生產(chǎn)d-乳酸的重組大腸桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了一種含有突變的ldhA基因的大腸桿菌。本發(fā)明還涉及使用所述經(jīng)工程化的重組大腸桿菌用于生產(chǎn)D-乳酸的用途，及使用所述經(jīng)工程化的重組大腸桿菌生產(chǎn)D-乳酸的方法。在本發(fā)明生產(chǎn)D-乳酸的方法中，可以在高溫下(42-50℃)進(jìn)行發(fā)酵。在本發(fā)明生產(chǎn)D-乳酸的方法中，可以在發(fā)酵過程中使用氨水或者氫氧化鈉作為中和劑。CGMCC No76782013.06.04CGMCC No76792013.06.04CGMCC No78712013.07.03
【專利說明】生產(chǎn)D-乳酸的重組大腸桿菌及其應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及通過大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了一種 用于生產(chǎn)D-乳酸的經(jīng)工程化的重組大腸桿菌。本發(fā)明還涉及使用所述經(jīng)工程化的重組大 腸桿菌用于生產(chǎn)D-乳酸的用途，及使用所述經(jīng)工程化的重組大腸桿菌生產(chǎn)D-乳酸的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] D-乳酸為手性小分子，是合成多種手性物質(zhì)的前體，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、化工等方面的 應(yīng)用十分廣泛。以D-乳酸為原料合成的D-聚乳酸，具有生物可降解性，是理想的綠色高分 子材料：可代替由聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯等材料生產(chǎn)新型環(huán)保包裝材料；可代替硅橡 膠、硅油等傳統(tǒng)的醫(yī)用材料制作骨內(nèi)固定物和醫(yī)用手術(shù)縫合線等醫(yī)用材料；用于紡織行業(yè)， 制成手感好、滑爽性強(qiáng)并富有光澤的內(nèi)衣；以D-乳酸為原料合成乳酸酯類用于香料、樹脂 涂料、膠黏劑及印刷油墨等的生產(chǎn)；用于制造優(yōu)良除草劑：驃馬（Puma Super)、威霸（Whip Super ;德國(guó) Hoechst 公司）、DuplosanR (德國(guó) BASF 公司）。
[0004] D-乳酸的制備方法主要有手性拆分法、酶轉(zhuǎn)化法和直接發(fā)酵法。由于手性拆分法 和酶轉(zhuǎn)化法存在污染環(huán)境，成本昂貴等問題，目前D-乳酸的大規(guī)模化生產(chǎn)大多采用微生物 發(fā)酵法。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-乳酸，以其生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品安全性高，成為大規(guī)模生產(chǎn)D-乳 酸的主要方法。生產(chǎn)高光學(xué)純度的D-乳酸是微生物發(fā)酵法的主要制約因素。
[0005] 目前乳酸發(fā)酵菌株主要有兩大類。第一類是天然產(chǎn)乳酸菌，主要是乳酸芽孢桿菌 (Lactobacillus)，由于具有耐酸性強(qiáng)，遺傳改造后能生產(chǎn)高光學(xué)純度的D-乳酸，因此是重 要的商業(yè)化菌株（Demirici et al. 1992, J Indust Microbiol Biotechnolll:23_28;0kano K et al 2009, Appl Environ Microbiol 75:462-467)。該生產(chǎn)菌的缺點(diǎn)是發(fā)酵過程需要 豐富培養(yǎng)基，不能利用五碳糖，提高了生產(chǎn)成本和下游分離純化的成本。該類菌通常使用氫 氧化鈣或碳酸鈣作為中和劑來控制發(fā)酵PH，最終的發(fā)酵產(chǎn)物是乳酸鈣。然而，乳酸鈣在分離 提取的過程中通常需要加入硫酸，會(huì)產(chǎn)生大量的硫酸鈣廢物，難以處理。更重要的是，該類 菌生產(chǎn)的D-乳酸手性純度通常都在98%以下，達(dá)不到聚乳酸生產(chǎn)的要求。
[0006] 另一類是通過代謝工程改造的工程菌，有酵母菌（Saccharomyces)，芽孢桿菌 (Bacillus),克氏菌（Kluyveromyces)和大腸桿菌（Escherichia)。這些改造的菌株都在某 些方面提高了乳酸生產(chǎn)的性能如擴(kuò)大了底物利用的范圍，減少了營(yíng)養(yǎng)需求，或減少了質(zhì)粒 或抗生素的使用等（Bianchi et al.2001, Appl Environ Microbiol67:5621_5625;Grabar et al. 2006, Biotechnol Lett 28:1527-153; Stewart et al. 2013, Yeast 30:81-91)。在微 生物發(fā)酵生產(chǎn)中，大腸桿菌（E.coli)由于其遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、易培養(yǎng)、生長(zhǎng) 迅速、能夠利用多種碳源及能以簡(jiǎn)單的無機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于研究以獲得 高產(chǎn)菌株。大腸桿菌在缺氧條件下，通常消耗糖或其衍生物，并發(fā)酵產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸、 丁二酸、乙醇等產(chǎn)物。野生型大腸桿菌生產(chǎn)乳酸等的產(chǎn)率通常較低。近年來的研究表明，對(duì) 大腸桿菌的代謝途徑進(jìn)行遺傳改造，可以獲得乳酸高產(chǎn)菌株。同時(shí)改造大腸桿菌細(xì)胞使其 能夠生產(chǎn)高光學(xué)純度的D-乳酸是目前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
[0007] Zhou 等（Zhou et al. 2003, Applied Environ Microbiol 69:399-407)通過在大 腸桿菌W3110中敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因 pflB，富馬酸還原酶基因 frdABCD，醇脫氫酶 基因 adhE和乙酸激酶基因 ackA，得到了重組大腸桿菌菌株SZ63能夠在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中利 用5%的葡萄糖在168小時(shí)合成了 48g/L的D-乳酸，糖酸轉(zhuǎn)化率接近2m〇l/m〇l，手性純度 達(dá)到99%。Zhou等使用相同的策略，在大腸桿菌B菌株中構(gòu)建了重組菌SZ186,并通過進(jìn)化 代謝獲得了 SZ194菌株。在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中利用12%的葡萄糖在72小時(shí)合成了 lllg/L的 D-乳酸，糖酸轉(zhuǎn)化率接近2mol/mol，手性純度達(dá)到95%(Zhou et al. 2005, Biotechnol Iett 27:1891-1896;Zhou et al. 2006,Biotechnol Lett 28:663-670)。
