鈉緩沖液，流動(dòng)相B相為:在體積為IL的A相中再加入117g氯化鈉而得，B相的梯度濃度59T30% (V/V)，在此條件下進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)各洗脫峰物質(zhì)用SDS-PAGE電泳鑒定目標(biāo)產(chǎn)物，收集得單甲氧基聚乙二醇丙醛修飾重組豬長(zhǎng)效-α干擾素水溶液。
[0074]5、將收集得重組豬長(zhǎng)效-α干擾素水溶液用透析袋除鹽，置于-80 1:超低溫冰箱中預(yù)凍4 h，在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h，即得重組豬長(zhǎng)效-α干擾素。
[0075]所述重組豬-α干擾素純度達(dá)到95%以上；并進(jìn)行SP陽離子交換層析法純化，甲氧基聚乙二醇丙醛對(duì)重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的單修飾率達(dá)到60%以上，延長(zhǎng)重組豬長(zhǎng)效-α干擾素在豬體內(nèi)的半衰期至44.5 h。
[0076]二、一種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑，采用重組豬長(zhǎng)效-α干擾素為主要原料，通過添加劑協(xié)同保護(hù)，經(jīng)溶液配制、脫內(nèi)毒素、除雜除菌、分裝、凍干后制得；其中原料的濃度，以配制溶液的總體積計(jì)為:磷酸氫二鈉0.01mmol/L,氯化鈉9g/L，甘露醇1%(V/V)，重組豬長(zhǎng)效-α干擾素0.5 X 14 U/L (重組豬長(zhǎng)效_ α干擾素的比活性為4.41 X 15 U/mg)。
[0077]三、所述重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑的制備方法，包括如下步驟:
1、在無菌操作室內(nèi)，稱取0.0014g磷酸氫二鈉、9 g氯化鈉、10 mL甘露醇、活力為
0.5X 14 U的重組豬長(zhǎng)效-α干擾素,倒入滅菌鹽水瓶中,用超純水定容至IL ；
2、向配置好的藥液中加入0.2% (W/V)的針用活性炭，攪拌10 min，除去內(nèi)毒素；
3、在已滅菌的布氏漏斗上鋪墊兩層滅菌濾紙，將除內(nèi)毒素的藥液通過濾紙，濾除雜質(zhì)； 4、用0.22 μ m鐘罩式濾器過濾除去雜質(zhì)的藥液，濾除雜菌；
5、將濾除雜菌的藥液以每瓶1mL的份量，分裝到相應(yīng)的西林瓶中，蓋上棉塞封口；
6、將分裝好的藥液在低于凍干保護(hù)劑最低共熔點(diǎn)81:的溫度下，預(yù)凍12 h；
7、預(yù)凍好的藥品，在冷凝器溫度-50°C、壓強(qiáng)范圍10 Pa的條件下，進(jìn)行升華干燥
12h ；
8、所得升華干燥好的藥品在壓強(qiáng)范圍15Pa條件下，-15°C進(jìn)行解析干燥4 h；
9、將冷凍干燥機(jī)壓強(qiáng)降至10Pa，將所得解析干燥好的藥品在-10°C繼續(xù)冷凍干燥
2h，；
10、將凍干后的重組豬長(zhǎng)效-α干擾素注射劑產(chǎn)品，在無菌條件下加塞壓蓋，即得重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑。
[0078]實(shí)施例2:
一、一種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素構(gòu)建和PEG修飾。
[0079](一)重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的構(gòu)建:
1、引物設(shè)計(jì):
利用Primer 5.0，根據(jù)GenBank中登錄號(hào)M28623.1的豬IFN- α基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增豬α-干擾素成熟肽基因的引物。上游引物5’端添加EcoR I限制性酶切位點(diǎn)和ATG起始密碼子，下游引物5’端添加Xho I限制性酶切位點(diǎn)。
[0080]上游引物為5，-GGAATTCTGTGACCTGCCTCAG-3’ ；
下游引物 5’ -CCGCTCGAGTCACTCCTTCTTCCTGAGT-3’。
[0081]引物送經(jīng)Takara公司合成。
[0082]2、豬肝臟基因組DNA的提取:用組織/細(xì)胞DNA (小量)抽提試劑盒(WatsonB1technologies, Inc)對(duì)豬肝臟基因組DNA進(jìn)行提取。
[0083]2.1稱取豬肝臟組織20 mg左右(最大起始量:25 mL)，移入1.5 mL EP離心管中。
[0084]2.2在冰袋上，用配備的組織搗碎棒將組織徹底搗碎。
[0085]2.3加入200 μ L DLT液，渦旋震蕩，使組織碎片重懸。65 °C溫浴，并不斷晃動(dòng)，直至無組織碎片存在。
[0086]2.4 加入 200 μ L DT 液，8 μ LRNase A (核糖核酸酶)和 25 μ L Proteinase K(蛋白酶K)，迅速溫和地來回顛倒離心管徹底混勻。65 °C水浴30 min，并不時(shí)晃動(dòng)。
[0087]2.5以12000 r/min離心5 min，將上清移入離心管中。
[0088]2.6加入200 μ L無水乙醇，混勻后加到吸附柱中，12000 r/min離心30 S。將吸附柱移入一個(gè)干凈的收集管中。
