斜帶石斑魚性別調(diào)控基因Rspo1及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了斜帶石斑魚性別調(diào)控基因Rspo1及其應(yīng)用?；騌spo1的cDNA序列如SEQIDNO:1所示，全長(zhǎng)756bp，其編碼蛋白共251個(gè)氨基酸，序列如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明方法利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)從斜帶石斑魚中克隆到了一個(gè)斜帶石斑魚性別調(diào)控基因Rspo1，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了Rspo1可能參與調(diào)控斜帶石斑魚其他性別調(diào)控基因的表達(dá)，為相關(guān)魚類性別調(diào)控的研究提供一定的理論依據(jù)和重要線索?；騌spo1編碼的蛋白有望應(yīng)用于魚類催產(chǎn)、催熟、人工調(diào)控雌雄轉(zhuǎn)換、大規(guī)模工業(yè)化養(yǎng)殖等方面。
【專利說(shuō)明】斜帶石斑魚性別調(diào)控基因Rspol及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水生動(dòng)物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種斜帶石斑魚性別調(diào)控基因及其應(yīng)用，特別涉及斜帶石斑魚性別調(diào)控基因Rspol及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]Rspol~4超家族，作為經(jīng)典Wnt信號(hào)的配體，它們之間有著40%~60%的蛋白一致性和結(jié)構(gòu)同源性。Rspo蛋白包含一個(gè)N端信號(hào)肽，兩段臨近的富含半胱氨酸的區(qū)域，一段高同源的TSP-1模塊，以及一段包含雙向核定位信號(hào)的碳端尾巴。他們?cè)诟鞣N發(fā)育和癌癥發(fā)生通路中其重要作用。Rspol的結(jié)構(gòu)具有5'端信號(hào)肽，具有轉(zhuǎn)移分泌蛋白的作用；兩段含有半胱氨酸的弗林樣片段，這是它與其受體結(jié)合的重要部位；還有一段TSP-1 (凝血酶敏感蛋白-1 )。在斜帶石斑魚的Rspol中，未發(fā)現(xiàn)C端核定位信號(hào)。Rspol是該超家族中的一種，它的最初發(fā)現(xiàn)是在人類性別調(diào)控方面發(fā)揮的重要作用。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為雌性性別決定和分化是被動(dòng)的，但目前對(duì)RSP01的研究卻對(duì)上述提出了質(zhì)疑。
[0003]RSP01是一種小分泌因子，能夠刺激經(jīng)典的Wnt/b-連環(huán)素信號(hào)通路，提高細(xì)胞膜上的Wnt與Rspol共受體LRP6的水平。重要的是，Wnt/b-連環(huán)素通路在卵巢和睪丸早期發(fā)育中起到重要作用。雌性小鼠敲除Rspol很明顯發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，有些生育能力降低。與fct4敲除不同，Rspol敲除的小鼠部分是可育的，卵泡在一定程度上發(fā)育，但是大多數(shù)的雌性是不育的。敲除XX中RPS01的小鼠發(fā)生明顯的性別轉(zhuǎn)化，局部上皮的Rspol信號(hào)對(duì)于乳腺的發(fā)育是必須的。RSP01是卵巢性別調(diào)控基因，它積極地掌管卵巢的分化，而WNT4是RSP01的即時(shí)的或者是協(xié)同的下游基因，它和RSP01重疊表達(dá)，直接或者間接地受RSP01調(diào)節(jié)。我們推測(cè)，Rspol在魚類中也可能存在相同性別調(diào)控的功能。
[0004]與高等的脊椎動(dòng)物相比，大多數(shù)低等魚類沒(méi)有性染色體，其性別決定主要由多種性別調(diào)控基因所控制，至今依然沒(méi)有找到魚類的性別決定基因。魚類性別調(diào)控的研究，能夠使得人為控制魚類性別的分化和成熟，提早或者延遲魚類的性成熟，甚至可以人為調(diào)控魚類的性別轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化后的、具有功能性的雌魚或雄魚。此類研究的成果，將對(duì)人工養(yǎng)殖的工業(yè)化、現(xiàn)代化產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。
