豬平均日增重相關(guān)基因Resistin的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及豬分子標(biāo)記制備領(lǐng)域，具體地指一種豬平均日增重相關(guān)基因Resistin的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明利用Resistin基因序列中包含一個(gè)SNP位點(diǎn)，位于核苷酸序列SEQ?ID?NO.1的第861bp處，該位點(diǎn)為T/C的堿基突變，導(dǎo)致Alw26I-RFLP多態(tài)性。這個(gè)堿基突變位于Resistin基因第3內(nèi)含子中，不改變其翻譯的氨基酸序列。故在Resistin基因序列的SNP位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)引物，得到分子標(biāo)記序列SEQ?ID?NO.1，從而鑒定豬平均日增重性狀。本發(fā)明利用現(xiàn)有的PCR-RFLP技術(shù)，在Resistin基因第861bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)T-C突變，且發(fā)現(xiàn)此多態(tài)位點(diǎn)與平均日增重性狀顯著相關(guān)，對(duì)豬生長性狀的研究有一定幫助。
【專利說明】豬平均日增重相關(guān)基因Resistin的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及豬分子標(biāo)記制備領(lǐng)域，具體地指一種豬平均日增重相關(guān)基因Resistin的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]畜牧業(yè)在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中占據(jù)著非常重要的地位，其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中所占有的比值通常用來衡量一個(gè)國家和地區(qū)發(fā)展程度的重要指標(biāo)。豬肉作為我國最主要的肉類來源，生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)在我國畜牧業(yè)中占據(jù)著舉足輕重的地位。在20世紀(jì)80年代中期，我國肉類產(chǎn)量約2000萬噸，豬肉約占85%，2012年豬肉產(chǎn)量達(dá)到了 5335萬噸，約占肉類總量63.63%。雖然豬肉所占比重逐漸下降，但其始終占據(jù)主導(dǎo)地位。
[0003]在養(yǎng)豬行業(yè)中，飼料成本占養(yǎng)豬總成本的65-75%。因此，降低生豬養(yǎng)殖中的飼料消耗，提高飼料利用效率，降低飼料成本關(guān)系到養(yǎng)豬企業(yè)發(fā)展乃至生存。研究發(fā)現(xiàn)，豬的飼料轉(zhuǎn)化效率同采食量、平均日增重、肌內(nèi)脂肪等經(jīng)濟(jì)性狀顯著相關(guān)(趙克斌，提高生長育肥豬飼料轉(zhuǎn)化率降低飼料成本的策略.豬業(yè)科學(xué)，2008，60-63)。因此，影響豬采食量、平均日增重、肌內(nèi)脂肪等性狀的基因可作為研究豬飼料轉(zhuǎn)化效率的候選基因。
[0004]抵抗素Resistin被美國賓夕法尼亞大學(xué)Steppan等(SteppanCM,Bailey ST, Bhat S，Brown EJ, Banerjee RR, Wright CM, Patel HR, AhimaRS, Lazar MA." The hormone resistin I inks obesity to diabetes " [J].Nature, 2001, 409 (6818):307 - 312)在成熟的脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。同年，Kim等利用基因芯片分離技術(shù)分離得到鼠的Resistin基因(Sung-Eun Kim, He Huang, MingZhao,Xinjun Zhang, Aili Zhang.Wnt Stabilization of β-Catenin RevealsPrinciples for Morphogen Receptor-Scaffold Assemblies[J].Science, PublishedOnline Aprilll2013)。隨后，Rajala等運(yùn)用差減篩選文庫分離脂肪細(xì)胞在不同分化階段表達(dá)的基因時(shí)，也分離出了 Resistin基因(Rajala MW, Lin Y, Ranalletta M, YanqXM, Qian H, Ginqerich R.Cell type-specific expression and coregulation ofmurine resistin and resistin-like molecule-alpha in adipose tissue[J].MolEndocrinol, 2002，16:1920 - 30)。潘穎斌等采用 PCR-SSCP 方法發(fā)現(xiàn) Resistin 基因的啟動(dòng)子、外顯子、內(nèi)含子中均發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)(潘穎斌，劉艷芬，劉鈾，高志杰，王群，何萬娟，譚敏靜.六個(gè)品種豬胰島素抵抗素基因單核苷酸多態(tài)性分析.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2008，16 (3):402-406)ο