[0089]2.7 加入 500 μ L Wash buffer,靜止 I min 后，12000 r/min 離心 30 S。取出吸附柱，倒掉收集管中的液體后放回。
[0090]2.8重復(fù)步驟7 —次。
[0091]2.9 12000 r/min 離心 I min。
[0092]2.10取出吸附柱放入1.5 mL離心管中。還慢在柱中白色吸附膜中央加入滴加60μ LElut1n buffer, 65。。靜置 5 min 后，12000 r/min 離心 I min。
[0093]2.12 將收集管(DNA) -20 °C保存。
[0094]3、豬α -干擾素成熟肽基因的克隆: PCR反應(yīng)體系
Ex Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L,
1X擴(kuò)增緩沖液5 yL，Mg2+4 yL ,
4種dNTP混合物4 yL，
引物I (上游引物) I UL，
引物2 (下游引物) I yL，
模板 DNAIuL,
雙蒸水33.75 μ L，
將上述溶液混勻后稍離心，再置于PCR儀中，
PCR反應(yīng)條件:
95°C預(yù)變性5 min ,
94 °C 變性 45 s，
61 °C退火45 s (溫度梯度PCR后，選定)，
72 °C延伸 I min,
循環(huán)30次，
最后72 °C延伸7 min。
[0095]4、DNA 電泳:
1.0%瓊脂糖凝膠的制備:稱取1.0 g瓊脂糖，加入100 mLl X TAE緩沖液。電磁爐加熱溶解，冷卻60 °C左右時(shí)，加入5 μ L的EB母液?；靹蚝蟮谷氩搴檬嶙拥碾娪灸０逯小Ｊ覝刈匀荒毯?約30 min)，將膠連同電泳板放入電泳槽中。加入電泳緩沖液，使其沒過膠面。
[0096]加樣5 μ L DNA提取物加I μ L 6XDNA上樣緩沖液，混勻后上樣。
[0097]電泳恒壓110 V電泳約30 min。指示劑遷移到適當(dāng)位置，停止電泳。
[0098]成像將凝膠置于紫外能下觀察將凝膠置于紫外燈下觀察，照相。
[0099]5、目的片段的回收:
5.1在凝膠成像系統(tǒng)中，切下目的DNA片段。轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中。5.2稱量出凝膠塊質(zhì)量，按I g凝膠加入I ml Binding Buffer的比例加入Binding Buffer潤(rùn)旋振蕩后，65 °C溫浴7 min至凝膠完全融化，期間顛倒震蕩。
[0100]5.3轉(zhuǎn)移700 uL DNA脂糖溶液到HiBindTM DNA柱子中，將其放入2 mL收集管中，10，000 g離心I min，取出柱子，棄去收集管中液體。5.4將柱子重新套回收集管中，力口300 μ L Binding Buffer 至 HiBind DNA 柱子中；靜置 I min, 10，000 g 離心 I min,棄去收集管中液體。
[0101]5.5將柱子放回收集管中。加入700 UL SPff Wash buffer。室溫下靜置Imin后
10,000g離心I min。棄去收集管中濾出液。
[0102]5.6重復(fù)步驟5—次.。
[0103]5.7將柱子重新放回收集管，13，000 g離心I min，清除殘留在柱中的液體。5.8把柱子放入1.5 mL離心管，滴加30 μ L洗脫液至柱子膜中央。室溫靜置I min后，13，000g離心I min，濾出液即為是目的DNA溶液，-20 °C保存?zhèn)溆谩?質(zhì)粒的提取
6.1在含Amp (氨芐青霉素)的LB平板上，挑取陽性克隆。轉(zhuǎn)接到5 mL含Amp (氨芐青霉素)(工作濃度為100 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中。37 °C振蕩(轉(zhuǎn)速為300 r/min)培養(yǎng)12 h。6.2取5 mL菌液，批次放入1.5 mL EP管中。10000 g離心I min。6.3棄去上清，向EP管中加含RNase A的溶液I 250 μ L。渦漩振蕩使菌體重懸。
[0104]6.4加入250 μ L溶液II至離心管中，快速溫和顛到數(shù)次，直至裂解液變澄清。
[0105]6.5加350 μ L溶液III至離心管中，快速溫和顛倒數(shù)次，白色絮狀沉淀出現(xiàn)。
[0106]6.6 13000 g離心10 min。6.7輕輕吸取上清(避免沉淀和細(xì)胞碎片的吸入)，移入已套好2 mL離心管的吸附柱中。室溫10000 g離心I min。6.8棄去濾過液。向吸附柱中加入500 μ L Buffer HB。10000 g離心lmin,除去蛋白質(zhì)殘留。
[0107]6.9棄去濾過液。700 μ L Wash Buffer (已按照說明加入100%乙醇稀釋過)清洗吸收柱，10000 g離心I min。
[0108]6.10重復(fù)步驟8，再加700 μ L Wash Buffer清洗吸收柱。6.11 13000 g離心2min取出吸附柱中殘留的乙醇。6.12將吸收柱放入干凈1.5 mL離心管，滴加30 μ L TE緩沖液在吸附柱濾膜中央。靜置I min后13000 g離心I min。
[0109]7、質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的雙酶切
取一個(gè)干凈、滅菌的200 μ L的EP管，按下表加入各種試劑水15 μ L,
1XH buffer5 μ L,
PCR產(chǎn)物(或質(zhì)粒DNA)25 μ L，
EcoR I2.5 μ L，
Xho I2.5 μ L，
總體積50 μ L，