[0005]石斑魚是一種深海性的名貴經(jīng)濟(jì)魚種，營(yíng)養(yǎng)豐富，肉質(zhì)細(xì)嫩潔白，類似雞肉，素有“海雞肉”之稱，成為港澳臺(tái)等地區(qū)的美味佳肴。在國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟的“瀕危物種紅色名錄”上，163種石斑魚類，有20種面臨滅絕，另有5種屬瀕危水平。斜帶石斑魚屬鱸形目，屬于雌雄同體、雌性先熟的物種，群體生活，出生的時(shí)候都是雌性，成年后才會(huì)轉(zhuǎn)為雄性。斜帶石斑魚的這些特征使其成為研究性別調(diào)控的重要材料。因此，研究斜帶石斑魚及其性別調(diào)控機(jī)制，對(duì)于斜帶石斑魚功能基因組學(xué)及斜帶石斑魚育種、人工調(diào)控雌雄轉(zhuǎn)換、大規(guī)模工業(yè)化養(yǎng)殖的實(shí)現(xiàn)等等都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種斜帶石斑魚性別調(diào)控基因Rspol及其應(yīng)用。[0007]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
斜帶石斑魚性別調(diào)控基因Rspol的編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0008]編碼斜帶石斑魚性別調(diào)控基因Rspol蛋白的核酸序列。
[0009]進(jìn)一步的，上述核酸序列為基因Rspol的cDNA，全長(zhǎng)756bp，其序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0010]斜帶石斑魚性別調(diào)控基因Rspol的重組蛋白含有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。
[0011]編碼斜帶石斑魚性別調(diào)控基因Rspol的重組蛋白的核酸序列。
[0012]進(jìn)一步的，上述核酸序列含有如SEQ ID N0:4所示的核酸序列。
[0013]Rspol的編 碼蛋白或重組蛋白在制備魚類性別催熟劑中的應(yīng)用。
[0014]Rspol的編碼蛋白或重組蛋白在制備魚類性別轉(zhuǎn)換劑中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明方法利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)從斜帶石斑魚中克隆到了性別調(diào)控基因Rspol，并構(gòu)建了 Rspol的原核表達(dá)載體，可大量表達(dá)獲得斜帶石斑魚性別調(diào)控基因Rspol所編碼的蛋白。
[0016]在本發(fā)明中，斜帶石斑魚Rspol蛋白能夠在卵巢組織的大量表達(dá)，并說(shuō)明了 Rspol參與調(diào)控斜帶石斑魚中其他性別調(diào)控基因的表達(dá)，豐富了魚類性別調(diào)控的系統(tǒng)信號(hào)通路理論，能為相關(guān)魚類性別調(diào)控的研究提供一定的理論依據(jù)。
[0017]在本發(fā)明中，斜帶石斑魚Rspol蛋白在魚類催產(chǎn)、催熟、人工調(diào)控雌雄轉(zhuǎn)換、大規(guī)模工業(yè)化養(yǎng)殖等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為基因Rspol的PCR擴(kuò)增圖；
圖2為重組質(zhì)粒pQE30-Rspol轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15的菌液PCR驗(yàn)證圖；
圖3為Rspol重組蛋白的Western檢測(cè)圖，其中1表示誘導(dǎo)后總菌體,2表示誘導(dǎo)前總菌體,3表示誘導(dǎo)后上清,4表示誘導(dǎo)前上清,5表示誘導(dǎo)后沉淀,6表示誘導(dǎo)前沉淀；
圖4為Rspol重組蛋白純化后的SDS-PAGE檢測(cè)圖，從左到右箭頭所示的泳道分別為50mM、100mM 150mM、200mM、250mM、300mM咪唑洗脫液的洗脫情況。黑色框內(nèi)的條帶為目的重組蛋白，分子量約27kDa;
圖5為Rspol重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)，箭頭所示為目的重組蛋白條帶；