[0005]范紅旗通過對(duì)胰島素敏感靶組織-骨骼肌細(xì)胞糖攝取功能的研究表明Resistin能顯著抑制肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取(范紅旗.Resistin對(duì)骨骼肌細(xì)胞糖攝取功能的影響及其機(jī)制分析.[碩士學(xué)位論文]，南京:南京醫(yī)科大學(xué)，2007年)。Solana等研究表明小鼠Resistin基因能與受體·酪氨酸激酶樣孤兒受體I (R0R1)在RORl細(xì)胞外特定區(qū)域結(jié)合，介導(dǎo)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化和葡萄糖攝取(Beatriz Sanchez-Solana, JorgeLaborda, Victoriano Baladron.Mouse Resistin Modulates Adipogenesis and GlucoseUptake in3T3_LlPreadipocytes Through the RORlReceptor[J].Molecular Endocrinology, 2012，26(1): 110-127)。劉峰等通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Resistin減緩胰島β細(xì)胞RINm5F增殖,表明Resistin能夠?qū)σ葝u素分泌產(chǎn)生抑制作用(劉峰，邱潔，張春梅，季晨博，郭錫熔.Resistin基因?qū)σ葝uβ細(xì)胞RINm5F增殖的影響.中國當(dāng)代兒科雜志，2010，43-46)。[0006]同時(shí)Resistin可作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)脂肪生長發(fā)育與分布沉積。陳小東對(duì)食物限制及飽食的豬脂肪中一些脂肪分解相關(guān)的參數(shù)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)豬的脂肪組織中Resistin顯著表達(dá)，且Resistin表達(dá)水平同脂肪沉積呈正相關(guān)(陳小東.脂肪細(xì)胞因子TNF-α與resistin的表達(dá)及其對(duì)豬脂肪代謝的調(diào)控作用.[博士學(xué)位論文]，武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004年)。Cieslak發(fā)現(xiàn)在波蘭大白豬群體中，Resistin基因同背膘厚顯著相關(guān)(CieslakJ, Nowacka-ffoszuk J,Bartz M, Fijak-Nowak H,Grzes M, Szydlowski M,SwitonskiM.Association studies on the porcine RETN, UCPI, UCP3and ADRB3genes polymorphismwith fatness traits[J].Meat Science,2009，83 (3):551-554)。
[0007]以上研究表明，Resistin能通過對(duì)胰島素作用，調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖含量，同時(shí)與體內(nèi)脂肪細(xì)胞的增殖、分化及同脂肪的沉積水平有密切聯(lián)系，通過調(diào)節(jié)Resistin表達(dá)量，可以控制體內(nèi)能量代謝平衡。
[0008]由于豬的生長性狀與體內(nèi)糖代謝及脂肪沉積有密切關(guān)系，因此可以研究Resistin基因是否對(duì)豬生長性狀產(chǎn)生影響。由于Resistin在調(diào)節(jié)脂類代謝、胰島素抗性、能量平衡、采食量、炎癥等方面起著重要作用(楊在清，周磊，甘莉，雷霆，陳小冬.Resistin基因的表達(dá)及調(diào)控研究.全國動(dòng)物生理生化第十次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編，2008年)，研究Resistin與豬的能量代謝、采食量之間的關(guān)系，對(duì)于改良豬的經(jīng)濟(jì)性狀有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是提供一種豬平均日增重相關(guān)基因Resistin的分子標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]本發(fā)明還提供了一種用于獲得所述分子標(biāo)記的引物對(duì)，所述引物對(duì)為:
[0011]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0012]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'。
[0013]本發(fā)明還提供了一種分子標(biāo)記的獲得方法，以具有Resistin基因的豬基因組DNA為模板，采用以下引物對(duì):
[0014]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0015]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'。
[0016]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其所獲得的分子標(biāo)記為SEQ ID N0.2。
[0017]本發(fā)明還提供了一種分子標(biāo)記鑒定豬高的平均日增重性狀的方法，以待測(cè)豬的基因組DNA為模板，采用以下引物對(duì):
[0018]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0019]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'；
