加強了基因簇表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種加強了基因簇表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌及其構(gòu)建方法。它過量表達(dá)了生物合成豐加霉素的整個toy基因簇，具有比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌( Streptomyces diastatochromogenes )1628更高的豐加霉素合成能力。構(gòu)建過程如下：1）構(gòu)建表達(dá)載體pSET152-toyAM； 2）利用接合轉(zhuǎn)移法將所述的表達(dá)載體整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體，獲得所述的工程菌。利用接合轉(zhuǎn)移法將載體pSET152-toyAM特異性的整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌( Streptomyces diastatochromogenes )1628的染色體，獲得了遺傳穩(wěn)定的工程菌。與原始菌株相比，豐加霉素產(chǎn)量提高了4.5倍。
【專利說明】加強了基因簇表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌及其構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及通過加強基因簇toy AM在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的表達(dá)提高豐加霉素產(chǎn) 量，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 豐加霉素是一種新型核苷類抗生素，分子式為C12H13N 5O4，核糖C1連接類似鳥嘌呤 的脫氮雜嘌呤環(huán)，核心結(jié)構(gòu)為吡咯嘧啶核苷類似物。作用機理主要是通過抑制微生物的轉(zhuǎn) 錄而影響菌體的生長，其生物活性研究報道主要集中在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。近期有研究發(fā)現(xiàn)豐 加霉素對多種植物疫病具有良好的防治效果，長期使用不會造成環(huán)境污染，而且對植物生 長也具有一定的調(diào)節(jié)作用。因此，豐加霉素在農(nóng)業(yè)植物病害防治領(lǐng)域具有的應(yīng)用潛力。相 對于化學(xué)合成法，生物法合成豐加霉素以可再生資源為原料，具有反應(yīng)條件溫和、污染少以 及成本低廉等優(yōu)點，因此，生物合成法是目前豐加霉素工業(yè)化生產(chǎn)比較經(jīng)濟有效的方法。
[0003] 豐加霉素屬于次級代謝產(chǎn)物，合成途徑復(fù)雜，受到多種因素的限制與調(diào)控，導(dǎo)致豐 加霉素合成水平較低，難以規(guī)?；a(chǎn)。解決該問題的現(xiàn)有辦法一般都是通過傳統(tǒng)的誘變 育種作為主要手段篩選高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的生產(chǎn)菌株，但篩選到高效菌株的不確定因素多、周期長。
[0004] 如何利用分子生物學(xué)等先進(jìn)的技術(shù)手段改良微生物進(jìn)一步提高豐加霉素的產(chǎn)量 成為一條可行的思路。McCarty等人以一株合成豐加霉素菌株 (ATCC14673)為起始研究對象，克隆了生物合成豐加霉素基因簇，闡明了豐加霉素的合 成過程及調(diào)控機制，研究發(fā)現(xiàn)豐加霉素由GTP為前體，經(jīng)多步反應(yīng)合成豐加霉素，其中 由toyAM基因負(fù)責(zé)豐加霉素的生物合成，且成簇排列(基因簇)。本研究小組在前期的 研究中以具有自主知識產(chǎn)權(quán)的豐加霉素生產(chǎn)菌株淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 i/iasiaiocAroffiogefles) 1628為研究對象，克隆了基因簇中的部分結(jié)構(gòu)基因，如toyB、 toyF等，并嘗試在51 1628中過量表達(dá)，同時也克隆了 51 1628中負(fù)責(zé)次級代謝的多效調(diào)控因子adpA，但是豐加霉素產(chǎn)量提 高的幅度只有20% - 30%，對于工業(yè)化生產(chǎn)來說仍有待提高。利用代謝工程技術(shù)增加原始菌 株生物合成豐加霉素基因簇而不是單個結(jié)構(gòu)基因的拷貝數(shù)，從而增加豐加霉素合成的代謝 通量而提高豐加霉素產(chǎn)量因為涉及問題復(fù)雜而未見相關(guān)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種加強基因簇toyAM表達(dá)的重組淀粉 酶產(chǎn)色鏈霉菌及構(gòu)建方法與用途。
[0006] 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628是一株拮抗放線 菌，其發(fā)酵液對多種植物病原真菌具有較強的抑制作用，經(jīng)分離提取，確定其主要有效成分 為豐加霉素，尚未見通過增加淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌豐加霉素生物合成基因簇的拷貝數(shù)來提高 豐加霉素產(chǎn)量的研究報道。
[0007] 本發(fā)明首先從以淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 (菌株的保藏編號為CGMCC NO. 2060)中克隆負(fù)責(zé)豐加霉素生物合成的基因簇toyAM， 并將該基因簇與鏈霉菌整合型質(zhì)粒PSET152連接，成功構(gòu)建了基因簇toyAM的重組載體 pSET152-toyAM，并利用接合轉(zhuǎn)移法將其特異性的整合在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌聊cm 1628 染色體上。
[0008] -種加強了基因簇toyAM表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌，它過量表達(dá)了基 因簇toyAM，具有比保藏編號為CGMCC NO. 2060淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 i/iasiaiocAroffiogefles) 1628更高的豐加霉素表達(dá)能力。