PCR產(chǎn)物，37 °C保溫2 11;質(zhì)粒0嫩，37 °C保溫過夜。
[0110]8、DNA片段的連接；
連接反應(yīng)體系如下:
PCR回收產(chǎn)物7.0 μ L,
2XT4DNA連接酶緩沖液 1.0 μ L， pET32a Vector1.0 μ L,
T4DNA 連接酶1.0 μ L,
共計(jì)10.0 μ L，
混勻離心，16 1:放置過夜(以上均在冰上操作)。
[0111]9、感受態(tài)細(xì)胞的制備:
9.1受體菌的培養(yǎng):從含LB平板上挑去活化的DH5 α大腸菌落，轉(zhuǎn)接到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)過夜。次日，將菌液按照1:100的比例接種到100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)，直至OD6tltl值達(dá)到0.6、.8。 9.2感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法):
9.2.1培養(yǎng)液冰上預(yù)冷10 min后，4 °C 3000 g離心10 min。9.2.2棄去上清，用10 mL0.05 mol/L的CaCl2溶液(已4°C預(yù)冷)輕輕吹打，使細(xì)胞懸浮。冰上預(yù)冷30 min。4 V3000 g離心10 min。9.2.3棄去上清，加入4 mL含15%甘油的0.05 mol/L的CaCl2溶液(已4 °C預(yù)冷)輕輕吹打，使細(xì)胞懸浮。將裝有細(xì)胞懸液的錐形瓶置于冰上。9.2.4將感受態(tài)細(xì)胞裝入無菌、已預(yù)冷的1.5 mL EP管(200 yL/支)，-70 °C保存。
[0112]9.3感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化:
9.3.1將經(jīng)過滅菌的1.5 mL的EP放入-20 °C的冰箱預(yù)冷，然后每管加入200 μ L的感受態(tài)細(xì)胞；再加入連接產(chǎn)物5 μ L ;冰浴40?60 min。放置同時(shí)設(shè)立對(duì)照，陽性對(duì)照為Control Insert DNA連接產(chǎn)物；空白對(duì)照為酶切后的空載體。
[0113]9.3.2將EP管放入42 °C水浴鍋中預(yù)熱好的架子上，計(jì)時(shí)90 s (此時(shí)不能搖動(dòng))。
[0114]9.3.3計(jì)時(shí)結(jié)束后，將EP迅速放入冰浴中2?3 min。
[0115]9.3.4將連接產(chǎn)物放入到800 μ L的無菌LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，150 r/min培養(yǎng)I h，使細(xì)菌復(fù)原，并是其抗生素基因得以表達(dá)。
[0116]9.3.5轉(zhuǎn)移100 μ L的培養(yǎng)液，在含有Amp (氨芐青霉素)的LB平板上涂布(如菌濃過大，可以將涂布量降低)。
[0117]9.3.6將平板室溫放置，直至液體被吸干(轉(zhuǎn)化前，先將平板從4 °C拿出，再倒置放入培養(yǎng)箱，這樣避免了對(duì)轉(zhuǎn)化菌的再刺激)。
[0118]9.3.7 37 1:培養(yǎng)過夜，次日可觀察到轉(zhuǎn)化克隆的出現(xiàn)。
[0119]10陽性克隆的鑒定:
10.1菌落PCR鑒定:
以Amp (氨芐青霉素)平板上出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化克隆為模板，挑取5個(gè)以上，按照先前的PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增；通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。
[0120]10.2雙酶切鑒定:
將經(jīng)過鑒定為陽性的克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。將其加入含Amp (氨芐青霉素)的LB液體培養(yǎng)中，37 °C, 180 r/min，培養(yǎng)過夜。達(dá)到一定菌濃后，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒雙酶切，37 °C，2 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0121]水3 yL，
1XH bufferI μ L,
PCR產(chǎn)物(或質(zhì)粒DNA)5 μ L，
EcoR I0.5 μ L，
Xho I0.5 μ L，
總體積10 μ L，
測(cè)序鑒定:
將雙酶切為陽性的質(zhì)粒，送TaKaRa公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GeneBank中登錄號(hào)為M28623.1的豬IFN-α成熟肽基因序列進(jìn)行比對(duì)。
[0122]11重組豬-α干擾素的誘導(dǎo)表達(dá):
11.1種子菌的活化:
用接種環(huán)挑取少量重組菌株菌液在含有氨芐青霉素的LB平板上劃線，放入37 °C培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)過夜。次日，平板上出現(xiàn)的單菌落即為種子菌。