[0020]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，具有349bp條帶的豬，其具有Resistin基因，如SEQ ID N0.1。
[0021]本發(fā)明還提供了一種分子標(biāo)記在豬部分生長性狀及飼料轉(zhuǎn)化效率性狀相關(guān)分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明還提供了一種分子標(biāo)記的引物對(duì)在豬部分生長性狀及飼料轉(zhuǎn)化效率性狀相關(guān)分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0023]一種鑒定含有Resistin基因的豬的方法，包括以下步驟是:
[0024]I)引物對(duì):
[0025]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0026]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'； [0027]2) PCR擴(kuò)增條件
[0028]PCR反應(yīng)總體積10 iil，其中待測(cè)豬基因組DNA模板I iil，正反向引物各0.2nmol/V-1, PCRmix5 V-1,最后加入去離子水至總體積IOy I ;
[0029]3)PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min后，循環(huán)30次95°C變性30s、58°C退火30s、72°C延伸40s ;最后72°C延伸5min ;PCR產(chǎn)物經(jīng)2% W/V瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；
[0030]4) RFLP 檢測(cè)
[0031]PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10 iil，其中PCR產(chǎn)物5 iil，去離子水3.5 iil，IOXbufferl U 1，限制性內(nèi)切酶 Alw26I 為 0.5 y 1(10U/U 1)，
[0032]將樣品混勻后離心，37°C培養(yǎng)箱放置12h，用3.5%ff/V瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照；
[0033]酶切產(chǎn)生三種基因型，TT基因型只有349bp —條帶，CC基因型有183bp和166bp兩條帶，雜合子TC基因型有349bp、183bp和166bp三條帶。
[0034]本發(fā)明原理
[0035]Resistin基因序列中包含一個(gè)SNP位點(diǎn)，位于核苷酸序列SEQ IDN0.1的第861bp處，該位點(diǎn)為T/C的堿基突變，導(dǎo)致Alw261-RFLP多態(tài)性。這個(gè)堿基突變位于Resistin基因第3內(nèi)含子中，不改變其翻譯的氨基酸序列。故在Resistin基因序列的SNP位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)引物，得到分子標(biāo)記序列SEQ ID N0.1，從而鑒定豬平均日增重性狀。
[0036]為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0037]—種與豬部分生長性狀及飼料轉(zhuǎn)化效率性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的獲得:
[0038]I)豬Resistin基因的引物設(shè)計(jì)與部分DNA序列擴(kuò)增
[0039]用豬Resistin基因序列信息(GenBank收錄號(hào):ENSSSCG00000013575)作為引物設(shè)計(jì)的模板序列，利用生物學(xué)引物設(shè)計(jì)軟件01igo7.0設(shè)計(jì)引物，引物序列如下:
[0040]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0041]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'；
[0042]2) PCR擴(kuò)增反應(yīng):
[0043]利用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒(購自美國invitrogen公司)從純種美系大白閹割豬實(shí)驗(yàn)群體(該群體來源于湖北金林育種場(chǎng)，)(屠宰測(cè)定與采樣分成21個(gè)批次進(jìn)行，測(cè)定個(gè)體數(shù)量共計(jì)236頭，全部為美系純種大白閹割公豬)耳組織中提取基因組DNA，具體操作方法參照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒說明書進(jìn)行。
[0044]PCR反應(yīng):反應(yīng)總體積為30111，其中豬0嫩模板3.0111，PCRmixl5 yl，正向引物和反向引物各0.6nm0l/iil，最后加去離子水至總體積SOiiltjPCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min 后，循環(huán) 30 次 95°C 變性 308、581:退火308、721:延伸 40s，最后 72°C 延伸 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得了部分Resistin片段，長度為349bp，其序列為SEQ ID N0.2 所示。
[0045]3) PCR產(chǎn)物的純化、測(cè)序
