短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）LDS33及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種短小芽孢桿菌（Bacillus?pumilus）LDS33及其在制備抗凝溶栓雙活性化合物中的應(yīng)用，短小芽孢桿菌LDS33保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為：CCTCC?NO：M2013179，GenBank登錄號(hào)為KF515275。本發(fā)明的短小芽孢桿菌（Bacillus?pumilus）LDS33菌株具有耐堿、耐鹽、耐熱、耐冷，易于培養(yǎng)、培養(yǎng)成本低、不受體系中有機(jī)物抑制等優(yōu)點(diǎn)，其發(fā)酵液可用于提取具有抗凝、溶栓雙活性作用的化合物，該化合物活性高、穩(wěn)定性好，可用于抗血栓藥物或保健品領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】短小芽抱桿菌(Bac i I I us pum i I us ) LDS33及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LDS33及其在制備抗凝溶栓雙活性化合物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]血栓栓塞性疾病是加速人體衰老、致殘、甚至死亡的直接原因和罪魁禍?zhǔn)祝砟睦镉醒?，哪里就有可能發(fā)生血栓，因此，防治血栓已成為世界各國(guó)最關(guān)心的問(wèn)題之一。
[0003]溶栓抗凝療法是治療血栓性疾病效果最好的療法之一，抗血栓藥物的發(fā)展對(duì)控制血栓病人的死亡率和致殘率起到了十分重要的作用。目前，臨床上治療血栓病的藥物大都作用單一，要么只有溶栓作用，要么只有抗凝作用，使用時(shí)抗凝、溶栓需要分別給藥，這給臨床應(yīng)用帶來(lái)了許多不便之處，所以尋找溶栓活性高、副作用小、且具有溶栓和抗凝雙活性的藥物已逐漸成為全世界醫(yī)藥行業(yè)的研究熱點(diǎn)。
[0004]短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)屬于芽孢桿菌屬,產(chǎn)生活性物質(zhì)的概率很高，不僅可以產(chǎn)生多種酶，如耐熱木聚糖酶、耐熱絲氨酸堿性蛋白酶、谷氨酰內(nèi)肽酶、膽紅素氧化酶、膠原蛋白酶、脂肪酶、耐熱角蛋白酶、降解毒死蜱的酶、降解石油的酶、降解血紅蛋白的酶等，還可以產(chǎn)生多種抗生素，特別是抗真菌的抗生素。所以尋找新的抗血栓藥物，同時(shí)發(fā)掘短小芽孢桿菌的新用途，具有重要的科學(xué)研究和應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提·供一種可產(chǎn)生抗凝溶栓雙活性作用化合物的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LDS33。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供上述短小芽孢桿菌LDS33在制備具有抗凝溶栓雙活性作用化合物中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LDS33已于2013年05月07日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，保藏號(hào)為:CCTCC NO:M2013179，GenBank 登錄號(hào)為:KF515275。
[0008]本發(fā)明提供的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LDS33在VY/4平板上的菌落為淡黃色、較薄、表面黏濕，邊緣不整齊，有很多樹葉邊緣狀的突起。該菌株在VY/4平板上生長(zhǎng)緩慢，可滑動(dòng)。其菌體長(zhǎng)約1.67 μ m-3.67 μ m，寬約0.5 μ m-0.67 μ m。
[0009]菌株Bacillus pumilus LDS33既可在VY/4培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，又可在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，適宜的生長(zhǎng)溫度為15°C-50°C，最佳生長(zhǎng)溫度為30°C-35°C。另外，菌株Bacilluspumilus LDS33培養(yǎng)是在好氧條件下進(jìn)行的，培養(yǎng)基的pH范圍為pH4.0-pH12.0，說(shuō)明該菌既可在酸性條件下生長(zhǎng)繁殖，又可在堿性條件下生長(zhǎng)繁殖，pH8.5-pH9.0是其最適的生長(zhǎng)條件。
[0010]本發(fā)明提供的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LDS33可用于提取具有抗凝和溶栓雙活性作用的化合物。[0011]本發(fā)明的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LDS33菌株具有耐堿、耐鹽、耐熱、耐冷，易于培養(yǎng)、培養(yǎng)成本低、不受體系中有機(jī)物抑制等優(yōu)點(diǎn)，其發(fā)酵液可用于提取具有抗凝溶栓雙活性作用的化合物，該化合物活性高、穩(wěn)定性好，可用于抗血栓藥物或保健品領(lǐng)域。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為抗凝溶栓雙活性化合物在纖維蛋白平板上形成的透明圈。
[0013]圖2為尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0014]圖3為菌株LDS33的基因同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0015]圖4為菌株LDS33在不同pH值的LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況。
[0016]圖5 為 Sephadex G-200 層析圖譜。
[0017]圖1 中:① 30yL10U/mL 尿激酶；② 30yL100U/mL 尿激酶；③ 30yL500U/mL 尿激酶；④30 μ L1000U/mL尿激酶；⑤30 μ L2500U/mL尿激酶；⑥30 μ L5000U/mL尿激酶；Θ 30 μ L菌株LDS33的胞外濃縮液。
[0018]圖3中:圓括號(hào)內(nèi)為GenBank中的登錄號(hào)。每個(gè)分支點(diǎn)處的數(shù)字為Bootstrap(1000次重復(fù)抽樣)的支持百分率。標(biāo)尺代表1%的序列差異。
[0019]圖5中:峰A為活 性峰，其它峰為雜蛋白峰。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1