[0123]11.2種子菌的一次活化:用接種環(huán)挑取種子菌單菌落，接種于5 ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C, 180 r/min，培養(yǎng)過夜。
[0124]11.3種子菌的擴(kuò)大培養(yǎng):將活化的菌液按照1:100的比例接種于50 ml含Amp(氨芐青霉素)的LB液體培養(yǎng)基中37°C，180 r/min，培養(yǎng)過夜。然后，按照同樣的比例放大到5L的錐形瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同樣為37 V，180 r/min。待其OD6tltl值到達(dá)0.6^0.8時(shí)，即可進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0125]11.4 重組豬-α干擾素的誘導(dǎo)表達(dá):
?向擴(kuò)大培養(yǎng)的種子菌中加入5mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷溶液ImL, 22 °C下誘導(dǎo)10 h。將誘導(dǎo)結(jié)束后得到的培養(yǎng)液于10000 r/min的離心速度下離心I min，收集菌體沉淀，稱取菌體沉淀的重量，并加入菌體沉淀重量10倍體積的裂解液，吹打使菌體重懸，預(yù)冷后超聲破碎，將超聲破碎后的液體于4 0Cuoooo r/min的離心速度下離心10 min，取離心上清液，加入與離心上清液等體積的2 X Loading Buffer (上樣緩沖液)，取上述混合溶液于100 °C下煮沸10 min,得重組豬-α干擾素粗品；
12重組豬-α干擾素粗品的純化:
12.1往層析柱中填裝金屬螯合親和層析介質(zhì)；
12.2 依次用超純水、I mol/L NaOH,0.2 mol/L EDTA 溶液各清洗一次。0.1 mol/LNiS04 (內(nèi)含0.3 mol/L NaCl)溶液過柱，掛Ni。再用水清洗一次，除去游離的Ni離子。
[0126]12.3 用平衡 Buffer (50 mmol/L、ρΗ8.0 的 Tris-HCl 緩沖液，內(nèi)含 0.1 mol/LNaCl)平衡，直至紫外檢測(cè)值不變。
[0127]12.4上樣，使裂解液隨流動(dòng)相進(jìn)入金屬螯合親和層析柱；
12.5 用平衡 Buffer (50 mmol/L、ρΗ8.0 的 Tris-HCl 緩沖液，內(nèi)含 0.1 mol/L NaCl)平衡柱子，洗去未與介質(zhì)結(jié)合的雜質(zhì)，紫外檢測(cè)值不變，將其調(diào)零，作為基準(zhǔn)。
[0128]12.6流動(dòng)相A相:50mmol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，流動(dòng)相B相:在體積為IL的A相中加入34 g咪唑而得，B相的梯度濃度為2 9Γ80 % (V/V)，進(jìn)行梯度洗脫，收集每個(gè)梯度的洗脫峰。
[0129]12.7對(duì)每個(gè)洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定目標(biāo)蛋白，將經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定為重組豬-α干擾素的水溶液用透析袋除鹽，置于-80 °C超低溫冰箱中預(yù)凍4 h，在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h，即得精制重組豬-α干擾素。
[0130](二)重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的修飾:
1、用PH值為10.0的磷酸鹽緩沖液，將上述步驟所得的精制重組豬-α干擾素配置成
2.0mg/mL的重組豬-α干擾素的磷酸鹽反應(yīng)溶液；
2、在反應(yīng)溫度4°C條件下，將甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺添加到重組豬-α干擾素的磷酸鹽反應(yīng)溶液中，其中甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺與重組豬-α干擾素的摩爾比為6:1，再加入氰基氫硼化鈉(以反應(yīng)溶液的總體積計(jì)，氰基氫硼化鈉添加濃度為濃度為lmg/mL)，攪拌均勻，進(jìn)行修飾反應(yīng)30 h；
3、反應(yīng)結(jié)束后加入過量的甘氨酸終止反應(yīng),得反應(yīng)液；
4、將所得反應(yīng)液過SP陽離子交換層析柱，流動(dòng)相A相:50mmol/L、pH值為4.5的乙酸乙酸鈉緩沖液，流動(dòng)相B相為:在體積為IL的A相中再加入117 g氯化鈉而得，B相的梯度濃度59T30% (V/V)，在此條件下進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)各洗脫峰物質(zhì)用SDS-PAGE電泳鑒定目標(biāo)產(chǎn)物，收集得單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺修飾重組豬長(zhǎng)效-α干擾素水溶液。
[0131]5、將收集得重組豬長(zhǎng)效-α干擾素水溶液用透析袋除鹽，置于-80 1:超低溫冰箱中預(yù)凍4 h，在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h，即得重組豬長(zhǎng)效-α干擾素。