[0046]PCR產(chǎn)物的純化:在紫外燈下從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5ml離心管中，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購自北京百泰克公司)純化PCR產(chǎn)物。將純化后的DNA溶液送至上海英駿公司正反向測(cè)序。
[0047]用引物擴(kuò)增豬基因組DNA得到了 349bp特異性擴(kuò)增片段，如圖2所示，正反向測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段所在的Resistin基因(SEQ ID N0.1所示)的第861位發(fā)現(xiàn)一個(gè)T-C轉(zhuǎn)換(如圖3所示)，造成一個(gè)Alw26I酶切位點(diǎn)(T(TTA)。
[0048]一種基于與豬平均日增重相關(guān)的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，其步驟如下:
[0049]I)引物序列
[0050]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0051]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'；
[0052]該引物擴(kuò)增片段長度349bp，其序列為SEQ ID N0.2所示。
[0053]2) PCR擴(kuò)增條件
[0054]PCR反應(yīng)總體積10 μ 1，其中豬基因組DNA模板I μ 1，正反向引物各0.2nmol/y I,PCRmix5 μ I,最后加入去離子水至總體積10 μ I。PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min后,循環(huán)30次95°C變性30s、58°C·退火30s、72°C延伸40s ;最后72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0055]3 ) RFLP 檢測(cè)
[0056]PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10 μ 1，其中PCR產(chǎn)物5 μ 1，去離子水3.5 μ 1，IOXbufferly 1，限制性內(nèi)切酶Alw26I為0.5 μ I (10U/μ I)，將樣品混勻后離心，37°C培養(yǎng)箱放置12h，用3.5% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。
[0057]酶切產(chǎn)生三種基因型，TT基因型只有349bp —條帶，CC基因型有183bp和166bp兩條帶，雜合子TC基因型有349bp、183bp和166bp三條帶。
[0058]一種與豬平均日增重性狀的分子標(biāo)記在與豬部分生長性狀及飼料轉(zhuǎn)化效率性狀相關(guān)的分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用，步驟如下:
[0059]采集樣品的平均日增重、采食量、預(yù)測(cè)采食量、剩余采食量、飼料轉(zhuǎn)化率及肌內(nèi)脂肪6項(xiàng)指標(biāo)。根據(jù)采集樣品的群體結(jié)構(gòu)，運(yùn)用混合模型來統(tǒng)計(jì)分析Resistin基因SNP位點(diǎn)的基因型效應(yīng)及其與飼料轉(zhuǎn)化效率性狀的關(guān)系:
[0060]Yij= μ +genotypei+ ε "+G
[0061]其中，Yij為處理后性狀值，μ為總體均值，ε ij為隨機(jī)誤差，G為批次效應(yīng)，假定服從Ν(0，σ2)分布。即可分析出基因型效應(yīng)，完成基因型效應(yīng)的多重性比較。采用SPSS16.0軟件(AsiaAnalytics China)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。
[0062]統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)該基因的T>C突變基因型，其中TT型與CC型的不同與平均日增重顯著相關(guān)(P=0.038)，與采食量、預(yù)測(cè)采食量及剩余采食量不顯著相關(guān)。通過最小二乘均數(shù)對(duì)基因型為TT、CC、TC的個(gè)體進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果表明TT型基因型平均日增重高于CC型基因型個(gè)體，TC型基因型與其他兩種基因型之間無顯著差異。
[0063]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):[0064]本發(fā)明利用現(xiàn)有的PCR-RFLP技術(shù)，在Resistin基因第861bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)T-C突變，且發(fā)現(xiàn)此多態(tài)位點(diǎn)與平均日增重性狀顯著相關(guān)，對(duì)豬生長性狀的研究有一定幫助。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0065]圖1為本發(fā)明技術(shù)流程圖。
[0066]圖2為豬Resistin基因基因組擴(kuò)增電泳結(jié)果不意圖。
[0067]M:DL2000分子量標(biāo)記；
[0068]圖3為本發(fā)明中豬Resistin基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)的T>C突變。
[0069]圖4為豬Resistin基因外顯子的Alw26I_RFLP的三種基因型(TT CC TC)電泳結(jié)
