Tc標記表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑單光子示蹤劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種采用全自動化、一步法合成99mTc標記的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑單光子示蹤劑的方法，本發(fā)明屬化學合成領域。本發(fā)明方法可按如下步驟依次進行：1)在含有前體的試劑瓶中加入氯化亞錫(SnCl2)或TPPTS，然后加入EDDA；2)向步驟1)的反應瓶中加入Na99mTcO4溶液，80-100℃加熱5-20min；3)降低溫度；4)對產(chǎn)物進行過濾、稀釋和分裝。實驗證明，本發(fā)明的方法具備多用途、產(chǎn)量大、效率高、合成簡便易行以及費用低廉等特點。且由該方法制備得到的99mTc-EGFR-TKI示蹤劑具有診斷和指導治療的臨床價值，特別是對于肺癌早期診斷、肺癌治療方案制定、療效的評價均具有重要的意義。
【專利說明】采用全自動化、一步法合成99mTc標記表皮生長因子受體酪 氨酸激酶抑制劑單光子示蹤劑的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用99mTc通過螯合方式標記小分子苯胺喹唑啉類EGFR類單光子 示蹤劑及其制備方法，特別涉及一種采用全自動化、一步法合成99mTc標記的表皮生長因子 受體酪氨酸激酶抑制劑單光子示蹤劑的方法。本發(fā)明屬化學合成領域。

【背景技術】
[0002] 目前PET和PET/CT被公認為最佳進行的腫瘤早期診斷、分期和療效評價的方法， 為此nC、18F標記的正電子藥物倍受關注。但是，盡管如此，PET和PET/CT使用的正電子藥 物均具有半衰期短（11C由于半衰期僅僅20分鐘，18F是110分鐘）等缺點，這些缺點均導致 采用nC、18F標記的正電子藥物無法進行動態(tài)、多次進行臨床顯像。特別是對于一些診斷明 確，臨床需要采用分子影像技術監(jiān)測其療效時，就需要特別考慮檢查費用的問題。 99mTc具有 6個小時的半衰期、而且是采用發(fā)生器生產(chǎn)的放射性同位素，這樣非常有利于臨床、科研多 次使用，特別是能夠顯著降低檢查費用，有利于推動指導個性化治療朝著普及化發(fā)展。
[0003] 表皮生長因子受體（EGFR)是原癌基因c-erbB的表達產(chǎn)物，屬受體型酪氨酸激酶 (tyrosinekinase，TK)。EGFR與配體結合后活化胞內區(qū)TK，激活多條信號通路，參與腫瘤 細胞增殖、凋亡抑制、侵襲、轉移及治療抗拒等過程。EGFR在放射線抵抗及照射后細胞加速 再增殖中具有重要意義，可作為預測放療療效的重要依據(jù)和放療增敏的有效靶點。EGFR靶 向治療與傳統(tǒng)化療相比，因具有更好的安全性和耐受性，在非小細胞肺癌（NSCLC)等惡性 腫瘤的治療中占有越來越重要的地位，但是治療費用相當高昂，因此治療前明確EGFR的表 達水平，對腫瘤的治療及預后判斷及藥物衛(wèi)生經(jīng)濟學具有一定的價值。隨著EGFR分子靶向 治療廣泛應用于臨床，EGFR分子顯像也逐漸引起了關注并得到了初步的研究。
[0004] 以EGFR為治療靶點是腫瘤分子靶向治療的重要部分，主要有單克隆抗體及小分 子酪氨酸激酶拮抗劑兩種方式，如西妥昔單抗（Cetuximab，Erbitux,愛必妥）、尼妥珠單抗 (Nimotuzumab，泰欣生）和吉非替尼（Gefitinib，Iressa,易瑞沙）、厄洛替尼（Erlotinib, Tarceva，特羅凱）等在臨床實驗及臨床應用中表現(xiàn)出較好的治療效果。與抗體相比較，小 分子酪氨酸激酶拮抗劑由于合成簡單、患者副作用小而受到臨床關注。
[0005](一）小分子EGFR受體抑制劑及其應用
[0006] 1、小分子EGFR受體及其分類