[0009] 所述的原始菌為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（5?/·<9/7?ο?_7--(95· 1628。
[0010] 所述的基因簇toyAM來自于待重組的原始菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（5?/·--/7?ο?_7----5· diastatochromogenes) 1628〇
[0011] 所述的基因簇toyAM整合入原始菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（5?/·--/7?ο?_7----5· diastatochromogenes) 。
[0012] 所述的加強了基因簇toyAM表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的構(gòu)建方法，過程如 下： 1) 構(gòu)建表達(dá)載體pSET152-toy AM ; 2) 利用接合轉(zhuǎn)移法將所述的表達(dá)載體整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體，獲得所述的重 組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌。
[0013] 利用載體PSET152實現(xiàn)基因簇toy AM的過量表達(dá)，利用接合轉(zhuǎn)移法 將載體pSET 152-toy AM特異性的整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 1628的染色體，獲得了遺傳穩(wěn)定的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌。
[0014] 所述的加強了基因簇toyAM表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的用途，將重組淀粉酶 產(chǎn)色鏈霉菌進(jìn)行發(fā)酵，與原始菌株相比，豐加霉素產(chǎn)量提高了 4. 5倍。
[0015] 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明加強豐加霉素生物合成基因簇toy AM不僅成功在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中表達(dá)，而 且與原始菌相比，豐加霉素產(chǎn)量提高了 4. 5倍，出乎意料，為進(jìn)一步提高豐加霉素產(chǎn)量，早 日實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好基礎(chǔ)，具有可預(yù)期的市場前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是重組質(zhì)粒pSET152_toy AM的構(gòu)建示意圖。
[0017] 圖2是重組質(zhì)粒pMD18-T- toyAM的酶切驗證。
[0018] I. DNA Marker DL2000 ；2. λ mk/Η?η? III Marker ；3.質(zhì)粒 pMD18-T_toyAM ; 4. pMD18-T-toyAM/fefflH I〇
[0019] 圖3是重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒pSET152_toy AM的酶切電泳驗證圖。
[0020] 1. λ DNA/Vifld III Marker ;2· pSET152-toy AM/fe?H I。
[0021] 圖 4 是 5： a/tos J1704-T0Y AM HPLC 檢測豐加霉素圖； A.原始菌株 5： 重組菌株 5： <3^?·5?1074-Τ0ΥΑΜ。
[0022] 圖 5 是重組菌 51 1628-Τ0Υ AM 的 PCR 電泳驗證圖； I. DL2000 Marker ;2-3.基因工程菌株；4.原始菌株。

【具體實施方式】
[0023] 以下結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0024] 實施例1 :基因簇toyAM的擴增及生物學(xué)功能驗證 以 51 1628 染色體基因組為模板，以 Ptoy FifeffiHI 和 PtoyF R fe?HI為引物，PCR擴增獲得含有漢·ΗΙ酶切位點的基因簇toy AM基因，與pMD18-T Vector 連接，構(gòu)建克隆載體pMD18-T-toy AM,將克隆載體pMD18-T-toy AM轉(zhuǎn)化至受體大腸桿菌中， 涂布于含氨芐抗性的LB瓊脂平板上，37 °C培養(yǎng)過夜后，隨機挑取陽性轉(zhuǎn)化子酶切鑒定后 送上海生工測序并進(jìn)行序列分析，用ifeMH酶切得到兩端含有ifeMH酶切位點的基因簇toy AM,與同樣利用fe?HI酶切且去磷酸化的鏈霉菌整合型穿梭表達(dá)載體pSET152連接，得到 重組穿梭表達(dá)載體pSET152-toy AM。經(jīng)酶切驗證后，將其轉(zhuǎn)入凡^〇/丑77烈^76UZ8002)， 在卡那抗性和阿泊拉霉素抗性的LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子萬.co/iET 12567 (pUZ8002， pSET152-toy AM),以萬· co/iET12567(pUZ8002, pIB139-toyF)為供體，模式鏈霉菌 aJTws J1074為受體，利用接合轉(zhuǎn)移法將pSET152_toy AM整合在鏈霉菌51 Wto1S J1074染色體上，在阿泊拉霉素抗性MS平板上篩選陽性接合子，即得到重組鏈霉菌 J1074-T0Y AM。
[0025] 以51 1628染色體為模板,設(shè)計兩條引物，PCR擴增toy AM,引物設(shè)計如下： toy F :5' -CGCGGATCCATGTATCGCACAGACGACGGACC-3' toy R Bamm -CGCGGATCCATGGCTTTTCGGATCACC -3， 重組質(zhì)粒pMD18-T-toy AM以限制性內(nèi)切酶酶切驗證如圖2所示，重組質(zhì)粒 PMD18-T- toy AM酶切獲得約11 kb和2. 7kb的DNA片段，分別與基因簇toy AM和質(zhì) 粒PMD18-T的大小一致，說明重組克隆載體連接正確。對重組質(zhì)粒pMD18-T-toy AM進(jìn) 行測序，序列分析表明插入片段為10410 bp的序列，與NCBI已公布的不吸水鏈霉菌（5： 豐加霉素合成基因簇基因序列同源性最高達(dá)89%?；虼睾怂嵝蛄腥鏢EQ ID NO: 1 所示。
