一種在大腸桿菌中一步法合成dna片段并組裝合成基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段并組裝合成基因的方法，主要步驟包括：構(gòu)建LIC載體質(zhì)粒LIC-A；制備LIC-A線性載體；構(gòu)建組裝DNA片段的受體載體puc-Kana；選擇目標(biāo)基因，劃分300bp左右的小片段進(jìn)行合成；多個小片段DNA利用金門克隆反應(yīng)組裝成大片段基因。本發(fā)明操作簡單，無需再重復(fù)做克隆和測序的操作，直接退火，克隆效率高，使用了發(fā)光報告基因sfgfp、gfp，篩選方法直觀，合成方法的錯誤率很低，合成基因的周期短，大大節(jié)約了成本，節(jié)約了時間。本發(fā)明適用于各種基因的合成，對于大基因的合成特別有效。
【專利說明】一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段并組裝合成基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基因合成方法的研究，是一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段并組裝合成基因的方法，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]合成生物學(xué)是生命科學(xué)在二十一世紀(jì)剛剛出現(xiàn)的一個分支學(xué)科，近年來合成生物學(xué)的研究進(jìn)展很快，特別是基因合成技術(shù)。全基因合成是依照某一蛋白質(zhì)的基因序列，設(shè)計合成相互重疊的單鏈寡核苷酸，再通過重疊延伸PCR法拼接出全長，基因合成無需模板，是獲取基因的手段之一。通過全基因合成實現(xiàn)基因的分子改造和人工組建正成為一種實驗室常規(guī)手段。因此，建立一種能夠在相對低廉和短時間內(nèi)準(zhǔn)確和高效地設(shè)計和合成長片段基因的方法十分重要。
[0003]隨著合成生物學(xué)的研究越來越流行，人們對生命的探究不再僅僅局限在宏觀生物上，而是從更簡單的基本單元基因著手，至從上個世紀(jì)70年代以來分子生物學(xué)基因工程迅猛發(fā)展，到目前為止DNA合成的方法主要集中3種方法:(I)化學(xué)合成方法，由于化學(xué)合成的原理決定了化學(xué)法合成的DNA片段不可能太長，所以主要用于寡核苷酸的合成；(2) PCR介導(dǎo)的合成方法，這種方法是可以合成大的DNA片段，而且周期也比較短，但是到目前為止，PCR介導(dǎo)的合成方法錯誤率比較高，尤其對于合成大于2kb以上的DNA由于錯誤率高，所以為了得到正確的克隆，需要做多次克隆和測序的重復(fù)工作，這樣成本會很高；而且由于是PCR介導(dǎo)的方法，需要DNA高溫聚合酶和DNTP等試劑，這樣成本會比較高；(3)非PCR介導(dǎo)的方法，到目前為止報道的基于非PCR的DNA合成方法主要是DNA的固相合成技術(shù)。這種固相合成技術(shù)，在合成中的`錯誤率確實大大降低了很多，但是由于在合成的時候引物需要經(jīng)過特殊的修飾，再加上該方法需要建庫，引物成本會比較高；其次是由于該方法每次只能增加3個堿基，這樣合成的速度會比較慢，特別對于大的DNA片段的合成，周期尤為長，雖然可以實現(xiàn)自動化操作，但是對于一般的實驗室研究不是很實用。
[0004]鑒于目前的基因合成的方法中錯誤率高，合成成本高等問題，有必要尋找新的基因合成方法來解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提出一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段并組裝合成基因的一種新的基因合成方法。該方法利用大腸桿菌自身的修復(fù)機(jī)制，在大腸桿菌中一步法合成DNA片段，并把DNA小片段組裝合成基因。主要步驟包括:載體的改造，線性載體的制備，小DNA片段的合成，組裝DNA片段的載體的構(gòu)建，多個300bp左右的DNA片段的組裝合成基因。
[0006]具體做法如下:
[0007]I)、構(gòu)建 LIC 載體 LIC-A。
[0008]以商品化的pet23a和pLP_VSVG載體用常規(guī)方法構(gòu)建T7_sfgfp質(zhì)粒，以sfgfp-PF/PBR - PR、T7-sfgfp質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增得到線性載體骨架LIC (3.5kb)(序列列表對應(yīng)為NOl);設(shè)計SPC-PF/SPC-PR(序列見表1)為兩對引物，以T7_sfgfp為模板，通過PCR擴(kuò)增得到SPC盒式結(jié)構(gòu)(Ikb)(序列列表對應(yīng)為N02)，擴(kuò)增好的SPC盒式結(jié)構(gòu)的兩端都帶上了一個限制性酶切位點(BciVI)和13bp的片段填充序列和T7啟動子下游的10個堿基的序列；其次，在載體骨架LIC-A和SPC盒式結(jié)構(gòu)兩端引入了 20bp的同源序列，擴(kuò)增獲得的SPC盒式結(jié)構(gòu)，通過無酶克隆的方式(Zhu D, Zhong X，Tan R, ChenL,Huang G, Li J, et al.High-throughput cloning of human liver complete openreading frames using homologous recombination in Escherichia col1.[J]AnalBiochem.2010; 397 (2): 162-7)克隆到載體骨架LIC-A上。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定得到正確的LIC-A載體質(zhì)粒(序列列表對應(yīng)為N03)，命名為LIC-A載體質(zhì)粒(構(gòu)建過程見圖1)。