果示意圖。
[0070]M:50bpDNA 分子量標(biāo)記；P:PCR 產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0071]為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。
[0072]實(shí)施例1:
[0073]—種與豬平均日增重性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的獲得:
[0074](一)豬Resistin基因·的引物設(shè)計(jì)與部分DNA序列擴(kuò)增
[0075]用豬Resistin基因序列信息(GenBank收錄號(hào):ENSSSCG00000013575)作為引物設(shè)計(jì)的模板序列，利用生物學(xué)引物設(shè)計(jì)軟件01igo7.0設(shè)計(jì)引物，引物序列如下:
[0076]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0077]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'；
[0078](2) PCR 擴(kuò)增反應(yīng):
[0079]利用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒(購自美國invitrogen公司)從純種美系大白閹割豬實(shí)驗(yàn)群體(該群體來源于湖北金林育種場(chǎng))(屠宰測(cè)定與采樣分成21個(gè)批次進(jìn)行，測(cè)定個(gè)體數(shù)量共計(jì)236頭，全部為美系純種大白閹割公豬)耳組織中提取基因組DNA，具體操作方法參照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒說明書進(jìn)行。
[0080]PCR反應(yīng):反應(yīng)總體積為30 μ 1，其中豬DNA模板3.0 μ 1，PCRmixl5 μ 1，正向引物和反向引物各0.6nmol/μ 1，加入去離子水至總體積30 μ I。PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min 后，循環(huán) 30 次 95°C變性 30s、58°C退火 30s、72°C延伸 40s，最后 72°C 延伸 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)I (W/V) %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得了部分Resistin片段，長度為349bp，其序列為 SEQ ID N0.2 所示。
[0081](3) PCR產(chǎn)物的純化、測(cè)序
[0082]PCR產(chǎn)物的純化:在紫外燈下從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5ml離心管中，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購自北京百泰克公司)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是按照IOOmg膠塊加入400 μ I GS Buffer的比例加入GSBuffer，置50°C溫育lOmin，使瓊脂糖膠塊完全溶化，每兩分鐘顛倒混勻一次；將溶化的膠液轉(zhuǎn)入到離心吸附柱，并將離心吸附柱置于廢液收集管中，1000Orpm離心30s，棄去廢液；將離心吸附柱置回廢液收集管中，加入500 μ I Wash Buffer于離心吸附柱中，1000Orpm離心30s，棄濾液。以同樣的方法再用500 ill Wash Buffer溶液洗滌一次；將離心吸附柱置會(huì)廢液收集管中，最高速度離心Imin ;小心取出離心吸附柱，將其套入一個(gè)無菌的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入30iU雙蒸水，室溫靜置2-10min后，最高速度離心Imin ;取出離心吸附柱，將1.5ml離心管(DNA溶液)置于_20°C保存?zhèn)溆?。將純化后的DNA溶液送至上海英駿公司正反向測(cè)序。
[0083]用引物擴(kuò)增豬基因組DNA得到了 349bp特異性擴(kuò)增片段，如圖2所示，正反向測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段所在的Resistin基因(SEQ ID N0.1所示)的第861位發(fā)現(xiàn)一個(gè)T-C轉(zhuǎn)換
(如圖3所示)，造成一個(gè)Alw26I酶切位點(diǎn)(TC^TA )。
[0084]實(shí)施例2:
[0085]一種基于與豬平均日增重性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，其步驟如下:
[0086]PCR-RFLP診斷方法建立
[0087](I)引物序列
[0088]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0089]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'；
[0090]該引物擴(kuò)增片段長度349bp，其序列為SEQ ID N0.2所示。
[0091](2) PCR擴(kuò)增條件
[0092]PCR反應(yīng)總體積lOiil，其中豬基因組DNA模板liil，正反向引物各0.2nmol/u I,PCRmix5 u I,最后加入去離子水至總體積IOii I。PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min后,循環(huán)30次95°C變性30s、58°C退火30s、72°C延伸40s ;最后72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0093](3) RFLP 檢測(cè)