[0132]二、一種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑，采用重組豬長(zhǎng)效-α干擾素為主要原料，通過添加劑協(xié)同保護(hù)，經(jīng)溶液配制、脫內(nèi)毒素、除雜除菌、分裝、凍干后制得；其中原料的濃度，以配制溶液的總體積計(jì)為:磷酸氫二鈉0.03 mmol/L，氯化鈉15 g/L，甘露醇3%(V/V)，重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的濃度為1.5Χ104 U/L (重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的比活性為
4.41 X 15 U/mg)。
[0133]三、所述重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑的制備方法，包括如下步驟:
1、在無菌操作室內(nèi)，稱取0.0085 g磷酸氫二鈉、30 g氯化鈉、60 mL甘露醇、活力為
3.0XlO4 U的重組豬長(zhǎng)效-α干擾素,倒入滅菌鹽水瓶中,用超純水定容至2 L ；
2、向配置好的藥液中加入0.4% (W/V)的針用活性炭，攪拌20 min，除去內(nèi)毒素；
3、在已滅菌的布氏漏斗上鋪墊兩層滅菌濾紙，將除內(nèi)毒素的藥液通過濾紙，濾除雜質(zhì)；
4、用0.22 μ m針頭式濾器過濾除去雜質(zhì)的藥液，濾除雜菌；
5、將濾除雜菌的藥液以每瓶20mL的份量，分裝到相應(yīng)的西林瓶中，蓋上棉塞封口 ；
6、將分裝好的藥液在低于凍干保護(hù)劑最低共熔點(diǎn)101:的溫度下，預(yù)凍12 h；
7、預(yù)凍好的藥品，在冷凝器溫度-40°C、壓強(qiáng)范圍30 Pa的條件下，進(jìn)行升華干燥12
h ；
8、所得升華干燥好的藥品在壓強(qiáng)范圍30Pa條件下，-15 °C進(jìn)行解析干燥6 h；
9、將冷凍干燥機(jī)壓強(qiáng)降至10Pa，將所得解析干燥好的藥品在-10 °C繼續(xù)冷凍干燥2
h ；
10、將凍干后的重組豬長(zhǎng)效-α干擾素注射劑產(chǎn)品，在無菌條件下加塞壓蓋，即得重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑。
[0134]四、上述重組豬長(zhǎng)效-α干擾素活性測(cè)定:
實(shí)驗(yàn)例I重組豬長(zhǎng)效-α干擾素體外活性:
1、將重組豬長(zhǎng)效-α干擾素樣品用含7%新生牛血清的測(cè)定培養(yǎng)基稀釋，使最終蛋白濃度為10-100 μ g/mL,并作4倍系列稀釋。
[0135]2、取保存的病毒，室溫融化，用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至100XCCID5(I。
[0136]3、按上述方法培養(yǎng)細(xì)胞并鋪板，培養(yǎng)至細(xì)胞豐度達(dá)到80%以上。
[0137]4、棄去上清，每孔加梯度稀釋的干擾素100 UL作用18 h，空白對(duì)照組和病毒對(duì)照組加7%測(cè)定培養(yǎng)基。
[0138]5、用少量無血清培養(yǎng)基洗去殘余血清，每孔加100 μ L病毒稀釋液攻毒I h，空白對(duì)照組和干擾素最高濃度組加入100 yL無血清培養(yǎng)基。I h后，棄去上清，所有孔加入攻毒培養(yǎng)基100 uL, 37 1:培養(yǎng)觀察，每日記錄病變情況。
[0139]6、用Reed-Muench法計(jì)算重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的生物學(xué)活性。
[0140]將重組豬長(zhǎng)效-α干擾素溶液用7%測(cè)定培養(yǎng)基稀釋100倍，終濃度為37.4 μ g/mL,用于4倍系列稀釋。
[0141]按計(jì)劃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每天觀察，記錄重組豬長(zhǎng)效-α干擾素對(duì)Marc-145細(xì)胞病變保護(hù)的結(jié)果，按Reed-Muench法計(jì)算公式計(jì)算重組豬長(zhǎng)效-α干擾素活性，結(jié)果顯示:重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的比活性為4.41Χ105 U/mg，細(xì)胞對(duì)照組均未發(fā)生病變，病毒對(duì)照組均出現(xiàn)病變。
[0142]實(shí)驗(yàn)例2:重組豬長(zhǎng)效-α干擾素在仔豬體內(nèi)測(cè)活:
重組豬長(zhǎng)效-α干擾素皮下給藥后144 h仍可測(cè)出24.45±8.78 μ g/ml的血藥濃度。與未修飾前比較，清除半衰期從3.2 h延長(zhǎng)到44.5 h，延長(zhǎng)近14倍。
[0143]實(shí)驗(yàn)例3:劑型、劑量、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。
[0144]1、本發(fā)明為一種注射粉針，滅菌蒸餾水稀釋后即可使用；
2、根據(jù)體外活性測(cè)定，設(shè)計(jì)了5 yg/kg,8 μ g/kg, 12 μ g/kg的注射量，進(jìn)行仔豬實(shí)驗(yàn)，肌肉注射，測(cè)定在豬體內(nèi)的半衰期，優(yōu)化選擇獲得重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑的有效劑量為8 μ g/kg,肌肉注射；
