一種生物轉(zhuǎn)化丙烯醛合成丙烯酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及應(yīng)用一株醋酸桿菌菌株靜息細(xì)胞及其固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化丙烯醛為丙烯酸的方法，屬于生物工程和酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]丙烯酸(Acrylic acid)，是工業(yè)生產(chǎn)中重要的不飽和有機(jī)酸，也是重要的有機(jī)原料，其分子中有特殊的雙鍵結(jié)構(gòu)和酸性官能團(tuán)。丙烯酸及其衍生物具有無色透明，有粘性、彈性，不易風(fēng)化等優(yōu)點(diǎn)，用于生產(chǎn)粘合劑、涂料、化纖、光敏樹脂板等化工產(chǎn)品。我國在生產(chǎn)高吸水樹脂、丙烯酸酯等領(lǐng)域?qū)Ρ┧岬男枨笾鹉暝黾?，丙烯酸的生產(chǎn)越來越受到重視。
[0003]目前丙烯酸的生產(chǎn)主要有化學(xué)法、微生物發(fā)酵法和生物轉(zhuǎn)化法。丙烯酸主要通過化學(xué)法從石油中獲得。工業(yè)化生產(chǎn)中大多采用丙烯氧化法，分為兩個(gè)階段:首先將丙烯氧化成丙烯醛，再進(jìn)一步氧化為丙烯酸。丙烯氧化法具有原料價(jià)格低廉、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，在丙烯酸的生產(chǎn)中占有主導(dǎo)地位。
[0004]微生物發(fā)酵法主要是通過基因工程的方法構(gòu)建工程菌，其主要的策略為在丙酸梭菌厭氧發(fā)酵過程中，乳酸可以轉(zhuǎn)化為丙烯酸。但是發(fā)酵法具有產(chǎn)量低、菌種不穩(wěn)定、生產(chǎn)周期長、產(chǎn)物提純過程繁瑣、轉(zhuǎn)化率低、產(chǎn)品純度低、含等不足。
[0005]有研宄發(fā)現(xiàn)含有腈水合酶的紅球菌能夠利用全細(xì)胞將丙烯腈氧化催化為丙烯酸，但轉(zhuǎn)化率僅為63%。John等進(jìn)行了 Rhodococcus AJ270的固定化和利用包埋生物催化劑來生產(chǎn)丙烯酸的研宄，成功地將丙烯酰胺催化成丙烯酸，得到了較高的轉(zhuǎn)化率，但由于丙烯酰胺的成本較高，很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006]本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于利用一株醋酸桿菌(Acetobacter sp.)靜息細(xì)胞高效轉(zhuǎn)化丙烯醛為丙烯酸的方法，具有微生物培養(yǎng)工藝簡單、轉(zhuǎn)化效率高、產(chǎn)物產(chǎn)量大、轉(zhuǎn)化液成分簡單利于產(chǎn)品分離純化、轉(zhuǎn)化過程可以人為地調(diào)節(jié)菌體濃度以縮短生產(chǎn)時(shí)間，節(jié)約大量的能源和生產(chǎn)成本，利于推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的問題是提供一種利用醋桿菌生物轉(zhuǎn)化丙烯醛為丙烯酸的方法，利用所述醋桿菌靜息細(xì)胞及其固定化細(xì)胞，以丙烯醛為底物進(jìn)行生物催化反應(yīng)生產(chǎn)丙烯酸，具體步驟如下:
[0008](I)菌株的培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基:甘油20，甘露醇5，酵母膏5，蛋白胨1，硫酸銨2，硫酸鎂10，磷酸二氫鉀1，pH 6.0 ;培養(yǎng)溫度30°C ;搖床轉(zhuǎn)速200RPM ;培養(yǎng)時(shí)間32h，將發(fā)酵液離心獲得菌體。
[0009](2)催化反應(yīng)體系的建立:菌體用適當(dāng)?shù)木彌_液配制成一定pH(6_8)的懸浮液，菌體濃度5-20g/L，加入終濃度為5-20g/L的丙烯酸，進(jìn)行催化反應(yīng)，催化溫度20_40°C，搖床轉(zhuǎn)速220RPM，催化時(shí)間15-120min。所述緩沖液可以為磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液；所用緩沖液體系濃度為0.lmol/L ；pH 6-8。
[0010](3)醋桿菌細(xì)胞的固定化:菌體經(jīng)過32h培養(yǎng)后離心洗滌3次，傾去上清，與4%海藻酸鈉溶液以1:1?4的比例混合，注入0.05mol/L的CaCl2溶液中，固定化12h。
[0011]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明利用醋酸桿菌(Acetobacter sp.CGMCC N0.8142)及其固定化細(xì)胞在水相體系中高效的轉(zhuǎn)化丙烯醛為丙烯酸，在5-10g底物濃度范圍內(nèi)，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率高達(dá)91 %，該方法培養(yǎng)工藝簡單、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化液成分簡單利于產(chǎn)品分離純化、產(chǎn)物產(chǎn)量大、轉(zhuǎn)化過程可以人為地調(diào)節(jié)菌體濃度以縮短生產(chǎn)時(shí)間，節(jié)約大量的能源和生產(chǎn)成本。
【附圖說明】
[0012]圖1:丙烯酸標(biāo)樣液相色譜圖
[0013]圖2:靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)物液相色譜圖
[0014]圖3:丙烯酸標(biāo)樣質(zhì)譜圖
[0015]圖4:靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)物質(zhì)譜圖
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1 Acetobacter sp.轉(zhuǎn)化丙稀醛為丙稀酸能力的鑒定
[0017]將篩選得到的單菌落接入種子培養(yǎng)基(50mL/250mL)中，30°C，220RPM培養(yǎng)16h后，以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，220RPM培養(yǎng)36h后，離心獲得菌體，將菌體用pH6.0的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，用pH6.0的磷酸鹽緩沖液將菌體懸浮，制成菌體濃度1g/L的菌懸液，加入一定量的底物丙烯醛，使其終濃度為15g/L，在30°C，220RPM下催化60min內(nèi)取樣，轉(zhuǎn)化液經(jīng)離心去除菌體，0.22um的水相濾膜過濾后進(jìn)行HPLC和質(zhì)譜檢測。