[0007] 表皮生長因子（EpidermalGrowthFactor,EGF)是常見生長因子的一種，促 進表皮細胞、上皮細胞及間質的生長。表皮生長因子受體（EpidermalGrowthFactor Receptor,EGFR)家族包括EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4等4個成員，其家族受體酪氨酸激酶 (ReceptorTyrosineKinase,RTK)以單體形式存在，在結構上由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內區(qū)3 個部分組成，胞外區(qū)具有2個半光氨酸豐富區(qū)，胞內區(qū)具有典型的腺苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP)結合位點和酪氨酸激酶區(qū)，其酪氨酸激酶活性在調節(jié)細胞增殖及分化 中至關重要的作用。EGFR在許多腫瘤中的過表達和/或突變，借助信號轉導導致細胞生長 失控和惡性化。另外EGFR的異常表達還與新生血管的生成，腫瘤的侵襲和轉移，腫瘤的化 療抗性及預后密切相關。EGFR高表達的腫瘤患者，腫瘤惡性程度高，容易發(fā)生轉移，復發(fā)率 高，預后差。
[0008] 2、小分子EGFR抑制劑在臨床應用
[0009]目前臨床最長使用的小分子EGFR抑制劑有吉非替尼和、厄羅替尼。
[0010] 吉非替尼（Gefitinib，ZD1839,Iressa):吉非替尼是一種能夠通過阻斷EGFR信 號傳導通路而抑制腫瘤細胞的生長與增殖的EGFR-TKIs。2003年美國食品與藥品管理局 (FDA)批準吉非替尼用于既往化療失敗的晚期NSCLC患者的治療。相關研究發(fā)現(xiàn)，即使患者 曾接受過多次化療藥物治療，吉非替尼仍可發(fā)揮作用，特別是對亞裔女性、不吸煙的肺腺癌 患者。Kim等做的類似研究結果也顯示，在晚期NSCLC的二線治療中，吉非替尼與多烯紫杉 醇化療方案相比，兩者療效相當，但前者具有更好的安全性與耐受性，這些研究確定了吉非 替尼可作為晚期NSCLC二線治療的標準方案。近幾年研究發(fā)現(xiàn)吉非替尼的療效與患者的種 族有很大關系，其中最早是發(fā)現(xiàn)亞洲一些無吸煙史的女性肺腺癌患者對其特別敏感。2004 年GiacconeG等研究證實這一人群普遍存在EGFR基因的突變。有研究表明具有EGFR基 因突變的患者對EGFR-TKIs治療的敏感率可達70 %?80%，并且接受EGFR-TKIs治療后 EGFR基因突變的患者與EGFR基因正常的患者相比總生存期（overallsurvival，0S)明顯 延長。
[0011] 厄羅替尼（Erlotinib，0SI-774，Tarceva):厄羅替尼屬喹唑啉類化合物，是一種 兼具選擇性以及可逆性的EGFR-TK活性抑制劑，具有水溶性特點，能穿過細胞膜與細胞質 內位于EGFR分子的酪氨酸激酶結構域的噪呤核苷三磷酸（adenosine-triphosphate,ATP) 特異性結合，阻止ATP與細胞內酪氨酸激酶結合，抑制其磷酸化，阻斷信號傳導，從而可逆 地抑制EGFR酪氨酸激酶活性，抑制肺癌細胞的游走、粘附、侵襲和血管新生，促使肺癌細胞 凋亡。2009年Rosell等的一項多中心臨床研究通過檢測2005年4月-2007年12月2 312 例IV期NSCLC患者腫瘤標本的EGFR外顯子19D746-750缺失及外顯子21L858R突變，發(fā)現(xiàn) 其中有307例患者EGFR突變，并對這部分患者采用厄羅替尼治療。結果發(fā)現(xiàn)在165例資料 完整并且可評價療效的患者中，48例（29. 1% )為男性，112例（67.9% )為不吸煙者，124 例（75. 2% )為腺癌。103例（62. 8% )EGFR基因19外顯子缺失，62例（37. 6% )EGFR基因 21外顯子突變，89例（53.9%)為厄洛替尼一線治療者，76例（46. 1%)為二線治療者。