[0026] 整合型重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒pSET152_toy AM的及酶切驗證結(jié)果如圖3所示，重 組質(zhì)粒pSET152-toy AM經(jīng)fe?HI酶切釋放11 kb的片段與基因簇toy AM大小一致，說明 質(zhì)粒pSET152-toy AM構(gòu)建正確，以接合轉(zhuǎn)移法將其整合在模式鏈霉菌 J1074的染色體上，在阿泊拉霉素抗性平板上隨機挑取若干單菌落于CP培養(yǎng)基中培養(yǎng)多 次后，提取染色體。PCR實驗均能擴增出阿泊拉霉素抗性基因 a/7_r，證明重組菌5： WZw1S J1074-T0Y AM構(gòu)建成功，且遺傳穩(wěn)定。對重組菌J1074-T0YF以及原始菌5： a/tos J1074 進(jìn)行250 mL搖瓶發(fā)酵實驗，從發(fā)酵角度對5： Wto1S J1074中基因簇toyAM的功能進(jìn)行驗 證。往復(fù)式搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，28°C，發(fā)酵96h，對照組為鏈霉菌5： WZw1S J1074。如圖 4所示，重組菌可檢測到豐加霉素特征峰，且重復(fù)性良好。說明克隆獲得的基因簇toyAM具 有生物學(xué)功能，可以實現(xiàn)豐加霉素的生物合成。
[0027] 實施例2 :淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌重組菌的構(gòu)建 以接合轉(zhuǎn)移法將重組質(zhì)粒pSET152-toy AM整合在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 1628的染色體上，在阿泊拉霉素抗性平板上隨機挑取若干單菌落 于CP培養(yǎng)基中培養(yǎng)多次后，提取染色體。PCR實驗均能擴增出阿泊拉霉素抗性基因 a/ττ(圖 5)，證明重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-T0YAM構(gòu)建成功，且遺傳穩(wěn)定。
[0028] 實施例3 :淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌原始菌及重組菌的發(fā)酵性能驗證 與原始菌株S 1628相比，重組菌1628-T0YAM生物合成豐加霉 素基因簇中的結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄活性均明顯高于原始菌株1628。 對重組菌1628-T0Y以及原始菌51 1628進(jìn)行250 mL搖瓶發(fā)酵實 驗，從發(fā)酵角度對淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中生物合成豐加霉素基因簇拷貝數(shù)以及轉(zhuǎn)錄活性的增 加對豐加霉素產(chǎn)量的提高作用進(jìn)行驗證。往復(fù)式搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，28°C，發(fā)酵96h，對 照組為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌出發(fā)株。如表1所示，重組菌豐加霉素的產(chǎn)量高于原始菌，重組菌 豐加霉素最終產(chǎn)量達(dá)到mg/L，較原始菌提高了 4. 5倍，且重復(fù)性良好。說明在豐加霉素生產(chǎn) 菌株5： 1628中增加生物合成豐加霉素基因簇拷貝數(shù)有利于豐加霉 素的產(chǎn)量的提高。
[0029] 表1重組菌與原始菌最終豐加霉素產(chǎn)量的比較

【權(quán)利要求】
1. 一種加強了基因簇toy AM表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌，其特征在于：它重組 表達(dá)了生物合成豐加霉素的基因簇toy AM，具有比保藏編號為CGMCC NO. 2060的淀 粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628更高的豐加霉素表達(dá) 能力；所述的基因簇toy AM來自于待重組的原始菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 1628 ;所述的基因簇toy AM整合入原始菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色 體。
2. -種如權(quán)利要求1所述的加強了基因簇toy AM表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的構(gòu) 建方法，其特征在于，過程如下： 1) 構(gòu)建表達(dá)載體pSET152-toy AM ; 2) 利用接合轉(zhuǎn)移法將所述的表達(dá)載體整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體，獲得所述的重 組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，利用載體pSET152實現(xiàn)基因簇toy AM的 過量表達(dá)，利用接合轉(zhuǎn)移法將載體pSET152-toy AM特異性的整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 1628的染色體，獲得了遺傳穩(wěn)定的的重組淀粉酶 產(chǎn)色鏈霉菌；所述的加強了基因簇toy AM表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的用途，將重組淀 粉酶產(chǎn)色鏈霉菌進(jìn)行發(fā)酵，與原始菌株相比，豐加霉素產(chǎn)量提高了 4. 5倍。
【文檔編號】C12P19/40GK104312967SQ201410506760
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】馬正, 俞曉平, 徐顯皓, 陶立彬, 申屠旭萍, 邊亞琳, 郝培應(yīng), 許益鵬 申請人:中國計量學(xué)院