圖6為Rspol重組蛋白對(duì)相關(guān)性別調(diào)控基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)調(diào)節(jié)；A表示Rspol重組蛋白對(duì)Cypl9a表達(dá)的影響；B表示Rspol重組蛋白對(duì)Sox9表達(dá)的影響；圖中T表示用Rspol重組蛋白處理的實(shí)驗(yàn)組,Treat的縮寫；(3表示不加Rspol重組蛋白的對(duì)照組，Control的縮寫。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備和方法為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)市購(gòu)的試劑、設(shè)備和常規(guī)使用的方法。
[0020]實(shí)施例1一、Rspol重組蛋白的制備
1、斜帶石斑魚RNA的提取
取健康斜帶石斑魚全魚，以冰浴麻醉約2 min后，殺魚取樣，分離卵巢組織，采用Trizol試劑法抽提獲得斜帶石斑魚卵巢組織總RNA。
[0021]2、/&/7o7基因的克隆第一鏈cDNA的合成:
1)取出保存的斜帶石斑魚RNAWL，加入1PL的Oligo (dT) 16 (10禮)，混勻后置于70 °C中水浴5 min ；
2)冰上放置5min后，于冰上向EP管中先后加入dNTP Mixture (10 mM) 2yL、5XRT Buffer 4 μ L、Rnase 抑制劑 1 μ L (10 U/ μ L)、Rnase-free ddH20 8 μ L、ReverTraAce 1 μ L ；
3)將EP 管置于 PCR 儀中，按 30DC 10 min，42°C 60 min，99°C 5 min，4°C 5 min 程序后瞬時(shí)離心，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈的單鏈cDNA，于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0022]以cDNA為模板的Rspol基因克隆:
根據(jù)生物信息學(xué)中相關(guān) 的序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，在基因Rspol的cDNA序列(如SEQID N0:2所示，其編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO: 1所示)中去除編碼19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽的序列，以剩下的序列在兩端設(shè)計(jì)特異性引物，如下:
Rspol-RT-F:5’ - CGCGGATCCGATGTTCTCAAGCTCTC -3’ (SEQ ID NO:5)(下劃線標(biāo)記部分為內(nèi)切酶Bam HI的識(shí)別序列)；
Rspol-RT-R:5’ - CGGGGTACCTTAGCTGACAGAGCTGG -3’ (SEQ ID NO:6)(下劃線標(biāo)記部分為內(nèi)切酶Κρη 1的識(shí)別序列)。
[0023]以第一鏈cDNA為模板，采用上游引物Rspol-RT-F和Rspol-RT-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得不含信息肽的Rspol基因，擴(kuò)增片段大小為699bp，如圖1所示，擴(kuò)增序列為如SEQ IDN0:4所示，其編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID N0:3所示。電泳分離DNA片段，切膠回收目的產(chǎn)物。將純化后的目的產(chǎn)物連接至PTZ57R/T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)分析，比對(duì)結(jié)果表明目的產(chǎn)物確為基因Rspol。
[0024]3、基因T&/707原核表達(dá)載體的構(gòu)建
提取含有基因/&/707的PTZ57R/T質(zhì)粒，分別經(jīng)過(guò)內(nèi)切酶BamHl和Kpnl的酶切，獲得目的片段，將目的片段連接到經(jīng)BamHl和Kpnl雙酶切過(guò)的pQE30質(zhì)粒載體，pQE30為帶有His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體。連接過(guò)程中采有連接酶T4 DNA Ligase，溫度37°C，連接反應(yīng)12~16h0
[0025]將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入擴(kuò)增宿主-大腸桿菌DH5a的感受態(tài)細(xì)胞，篩選培養(yǎng)，將獲得的陽(yáng)性單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，PCR擴(kuò)增的片段大小與目的片段大小相似，約699bp，并將該陽(yáng)性單菌落進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與目片段的序列一致，說(shuō)明成功構(gòu)建了Rspol的原核重組表達(dá)載體:pQE30-Rspol。