而 納入分析的193例患者資料則顯示，總有效率為70. 8% (128例），緩解率13. 3 % (24例）， 其中位OS為22個月，其中男性為17個月，女性為28個月。中位疾病進展時間（TTP)為12 個月，女性也存在優(yōu)勢。61?71歲年齡組患者的有效率是其他年齡組患者的2倍，存在外 顯子19缺失患者的有效率是非缺失者的2倍。外顯子19缺失及L858R突變患者的平均OS 分別為27個月及16個月，兩者之間存在差異（P= 0.03)。該研究中觀察到2 312例中的 307例患者EGFR基因19或21外顯子突變，突變率為13. 3%，其中62. 8%的患者存在19外 顯子缺失，而37. 6%的患者存在21外顯子突變，與已知的白種人EGFR突變率低于亞洲人種 相一致。這一研究結果提示了EGFR突變患者可從厄洛替尼治療中顯著獲益，它也強調了檢 測EGFR基因突變對于實現(xiàn)個體化治療的重要性。
[0012](二）目前檢測EGFR是否突變、篩選小分子EGFR抑制劑受益人群及監(jiān)測治療療效 的方法及其局限
[0013] 目前，可能預測EGFR靶向治療療效的生物學標志物包括EGFR蛋白或mRNA高表 達、EGFR基因拷貝數(shù)、EGFR基因突變、K-RAS基因突變、EGFR下游信號系統(tǒng)的相關標志物等。 但尚無足夠循證醫(yī)學證據(jù)推薦應用生物學標志物來決定是否應用TKIs治療。
[0014] 常規(guī)DNA測序，PCR技術擴增EGFR基因后，DNA分析、熒光RT-PCR、高效液相色譜 法雖可判斷EGFR基因突變，但從技術層面上分析，都存在著局限性。①活體取材：屬于離 體的、有創(chuàng)性檢查，增加操作后病變轉移的風險；②組織取材要求高，受成分和實驗條件影 響較大；③目前研究的取材很多來自確診時的手術病理標本，能否代表患者接受TKI治療 前復發(fā)的腫瘤狀況需進一步研究；④操作復雜，耗時多、隨機性較大；⑤檢測中所需的儀器 昂貴、效率較低，目前國內僅有少數(shù)幾家單位可以提供該項基因檢測方法，故難以大面積推 廣應用，目前只有約五分之一的患者能找到合適的組織標本進行檢測；⑥最新的研究有人 嘗試從胸腔積液和血清中檢測EGFR突變，但是由于這種方式獲得的EGFR樣本量及其微小， 檢出率、一致性及準確率較低；⑦傳統(tǒng)影像學技術在監(jiān)測EGFR靶向治療療效中也存在諸多 不確定因素，尚無明確的影像學手段能判斷EGFR靶向治療的療效。在NSCLC患者中識別出 最有可能從EGFR靶向治療中受益的患者，仍是決定EGFR靶向治療的難題。因此，探尋一種 更簡單、更直觀，且同樣敏感、準確，并能夠在活體實時預測小分子EGFR抑制劑治療敏感患 者，指導此類藥物用藥，監(jiān)測治療療效的檢測方法成為了目前國內外研究的另一研究熱點 問題。
[0015] 分子影像是檢測EGFR狀態(tài)的理想方式，分子影像是在活體上從分子水平研究細 胞功能、代謝以達到疾病診斷、療效判定和新藥研制的全新領域。分子影像利用分子探針結 合胞內特定靶分子，活體采用PET、PET/CT、MRI、SPECT、SPECT/CT及光學成像設備等探測成 像，具有高特異性、高靈敏度和高分辨率，能無創(chuàng)性提供定位、定性和定量資料。
[0016]99niTc標記小分子喹唑啉類EGFR類單光子示蹤劑（99niTc-EGFR-TKI)能夠特異性與 肺癌組織細胞結合，顯示腫瘤細胞分子病理學的特征。這種特征可以用于對肺癌的活體分 子病理學診斷，指導分子喹唑啉類肺癌治療藥物對肺癌個體化治療療效的評估。


【發(fā)明內容】

[0017] 本發(fā)明旨在建立一種全自動化、一步法合成99mTc標記的小分子喹唑啉類EGFR 類單光子示蹤劑（99mTc-EGFR-TKI)的方法，本發(fā)明方法利用本發(fā)明自行設計的前體合成 99mTc-EGFR-TKI放射性示蹤劑，該方法具有多用途、產(chǎn)量大、效率高、方法穩(wěn)定、合成時間短， 以及花費低等優(yōu)點。