3、考察豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑分別在4°C、室溫、37 °C下的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示:豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑在4 °C下保存期為2年；室溫條件下為I年；37 1:條件下為I個(gè)月。
[0145]實(shí)驗(yàn)例4:藥學(xué)研究:藥理毒理實(shí)驗(yàn)。
[0146]1、急毒:在豚鼠中未獲得最大致死劑量。
2、一般藥理、特殊毒理、免疫毒性、局部刺激和體外溶血測(cè)定未見明顯異常。
[0147]3、長(zhǎng)期毒性
三個(gè)劑量組的注射量分別為10、30、90 ug/kg，皮下注射，隔日注射一次，連續(xù)給藥30天，停藥恢復(fù)30天。一般情況(體溫、體重、進(jìn)食)、生化、凝血指標(biāo)、尿液、眼部、心電圖、骨髓和臟器系數(shù)無明顯異常。未發(fā)現(xiàn)臟器發(fā)生病理性改變。
[0148]4、豬藥代動(dòng)力學(xué)
皮下給藥后144 h仍可測(cè)出24.45±8.78 ug/ml的血藥濃度。與未修飾前比較，清除半衰期從3.2 h延長(zhǎng)到44.5 h，延長(zhǎng)近14倍；平均滯留時(shí)間從7.79 h延長(zhǎng)至47.5 h，延長(zhǎng)了近7倍。
[0149]5、免疫原性:本品在豬體內(nèi)產(chǎn)生的抗體滴度為1:500，與未修飾前相比，降低了近200 倍。
[0150]五、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益的分析:
經(jīng)市場(chǎng)分析，目前沒有良好的豬抗病毒藥物，目前所使用的豬干擾素半衰期短，價(jià)格昂貴，每年必須重復(fù)用藥，每針20-30元，一個(gè)療程需注射5-7針，多數(shù)養(yǎng)豬戶無法承擔(dān)。本發(fā)明研制的豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑一般只需注射一次，可取得良好效果，每針在10元以內(nèi)。按目前的養(yǎng)殖規(guī)模和發(fā)展趨勢(shì)，年生產(chǎn)2000萬劑，每年即可取得上千萬的經(jīng)濟(jì)效益。社會(huì)效益:養(yǎng)豬生產(chǎn)關(guān)系國(guó)計(jì)民生的大問題，近年來豬肉價(jià)格的節(jié)節(jié)攀升已經(jīng)證明了這個(gè)問題。豬肉價(jià)格會(huì)嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品價(jià)格。有效防治豬傳染性疾病，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展無疑對(duì)保障市場(chǎng)供給，穩(wěn)定人們的物質(zhì)生活具有顯著的社會(huì)效益。
【權(quán)利要求】
1.一種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素(rpoIFN- α )，其特征在于:先使用原核表達(dá)系統(tǒng)可溶性表達(dá)豬-α干擾素，再使用聚乙二醇修飾重組豬-α干擾素得重組豬長(zhǎng)效-α干擾素(rpoIFN- α )； 所述聚乙二醇修飾劑為甲氧基聚乙二醇丙醛或甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺。
2.一種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的構(gòu)建方法，包括如下步驟: 1)引物設(shè)計(jì):根據(jù)GenBank中登錄號(hào)Μ28623.1的豬干擾素的基因序列，利用Primer5.0生物軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增豬干擾素成熟肽基因的引物: 上游引物:5’ -GGAATTCTGTGACCTGCCTCAG-3’， 下游引物:5’ -CCGCTCGAGTCACTCCTTCTTCCTGAGT-3，； 2)豬肝臟基因組DNA提取:用DNA抽提試劑盒對(duì)豬肝臟基因組DNA進(jìn)行提??； 3)豬-α干擾素成熟肽基因的克隆:根據(jù)步驟1)、2)所得引物與豬肝臟基因組DNAjlJ用PCR擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)豬-α干擾素成熟肽基因進(jìn)行克??