[0026]4、基因T&/707的原核表達(dá)及純化轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主:
提取3中構(gòu)建好的重組表達(dá)載體質(zhì)粒(pQE30-Rspol )，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)宿主-大腸桿菌M15的感受態(tài)細(xì)胞,用含氨節(jié)霉素(Amp)和卡那霉素(Kana)的培養(yǎng)基,進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單克隆菌落，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證(如圖2所示)，PCR擴(kuò)增的片段大小與目的片段大小相似，約699bp。驗(yàn)證正確后，以含Amp的培養(yǎng)基過(guò)夜擴(kuò)大培養(yǎng)該陽(yáng)性菌落，取菌液加入甘油，按8%甘油終濃度保存在-80度冰箱中，進(jìn)行菌種保存。
[0027]重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá):
將含有重組表達(dá)載體(pQE30-Rspol)的大腸桿菌M15先經(jīng)過(guò)LB培養(yǎng)基的擴(kuò)大培養(yǎng)，再經(jīng)過(guò)2xYT培養(yǎng)基的二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液0D_值介于0.4~0.6之間時(shí)，取少量誘導(dǎo)前的菌液，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。剩下的菌液加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集菌液，離心獲得菌體，加入lxN1-NTA結(jié)合緩沖液重懸菌體，此時(shí)取20μ?菌體重懸液，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)照。將剩下的菌體重懸液超聲波破碎，離心，將上清和沉淀分開。 [0028]分別將誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的總菌體、上清和沉淀加入蛋白Loading buffer,混勻，沸水浴中煮5分鐘,分別取ΙΟμ?進(jìn)行Western blotting檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。從圖3的western blotting檢測(cè)結(jié)果中，可看出Rspol重組蛋白在菌體的上清和沉淀中都存在。
[0029]上述2xYT培養(yǎng)基配方為:胰蛋白胨(Tryptone)16g,酵母提取物(Yeast Extract)10g，氯化鈉5g，加水至1L，120°C高壓滅菌20分鐘。
[0030]重組蛋白的純化、脫鹽及凍干:
將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體超聲破碎，離心，棄沉淀，將上清經(jīng)孔徑0.45微米的濾膜過(guò)濾備用。
[0031]鎳柱準(zhǔn)備,往柱子內(nèi)加入2mL的N1-NTA His-Bind (Novagen,貨號(hào):70666),再加10mL水過(guò)柱；再加入10mL的lxN1-NTA結(jié)合緩沖液平衡柱子。
[0032]掛柱，往50mL離心管中加入結(jié)合緩沖液，再加入菌體上清液，蓋上蓋子，封口膜封口，置于冰上，緩慢搖勻、親和吸附1小時(shí)。將搖勻的融合液過(guò)鎳柱，收集穿過(guò)液，再重復(fù)過(guò)鎳柱兩次。
[0033]漂洗和洗脫，重組蛋白掛柱后，先用lxN1-NTA漂洗液漂洗，再分別以50mM、100mM150mM、200mM、250mM濃度的咪唑洗脫液洗脫，對(duì)不同濃度咪唑洗脫液洗脫下來(lái)的物質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示重組蛋白能被濃度為150~200mM的咪唑洗脫下來(lái)，其中咪唑濃度為200mM時(shí)，洗脫的條帶單一(如圖4所示)，故選用200mM的咪唑洗脫液用于洗脫獲得
純化重組蛋白。