[0018] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術手段：
[0019](一）設計獨特的前體，在前體中采用HYNIC、EDDA和Tricine作為螯合基團。前 體中含有PEG基團，增加了親水性。
[0020] 在前體的7位引入4個PEG基團（提高親水性），并在PEG基團的末端接上對肼尼 克酰胺（HYNIC)，這是本發(fā)明的核心技術之一，所述前體的結構如式I所示：
[0021]

【權利要求】
1. 采用全自動化一步法合成99mTc標記的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑 (EGFR-TKI)單光子示蹤劑的（ 99mTc-EGFR-TKI)方法，其特征在于，按如下步驟依次進行： 1) 在含有前體的試劑瓶中加入氯化亞錫（SnC12)或三磺化三苯基膦（TPPTS)，然后再 加入乙二胺-N，N'-二乙酸（EDDA)，其中，所述的前體的結構如式I所示；
2) 將含有放射性的Na99mTcO4溶液直接加入到步驟1)的試劑瓶中，通入惰性氣體保護， 80-100°C加熱 5-20min ; 3) 降低溫度后，用生理鹽水或緩沖液稀釋后，用無菌濾膜過濾； 4) 分裝后使用。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中在含有10 μ I 3mg/ml的前體的 試劑瓶中加入10 μ 1 〇· 2mg/ml的氯化亞錫（SnCl2)或三磺化三苯基膦（TPPTS)以及0· 5ml lmg/ml 的乙二胺-N，Ν'-二乙酸（EDDA);步驟 2)中將 0. 5ml，10 μ Ci 的 Na99mTcO4 溶液直 接加入到步驟1)的試劑瓶中。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)中在含有前體試劑瓶中加入氯化 亞錫或TPPTS，然后再加入EDDA后在惰性氣體的保護下進行加熱以提高標記率。
4. 根據(jù)權利要求1或3所述的方法，其特征在于所述的惰性氣體為氮氣。
5. 根據(jù)權利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述的加熱為水浴加熱、微波加熱或 電熱爐加熱，優(yōu)選微波加熱。
6. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)中還包括在含有前體的試劑瓶中 加入N-三輕甲基甘氨酸（Tricine)。
7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟3)中所述的緩沖液為磷酸緩沖液、 琥珀酸緩沖液。
8. -種99mTc標記表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI)單光子示蹤劑 ( 99mTc-EGFR-TKI)，其特征在于具有式II所示的結構：
9. 權利要求8所述的99mTc標記表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI)單光 子示蹤劑在制備檢測表皮生長因子受體表達水平試劑中的應用。
10. 權利要求8所述的99mTc標記表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI)單 光子示蹤劑在制備篩選小分子表皮生長因子受體抑制劑試劑中的應用。
【文檔編號】A61K103/10GK104262401SQ201410386984
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月7日 優(yōu)先權日:2014年8月7日
【發(fā)明者】申寶忠 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學