[0094]PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10 iil，其中PCR產(chǎn)物5 iil，去離子水3.5 iil，IOXbufferl iil，限制性內(nèi)切酶Alw26I為0.5 yl (IOU/yl)，將樣品混勻后離心，37°C培養(yǎng)箱放置12h，用3.5% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。
[0095]酶切產(chǎn)生三種基因型，TT基因型只有349bp —條帶，CC基因型有183bp和166bp兩條帶，雜合子TC基因型有349bp、183bp和166bp三條帶，如圖4所示。
[0096]實(shí)施例3:
[0097]—種與豬平均日增重性狀相關(guān)的分子標(biāo)記在不同豬群體多態(tài)性檢測(cè)中的應(yīng)用，其步驟是:
[0098]利用PCR-Alw26I_RFLP檢測(cè)了純種美系大白閹割豬實(shí)驗(yàn)群體(該群體來源于湖北金林育種場(chǎng))(236個(gè)美系純種大白閹割公豬群體)。該突變位點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)群體中的基因型和基因頻率如表1所示，檢測(cè)結(jié)果顯示，Resistin基因在實(shí)驗(yàn)群體中存在三種基因型，其中TT型個(gè)體有104頭，TC型個(gè)體有112頭，CC型個(gè)體有20頭，酶切分型的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相符，本發(fā)明的檢測(cè)方法可靠。此結(jié)果表明Resistin基因在純種美系大白閹割豬實(shí)驗(yàn)群體中等位基因T占優(yōu)勢(shì)。 [0099]實(shí)施例4:
[0100]一種與豬平均日增重性狀相關(guān)的分子標(biāo)記與部分生長性狀及飼料轉(zhuǎn)化效率性狀的關(guān)聯(lián)分析
[0101]本實(shí)施例的豬群來自本湖北金林育種場(chǎng)純種美系大白閹割豬，屠宰測(cè)定與采樣分成21個(gè)批次進(jìn)行，測(cè)定個(gè)體數(shù)量共計(jì)236頭，全部為美系純種大白閹割公豬。
[0102]所分析的性狀主要是部分生長性狀及與飼料轉(zhuǎn)化效率性狀相關(guān)的性狀，包括:平均日增重、采食量、預(yù)測(cè)采食量、剩余采食量、飼料轉(zhuǎn)化率及肌內(nèi)脂肪6項(xiàng)指標(biāo)。根據(jù)采集樣品的群體結(jié)構(gòu)， 申請(qǐng)人:運(yùn)用混合模型來統(tǒng)計(jì)分析Resistin基因SNP位點(diǎn)的基因型效應(yīng)及其與部分生長和飼料轉(zhuǎn)化效率性狀的關(guān)系:
[0103]Yij=U +genotypei+ ε ^.+G
[0104]其中，Yij為處理后性狀值，μ為總體均值，ε ij為隨機(jī)誤差，G為批次效應(yīng),假定服從Ν(0，σ2)分布。即可分析出基因型效應(yīng)，完成基因型效應(yīng)的多重性比較。采用SPSS16.0軟件(軟件來自于AsiaAnalytics China)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。
[0105]對(duì)豬Resistin基因Alw26I_RFLP多態(tài)性位點(diǎn)與部分生長及飼料轉(zhuǎn)化效率性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，由表1知:在236個(gè)個(gè)體中TT型個(gè)體有104頭，TC型個(gè)體有112頭，CC型個(gè)體有20頭。
[0106]本實(shí)施例采用SPSS16.0軟件中的廣義線性模型對(duì)豬Resistin基因的T>C突變位點(diǎn)的多態(tài)在美系大白閹割豬群體中對(duì)部分生長及飼料轉(zhuǎn)化效率性狀進(jìn)行了初步的關(guān)聯(lián)分析。初步分析結(jié)果見表1。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)該基因的T>c突變基因型，其中TT型與CC型的不同與平均日增重顯著相關(guān)(P=0.038)，與采食量、預(yù)測(cè)采食量及剩余采食量不顯著相關(guān)。通過最小二乘均數(shù)對(duì)基因型為TT、CC、TC的個(gè)體進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果表明TT型基因型平均日增重高于CC型基因型個(gè)體，TC型基因型與其他兩種基因型之間無顯著差異。
[0107]表1Resistin基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型與部分生長性狀及飼料轉(zhuǎn)化效率性狀的關(guān)
聯(lián)分析檢測(cè)
·[0108]
基因型樣木含參 ADG FI PFIRFIFCRIMF
Genotype N0.(Kg/d) (Kg) (Kg)(Kg)(%)
CC 20 0.760±0.001 1.992=^).019 2.128±0.011-0.137=?).0072.385 士0.009 0.022±0.0003
TT 104 0.771±0.002 2.308=^).004 2.251=K).0030.057±0.0012.625士0.009 0.020士 5.15Ε-






9