； 4)DNA電泳:采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)步驟3)所得豬-α干擾素成熟肽基因進(jìn)行電泳分離，并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收，得到PCR回收產(chǎn)物； 5)提取質(zhì)粒:用質(zhì)粒提取試劑盒對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行提取； 6)質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物的雙酶切:對(duì)步驟4)所得PCR回收產(chǎn)物和步驟5)所得質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切； 7)DNA片段的連接:將步驟6)所得雙酶切后的PCR回收產(chǎn)物與載體質(zhì)粒在Τ4連接酶的作用下進(jìn)行連接； 8)感受態(tài)細(xì)胞的制備:挑取活化的大腸桿菌于LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)，直至0D_值達(dá)到0.6^0.8，取培養(yǎng)液用Cacl2法制備感受態(tài)細(xì)胞； 9)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化:將步驟7)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到新鮮制備的步驟8)所得感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37 1:培養(yǎng)過夜； 10)陽性克隆的鑒定:取步驟9)中含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落經(jīng)PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步鑒定；取通過PCR鑒定為陽性的克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、提取質(zhì)粒、雙酶切、酶切產(chǎn)物鑒定，鑒定為陽性即表示載體構(gòu)建成功； 11)重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá):挑選步驟10)制備得的陽性克隆于100mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 0C >180 r/min培養(yǎng)過夜，直至OD6tltl值為0.6?0.8時(shí)，加入f 5mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷溶液lmL，22 °C下誘導(dǎo)Γ?Ο h，將誘導(dǎo)結(jié)束后得到的培養(yǎng)液于10000 r/min的離心速度下離心I min,收集菌體沉淀,稱取菌體沉淀的重量,并加入菌體沉淀重量3?10倍體積的裂解液，吹打使菌體重懸，預(yù)冷后超聲破碎，將超聲破碎后的液體于4 0CuOOOO r/min的離心速度下離心10 min，取離心上清液，加入與離心上清液等體積的2XLoading Buffer (上樣緩沖液)，取上述混合溶液于100 °C下煮沸10 min,得重組豬-α干擾素粗品； 12)重組豬-α干擾素粗品的純化:將步驟11)所得重組豬-α干擾素粗品過鎳離子金屬螯合親和層析柱進(jìn)行分離純化，用洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集每個(gè)梯度的洗脫峰，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定目標(biāo)蛋白，將經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定為重組豬-α干擾素的水溶液用透析袋除鹽，置于-80 °C超低溫冰箱中預(yù)凍4 h，在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h，即得精制重組豬-α干擾素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組豬長(zhǎng)效-α干擾素(rpoIFN-α)的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟5)、6)和7)所述質(zhì)粒為質(zhì)粒pET-32a。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組豬長(zhǎng)效-α干擾素(rpoIFN-α)的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟8)中所述大腸桿菌為BL21 (DE3)型大腸桿菌菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組豬長(zhǎng)效-α干擾素(rpoIFN-α)的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟12)中所述梯度洗脫，流動(dòng)相A相:50mmol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，流動(dòng)相B相:在體積為IL的A相中再加入34 g咪唑而得，B相的梯度濃度為2 9Γ80 % (V/V)。