[0021]1.短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus) LDS33 的篩選
[0022](I)材料
[0023]a.樣品:
[0024]采自成都市及周邊洛帶、龍泉驛、雙流等地的兔糞、羊糞、泥土、水等共20個(gè)樣品。樣品采回后風(fēng)干，馬上使用(水樣不用風(fēng)干，采回后直接使用)。
[0025]b.培養(yǎng)基:
[0026]VY/4 固體培養(yǎng)基:安琪酵母 0.25%, CaCl2.2Η200.1 %，維生素 B120.5 μ g/ml、瓊脂粉 1.60%, pH7.22。
[0027]酪蛋白培養(yǎng)基:酪蛋白0.25%, NaCl0.05%，無(wú)水 CaCl20.01%，維生素 B120.5 μ g/ml，瓊脂粉1.6%，pH值7.22。
[0028]c.試劑及儀器:
[0029]試劑:安琪酵母(湖北安琪酵母股份有限公司)，維生素B 12 (BR)(成都市科龍化工試劑廠)等。
[0030]儀器:SW-CJ-1D潔凈工作臺(tái)(江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠)，DH-400型電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，全溫振蕩培養(yǎng)箱(瑯幵)，奧林巴斯生物顯微鏡CX21B1M-SET6, PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(加拿大BBI公司)，3730測(cè)序列分析儀(美國(guó)ABI公司)，YXJ-2離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，H6-1微型電泳槽(上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠),Sherolock全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)(美國(guó)MIDI (Microbial Identification)公司),凝膠成像系統(tǒng)(Gene Genius公司)，U_3010紫外-可見分光光度計(jì)(Hitachi公司)，移液器(范圍 100 μ 1-1000 μ I,20 μ 1-200 μ 1,0.5μ 1-10 μ I)(加拿大 BBI 公司)，等。[0031](2)菌株 Bacillus pumilus LDS 的篩選
[0032]a、樣品的預(yù)處理:取樣品適量，用30mg/L的多菌靈溶液浸泡(水樣不用多菌靈處理)；
[0033]b、VY/4平板法:將用多菌靈處理過(guò)的兔糞、羊糞、泥土等樣品及沒(méi)有用多菌靈處理過(guò)的水樣放入加有30mg/L多菌靈的VY/4平板上，置30°C恒溫培養(yǎng)，及時(shí)挑取疑似短小芽孢桿菌的菌落，轉(zhuǎn)接于VY/4平板上，繼續(xù)置30°C恒溫培養(yǎng)，反復(fù)轉(zhuǎn)接于VY/4平板上，30°C恒溫培養(yǎng)，直到目測(cè)單一菌落為止。
[0034]C、酪蛋白平板法:將疑似菌株接種在酪蛋白平板上，30°C恒溫培養(yǎng)，觀察是否有透明圈并測(cè)量透明圈直徑大小，有透明圈者則證明該菌株可能產(chǎn)生纖溶酶，透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比(D/d)越大，其酶活性越高。
[0035]選擇透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比(D/d)最大的菌株，最終從成都市洛帶鎮(zhèn)某魚池水樣中分離到短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LDS33菌株。
[0036]2.短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LDS33菌株的鑒定
[0037](I)短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LDS33菌株的形態(tài)特征:
[0038]將目的菌株在VY/4固體培養(yǎng)基上進(jìn)行稀釋涂布，在30°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)4d-5d，觀察菌落形態(tài)，同時(shí)對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)菌株Bacillus pumilus LDS33在VY/4平板上的菌落為淡黃色、較薄、表面黏濕，邊緣不整齊，有很多樹葉邊緣狀的突起。同時(shí)該菌株在VY/4平板上生長(zhǎng)緩慢，可滑動(dòng)。革蘭氏陽(yáng)性，其芽孢端生，桿狀，兩端鈍圓，其菌體長(zhǎng)約1.67 μ m-3.67 μ m,寬約0.5 μ m-0.67 μ m,菌體不具有莢膜，無(wú)鞭毛。
[0039](2)短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LDS33菌株的理化性質(zhì)檢驗(yàn):
[0040]菌株Bacillus pumilus LDS33的理化性質(zhì)通過(guò)接觸酶試驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、V-P測(cè)定、淀粉水解試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、馬尿酸鹽水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、厭氧洋菜中是否生長(zhǎng)等實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，結(jié)果如表1所示。
[0041]表1.短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LDS33的理化性質(zhì)
[0042]
【權(quán)利要求】
1.短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) LDS33，保藏號(hào)為 CCTCC NO:M2013179。
2.如權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌LDS33在制備具有抗凝溶栓雙活性作用化合物中的應(yīng)用 。
【文檔編號(hào)】C12R1/07GK103849583SQ201310752611
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】劉冰花, 羅亞雄, 陶雪梅, 蒲小龍, 袁管明, 梁煉國(guó) 申請(qǐng)人:成都大學(xué)