TC 112 0.727士 5.36Ε- 2.179 卻.004 2.223=K).002-0.044 卻.00022.402士0.0030.026±4.73Ε-
55
p-value 0.112 0346 0.188OJb0.6090.315
TT-CC 0.038* 0.146 0.0690.9480.5170.491
TT-TC 0.721 0.115 0.7060.7800.6030.] 34
CC-TC OO^ 0(31 0.104O V ^0.340U 汾 8
[0109]注:表中的性狀均值為平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差。
[0110]ADG:平均日增重；F1:日采食量；PF1:預(yù)測(cè)日采食量；RF1:剩余采食量；FCR:飼料轉(zhuǎn)化率；IMF:肌內(nèi)脂肪。[0111]其它未詳細(xì)說明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種豬平均日增重相關(guān)基因Resistin的分子標(biāo)記，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
2.用于獲得權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于:所述引物對(duì)為: 正向引物:5' -CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'； 反向引物:5' -AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'。
3.按權(quán)利要求1或2所述的分子標(biāo)記的獲得方法，其特征在于:以具有Resistin基因的豬基因組DNA為模板，采用以下引物對(duì): 正向引物:5' -CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'； 反向引物:5' -AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'。 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其所獲得的分子標(biāo)記為SEQ ID N0.2。
4.按照權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記鑒定豬高的平均日增重性狀的方法，其特征在于:以待測(cè)豬的基因組DNA為模板，采用以下引物對(duì): 正向引物:5' -CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'； 反向引物:5' -AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'； 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，具有349bp條帶的豬，其具有Resistin基因，如SEQ ID N0.1。
5.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在豬部分生長性狀及飼料轉(zhuǎn)化效率性狀相關(guān)分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記的引物對(duì)在豬部分生長性狀及飼料轉(zhuǎn)化效率性狀相關(guān)分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
7.一種鑒定含有Resistin基因的豬的方法，其特征在于，包括以下步驟是: 1)引物對(duì): 正向引物:5' -CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'； 反向引物:5' -AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'； 2)PCR擴(kuò)增條件 PCR反應(yīng)總體積10 u I，其中待測(cè)豬基因組DNA模板I Ul，正反向引物各0.2nmol/ U I，PCRmix5 u I,最后加入去離子水至總體積IOii I ; 3)PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min后，循環(huán)30次95°C變性30s、58°C退火30s、72°C延伸40s ;最后72°C延伸5min ;PCR產(chǎn)物經(jīng)2% W/V瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)； 4)RFLP檢測(cè) PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10 iil，其中PCR產(chǎn)物5 iil，去離子水3.5 iil，IOXbufferl U 1，限制性內(nèi)切酶 Alw26I 為 0.5 y 1(10U/U 1)， 將樣品混勻后離心，37°C培養(yǎng)箱放置12h，用3.5%W/V瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照； 酶切產(chǎn)生三種基因型，TT基因型只有349bp —條帶，CC基因型有183bp和166bp兩條帶，雜合子TC基因型有349bp、183bp和166bp三條帶。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103667279SQ201310753012
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】李長春, 鄒成, 成宏, 趙書紅, 余梅, 李新云 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)