6.一種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的修飾方法，包括如下步驟: 1)用磷酸鹽緩沖液將上述制得的精制重組豬-α干擾素配置成重組豬-α干擾素的磷酸鹽反應(yīng)溶液； 2)在反應(yīng)溫度4°C條件下，將聚乙二醇修飾劑添加到步驟I)所述含重組豬-α干擾素的磷酸鹽反應(yīng)溶液中，再加入氰基氫硼化鈉，攪拌均勻，進(jìn)行修飾反應(yīng)； 3)向步驟2)所述溶液中加入過量的甘氨酸終止反應(yīng)，得反應(yīng)液； 4)將步驟3)所得反應(yīng)液過SP陽離子交換層析柱，用洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)各洗脫峰物質(zhì)用SDS-PAGE電泳鑒定目標(biāo)產(chǎn)物，收集得單聚乙二醇修飾重組豬長(zhǎng)效-α干擾素水溶液，將所得重組豬長(zhǎng)效干擾素水溶液用透析袋除鹽，置于-80 °C超低溫冰箱中預(yù)凍4h，在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h，即得修飾的重組豬長(zhǎng)效-α干擾素； 其中，步驟I)所述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為4.(Γ10.0，磷酸鹽緩沖溶液中重組豬- α干擾素的濃度為1.2?2.0mg/mL ； 步驟2)中所述聚乙二醇修飾劑為甲氧基聚乙二醇丙醛或甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺，所述聚乙二醇修飾劑與重組豬-α干擾素的摩爾比為1:1飛:1，以反應(yīng)溶液的總體積計(jì)，添加的氰基氫硼化鈉濃度為lmg/mL，修飾反應(yīng)時(shí)間為6?30 h ； 步驟4)中所述梯度洗脫，流動(dòng)相A相:50mmol/L、pH值為4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液，流動(dòng)相B相為:在體積為IL的A相中再加入117g氯化鈉而得，B相的梯度濃度為5°/Γ30%(V/V)。
7.—種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑，其特征在于:采用重組豬長(zhǎng)效-α干擾素為主要原料，通過添加劑協(xié)同保護(hù)，經(jīng)溶液配制、脫內(nèi)毒素、除雜除菌、分裝、凍干后制得； 所述原料的濃度，以配制溶液的總體積計(jì)為:磷酸氫二鈉0.0Γ0.03 mmol/L，氯化鈉9?15 g/L，凍干保護(hù)劑1%?3% (V/V)，重組豬長(zhǎng)效-α干擾素0.5 X 14?1.5 X 14 U/L，其中重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的比活性為4.41 X 15 U/mg ； 所述重組豬長(zhǎng)效-α干擾素為權(quán)利要求6所得； 所述凍干保護(hù)劑為甘露醇。
8.—種重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑的制備方法，包括如下步驟: 1)在無菌操作室內(nèi)，根據(jù)要配制溶液的體積，稱取磷酸氫二鈉、氯化鈉、凍干保護(hù)劑和重組豬長(zhǎng)效-α干擾素，倒入滅菌鹽水瓶中，用超純水定容至要配制的體積；其中，以配制溶液的總體積計(jì)，磷酸氫二鈉、氯化鈉、凍干保護(hù)劑、重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的最終濃度為磷酸氫二鈉0.0Γ0.03mmol/L,氯化鈉9?15g/L，凍干保護(hù)劑1%?3% (V/V)，重組豬長(zhǎng)效-α干擾素0.5Χ104?1.5X104U/L (重組豬長(zhǎng)效-α干擾素的比活性為4.41 X 15 U/mg)； 2)在步驟I)配置好的藥液中加入內(nèi)毒素脫除劑，攪拌1(T20min ； 3)在已滅菌的布氏漏斗上鋪墊兩層滅菌濾紙，將步驟2)所得藥液通過濾紙，濾除雜質(zhì)； 4)用0.22 μ m不銹鋼鐘罩式濾器過濾步驟3)所得藥液，濾除雜菌； 5)將步驟4)所得濾除雜菌的藥液以每瓶1lOmL的份量，分裝到相應(yīng)的西林瓶中；6)將步驟5)所得藥液在低于凍干保護(hù)劑最低共熔點(diǎn)8?101:的溫度下，預(yù)凍12 h； 7)將步驟6)預(yù)凍好的藥品，在冷凝器溫度〈-40°C、壓強(qiáng)范圍l(T30Pa的條件下，進(jìn)行升華干燥12h ； 8)將步驟7)所得升華干燥好的藥品在壓強(qiáng)范圍15?30Pa條件下，_15°C進(jìn)行解析干燥4?6 h ； 9)將冷凍干燥機(jī)壓強(qiáng)降至10Pa，將步驟8)所得解析干燥好的藥品在-10°C繼續(xù)冷凍干燥2h ； 10)將步驟9)凍干后的重組豬長(zhǎng)效-α干擾素注射劑產(chǎn)品，在無菌條件下加塞壓蓋，即得重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑的制備方法，其特征在于，所述凍干保護(hù)劑為甘露醇，所述重組豬長(zhǎng)效- α干擾素為權(quán)利要求6所得。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述重組豬長(zhǎng)效-α干擾素凍干注射劑的制備方法，其特征在于，所述內(nèi)毒素脫除劑為0.29ΓΟ.4% (W/V)的針用活性炭。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104262480SQ201410507156
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】蔡家利, 吳勝昔, 王遠(yuǎn)強(qiáng), 胡仁建, 戶國(guó)達(dá), 尹忠寶 申請(qǐng)人:重慶理工大學(xué)