[0009]表1骨架載體LIC-A構(gòu)建中使用的引物
[0010]
【權(quán)利要求】
1.一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段并組裝合成基因的方法，其特征在于主要步驟包括:構(gòu)建LIC載體質(zhì)粒LIC-A ；LIC-A線性載體的制備；構(gòu)建組裝DNA片段的受體載體puc-Kana;選擇目標(biāo)基因，劃分300bp左右的小片段進(jìn)行合成；多個小片段DNA用金門克隆反應(yīng)組裝成大片段基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段并組裝合成基因的方法，其特征在于具體步驟為: 1)、構(gòu)建LIC載體LIC-A 以商品化的pet23a和pLP_VSVG載體用常規(guī)方法構(gòu)建T7_sfgfp質(zhì)粒，以sfgfp-PF/PBR - PR、T7-sfgfp質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增得到線性載體骨架LIC ;設(shè)計SPC-PF/SPC-PR為兩對引物，以T7-sfgfp為模板，通過PCR擴(kuò)增得到SPC盒式結(jié)構(gòu)；擴(kuò)增好的SPC盒式結(jié)構(gòu)的兩端都帶上了一個限制性酶切位點BciVI和13bp的片段填充序列和T7啟動子下游的10個堿基的序列；其次，在載體骨架LIC和SPC盒式結(jié)構(gòu)兩端引入20bp的同源序列，擴(kuò)增獲得的SPC盒式結(jié)構(gòu)，通過無酶克隆的方式克隆到載體骨架LIC上；經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定得到正確的LIC-A載體質(zhì)粒； 2)、LIC-A線性載體的制備(如圖2所示)，把測序正確的LIC-A質(zhì)粒先用限制性內(nèi)切酶BciVI在37°C酶切，并凝膠回收后的產(chǎn)物，然后再用T4DNA聚合酶3次分別在加dGTP、dCTP、dTTP的保護(hù)下12°C利用T4DNA聚合酶消化30min，溶液回收后備用，這樣處理的載體在其3’端各突出13nt ； 3)、構(gòu)建組裝DNA片段的受體載體puc-Kana 首先，以PBR322-PF/PBR322-PR為引物，以商品化的puc_19質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得線性骨架載體片段PBR322 ;以gfp-PF/gfp-PR為引物，以pGSilG-Lic為模板，通過PCR獲得兩端帶有BspQI酶切位點和EarI酶切位點的gfp盒式結(jié)構(gòu)；以Kana-PF/Kana-PR為引物，以pGSilG-Lic為模板通過PCR擴(kuò)增，獲得Kana盒式結(jié)構(gòu)；其次，通過重疊延伸PCR(Overlap Extension PCR)將gfp盒式結(jié)構(gòu)和Kana盒式結(jié)構(gòu)拼接成gfp-Kana單元； 最后，將gfp-Kana單元和線性骨架載體片段PBR322進(jìn)行1:3混合通過無酶克隆方式轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-Gold進(jìn)行克??；挑取在藍(lán)光儀下發(fā)綠光的菌落，通過質(zhì)粒電泳、質(zhì)粒酶切鑒定和質(zhì)粒測序等方式得到了正確的大小為3686bp的puc-Kana質(zhì)粒； 4)、選擇目標(biāo)基因，劃分300bp左右的小片段進(jìn)行合成 先選擇確定目標(biāo)基因XY，將需要合成的目標(biāo)基因的DNA序列按照每300bp左右進(jìn)行劃分為G1、G2、G3、G4、G5……多個小片段，分別設(shè)計彼此重疊(over lapping) 17bp左右且無縫的引物序列對，每個300bp左右的片段需要合成12條長度為40-45nt左右的寡核苷酸引物；再分別將合成好的12條寡核苷酸序列稀釋成終濃度10 μ Μ，然后分別取0.5 μ L至一 PCR管內(nèi)， 加2ul的LA Taq Buffer最后加雙蒸水至終體積20 μ L混合；分別讓其按照94°C 5min, 94°C a37°C slope20min, 37°C 7min的逐步降溫的程序退火,且首尾兩條引物的5’端分別引入13nt與線性載體同源互補的序列； 將步驟2)準(zhǔn)備好的線性載體與退火形成的小DNA片段混合，37°C放置30min后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過重構(gòu)T7啟動子啟動下游報告基因sfgfp的表達(dá)，將篩選后測序正確重組子分別命名為XYG1、XYG2、XYG3、XYG4、XYG5......; 5)、多個小片段DNA組裝成大片段基因要合成大于300bp以上的DNA片段，需要用步驟4的XYG1、XYG2、XYG3、XYG4、XYG5......質(zhì)粒作為供體質(zhì)粒，再另加切好的受體載體質(zhì)粒puc-Kana做金門克隆反應(yīng)，這樣就合成了與目標(biāo)基因相同的合成基因 。
【文檔編號】C12N15/70GK103725674SQ201310753413
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】馬立新, 陳晚蘋, 陳羽西, 汪曉娟, 楊琥, 余先紅 申請人:湖北大學(xué)