[0018]經(jīng)過HPLC檢測得到丙烯酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間在9.764min左右(附圖1)，轉(zhuǎn)化液經(jīng)HPLC在相同條件下檢測發(fā)現(xiàn)中存在很明顯的峰，出峰時(shí)間在9.756min左右(附圖2)，與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間很吻合。將3-羥基丙酸的標(biāo)準(zhǔn)品與轉(zhuǎn)化液進(jìn)行ES1-MS檢測，比較質(zhì)樸圖發(fā)現(xiàn)兩者存在相同的m/z = 71特征峰(附圖3、4)由此可以判斷篩選得到的菌株具有轉(zhuǎn)化丙烯醛為丙烯酸的能力。
[0019]實(shí)施例2 Acetobacter sp.靜息細(xì)胞催化丙稀醛產(chǎn)丙稀酸
[0020]將培養(yǎng)32h的菌體離心洗滌后，分別用pH 6.0，6.4，6.8，7.2，7.6，8.0的0.1mmol/L的磷酸鹽緩沖液將菌體制成5g/L，10g/L，15g/L，20g/L的菌懸液，加入丙烯醛至終濃度分別為 5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，在 30°C，220RPM 下催化 90min，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng) HPLC 檢測，在 pH6.8，菌體濃度為10g/L時(shí)其產(chǎn)量達(dá)到10.32g/L、轉(zhuǎn)化率為80%。
[0021]實(shí)施例3 Acetobacter sp.固定化細(xì)胞催化丙稀醛產(chǎn)丙稀酸
[0022]將Acetobacter sp.細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)32h后經(jīng)離心洗滌，與0.05mol/L的海藻酸鈉溶液以1:1?4的比例混合，分別加入pH 4.8,5.2,5.6,6.0的0.2mmol/L的醋酸鈉-醋酸緩沖液，使菌體濃度為10g/L，在30 °C，220RPM搖床轉(zhuǎn)速下反應(yīng)90min。經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)離心后的菌體與海藻酸鈉溶液比例為1:1，PH 6.0時(shí)丙烯酸產(chǎn)量最高，為11.51g/L，轉(zhuǎn)化率為90%。
[0023]實(shí)施例4 Acetobacter sp.固定化細(xì)胞的重復(fù)利用
[0024]在30°C條件下，將10g/L固定化細(xì)胞在pH 6.0的0.2mmol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液體系中與10g/L丙稀醛反應(yīng)，每90min收集固定化顆粒，在相同條件下重新與10g/L丙稀醛反應(yīng)，經(jīng)HPLC檢測，4次重復(fù)利用后，丙烯酸的產(chǎn)量為8.49g/L，轉(zhuǎn)化率高達(dá)75%。
[0025]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用醋桿菌(Acetobacter sp.)高效生物轉(zhuǎn)化丙稀醛生產(chǎn)丙稀酸的方法，其特征在于，收集培養(yǎng)后的微生物菌體，以其靜息細(xì)胞或固定化細(xì)胞為生物催化劑，以丙烯醛為底物進(jìn)行催化反應(yīng)生產(chǎn)丙烯酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)醋桿菌的培養(yǎng):在30°C條件下，將醋酸菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)32h; (2)靜息細(xì)胞催化反應(yīng):將發(fā)酵培養(yǎng)32h的菌體離心洗滌后制成一定濃度的菌懸液，加入丙烯醛，在20-40 °C和220RPM搖床轉(zhuǎn)速下催化15_120min，反應(yīng)完成后進(jìn)行HPLC檢測。 (3)固定化細(xì)胞反應(yīng):將離心后的菌體用海藻酸鈉溶液包埋，制成固定化醋桿菌顆粒，在緩沖體系中進(jìn)行催化反應(yīng)并用HPLC檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為甘油20g/L，甘露醇 5g/L，酵母膏 5g/L，蛋白胨 lg/L，(NH4) 2S042g/L, KH2PO41g/L,MgSO4.7Η20 lg/L，pH 6.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的靜息細(xì)胞催化體系為檸檬酸-檸檬酸鉀緩沖液、磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液；所用緩沖液體系濃度為0.lmol/L ;pH范圍在6-8 ;固定化催化時(shí)所用的緩沖液為乙酸鈉-乙酸緩沖液，緩沖液體系濃度為0.2mol/L，pH 6.00
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述菌懸液濃度為5-20g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述底物丙烯醛終濃度為5-20g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述海藻酸鈉溶液濃度為4%。
【專利摘要】本方法公開了一種利用醋酸桿菌(Acetobacter sp.CGMCC NO.8142)靜息細(xì)胞及其固定化細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化丙烯醛為丙烯酸的方法，屬于生物工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于微生物培養(yǎng)方法簡單，轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化液成分簡單，利于產(chǎn)品分離純化，反應(yīng)條件溫和，節(jié)約大量的能源和生產(chǎn)成本。
【IPC分類】C12R1-02, C12P7-40
【公開號(hào)】CN104745645
【申請?zhí)枴緾N201510073804
【發(fā)明人】諸葛斌, 王旭昌, 宗紅, 陸信曜, 宋健, 方慧英, 諸葛健, 黨藝文
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年2月11日