[0034]基于上述探索出的最優(yōu)的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件、最適濃度的咪唑洗脫液等，再進(jìn)行大量表達(dá)、純后獲得大量重組蛋白，并結(jié)合SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。Rspol重組蛋白的分子量約為27kDa,如圖5中的箭頭所示。
[0035]將純化后的重組蛋白進(jìn)行脫鹽，先用0.02M的PB緩沖液進(jìn)行清洗和平衡柱子。加入樣品，收集穿過(guò)液。待樣品完全進(jìn)入下端柱子后，再加入PB緩沖液洗脫，收集洗脫液，即為脫鹽后的重組蛋白。
[0036]將脫鹽的重組蛋白進(jìn)行凍存:將含有目的蛋白的收集液置于合適大小的干凈管子中，用封口膜封好，在膜上扎幾個(gè)針眼，以便凍存時(shí)水分的散失。管子豎直放于-20度冰箱約2小時(shí)以上，待全部?jī)龀杀鶢?，迅速放?80度冰箱。第二天，將-80度保存的管子置于調(diào)試完好的凍存機(jī)掛瓶?jī)?nèi)，開始凍存。凍存時(shí)間視水分散失快慢而定，一般8小時(shí)以上或者過(guò)夜。將凍存完成的、含有目的蛋白的管子取下迅速放于-80度冰箱保存，以便下一步的實(shí)驗(yàn)。[0037]二、Rspol重組蛋白調(diào)節(jié)性別調(diào)控基因的表達(dá)
以斜帶石斑魚為研究對(duì)象，以高表達(dá)基因Rspol的卵巢組織為材料，用Rspol重組蛋白離體孵育卵巢碎片，研究Rspol重組蛋白對(duì)相關(guān)性別調(diào)控基因Cypl9a、FoX12、Sox9、Wnt4a在mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的調(diào)節(jié)情況。
[0038]分別以濃度100、1000、10000 μ g/μ L的Rspol重組蛋白孵育卵巢碎片8h，然后分別檢測(cè)性別調(diào)控基因Cypl9a、Foxl2、Sox9、Wnt4a在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。
[0039]從圖6的檢測(cè)結(jié)果可獲知，Rspol重組蛋白對(duì)其它幾種性別調(diào)控因子起不同作用。其中，三種不同濃度(100、1000、10000ng/ml )Rspol對(duì)Cypl9a都有著上調(diào)作用；對(duì)Foxl2在1000ng/ml濃度時(shí)起著明顯下調(diào)作用；對(duì)Sox9在1000和10000ng/ml時(shí)有著下調(diào)作用，在1000ng/ml時(shí)作用最明顯；而Rspol對(duì)Wnt4a的作用卻不明顯?？梢?，Rspol重組蛋白能夠促進(jìn)雌性調(diào)芐基因(Cypl9a)，而抑制雄性調(diào)芐基因(Sox9)的表達(dá)，從而可能促進(jìn)雌性的發(fā)生、發(fā)育和成熟。說(shuō)明，Rspol蛋白可能具有上調(diào)雌性激素合成的作用，從而引起雌性性別發(fā)生和卵巢發(fā)育，同 時(shí)抑制雄性特征，進(jìn)而可能引發(fā)魚類從雄性到雌性的性逆轉(zhuǎn)。
【權(quán)利要求】
1.斜帶石斑魚性別調(diào)控基因Rspol的編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO: 1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述的斜帶石斑魚性別調(diào)控基因Rspol蛋白的核酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利2所述的核酸序列，其特征在于:該核酸序列為基因Rspol的cDNA，全長(zhǎng)756bp，其序列如SEQ ID N0:2所示。
4.斜帶石斑魚性別調(diào)控基因Rspol的重組蛋白，其特征在于:該重組蛋白含有如SEQID NO:3所示的氨基酸序列。
5.編碼權(quán)利要求4所述的斜帶石斑魚性別調(diào)控基因Rspol的重組蛋白的核酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利5所述的核酸序列，其特征在于:其含有如SEQID N0:4所示的核酸序列。
7.Rspol的編碼蛋白或重組蛋白在制備魚類性別催熟劑中的應(yīng)用。
8.Rspol的編碼蛋白或重組蛋白在制備魚類性別轉(zhuǎn)換劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK103724415SQ201310753282
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】劉曉春, 王升鵬, 林浩然, 張勇 申請(qǐng)人:中山大學(xué)