[0008] Grabar 等（Grabar et al. 2006, Biotechnol Lett 28:1527-1535)繼續(xù)對(duì) SZ194 菌株進(jìn)行了改造，敲除了甲基乙二醛合成酶基因 mgsA得到了重組菌TG112,進(jìn)一步進(jìn)化代 謝獲得TG114,在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中利用12%的葡萄糖在48小時(shí)合成了 118g/L的D-乳酸，光 學(xué)純度達(dá)到99. 9%，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為0. 98g/g。
[0009] 上述這些工程化的大腸桿菌都是使用氫氧化鉀作為中和劑。氫氧化鉀在工業(yè)生產(chǎn) 時(shí)的成本較高，而氨水和氫氧化鈉的成本要便宜很多。因此，需要發(fā)酵過程中需要使用氨水 或氫氧化鈉作為中和劑來調(diào)節(jié)PH值的大腸桿菌。
[0010] 為了提高大腸桿菌生產(chǎn)D-乳酸的產(chǎn)量和/或轉(zhuǎn)化率，需要進(jìn)一步對(duì)大腸桿菌的代 謝途徑進(jìn)行改造。另外，為了在工業(yè)上減少細(xì)菌污染的可能，需要進(jìn)一步對(duì)大腸桿菌的生理 性能進(jìn)行優(yōu)化，提高大腸桿菌生產(chǎn)D-乳酸的發(fā)酵溫度。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 一方面，本發(fā)明提供了 一種用于生產(chǎn)D-乳酸的重組大腸桿菌。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌含有突 變的IdhA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. :1所示氨基酸序列中的R282的位置 上含有修飾，對(duì)應(yīng)的位置是通過與SEQ ID No. :1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，所述大腸桿菌中所述突變的IdhA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或所述突變的IdhA所編 碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下的修飾：PflB 基因表達(dá)的抑制、和/或PflB基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；frdAB⑶基因簇表達(dá)的抑 制、和/或frdABCD基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌含有突 變的IdhA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列中的R282的位置 上含有修飾，其中在對(duì)應(yīng)于R282的位置上的修飾是用C置換R，對(duì)應(yīng)的位置是通過與SEQ ID No. :1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌含有突 變的IdhA基因，其中所述突變的IdhA基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. :2所示核苷酸序列中的 C844的位置上含有突變，對(duì)應(yīng)的位置是通過與SEQ ID No. : 2進(jìn)行序列比對(duì)而確定的。在一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述大腸桿菌中所述突變的IdhA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或所述突變 的IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌含有突 變的IdhA基因，其中所述突變的IdhA基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. :2所示核苷酸序列中的 C844的位置上含有突變，并且其中所述突變是用T置換C，對(duì)應(yīng)的位置是通過與SEQ ID No. :2進(jìn)行序列比對(duì)而確定的。
[0017] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下的修飾：mgsA基因表達(dá)的抑 制、和/或mgsA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌含有突 變的IdhA基因，其中所述突變的IdhA基因位于質(zhì)?；蛉旧w中。
[0019] 在第二方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)D-乳酸的方法，其中包括培養(yǎng)本發(fā)明的大腸 桿菌的步驟。
[0020] 在第三方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的大腸桿菌在生產(chǎn)D-乳酸中的用途。
[0021] 附圖簡(jiǎn)述
[0022] 圖1 :改造大腸桿菌獲得重組菌株Dlac-006的示意圖。X代表基因敲除，包括敲除 pflB、frd、mgsA 基因。
[0023] 圖2 :菌株Dlac-002，Dlac-004，Dlac-006發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的光學(xué)純度。圖2A為 D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，圖2B為L(zhǎng)-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，圖2C為乳酸混合物（D-乳酸光學(xué)純度為99. 5%)， 圖 2D 為 Dlac-002,圖 2E 為 Dlac-004,圖 2F 為 Dlac-006。
[0024] 圖3 :Dlac-006經(jīng)過520代進(jìn)化獲得菌株Dlac-012。
[0025] 圖4 :Dlac-012在500mL發(fā)酵罐水平發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的光學(xué)純度。
[0026] 圖5 :Dlac-012在5L發(fā)酵罐水平發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸。圖5A為細(xì)胞生長(zhǎng)、葡萄糖消 耗和D-乳酸生產(chǎn)情況。圖5B為發(fā)酵所產(chǎn)D-乳酸的光學(xué)純度。
[0027] 圖6 :圖6A示出了野生型IdhA基因以及突變的IdhA基因（IdhA*)的核苷酸序列 比對(duì)；圖6B示出了野生型以及突變的IdhA基因（IdhA*)所編碼的多肽的氨基酸序列比對(duì)。
[0028] 圖7 :Dlac_014在500mL發(fā)酵罐水平發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的光學(xué)純度。
[0029] 圖8 :Dlac-012經(jīng)過360代進(jìn)化獲得菌株Dlac-206。
[0030] 圖9 :Dlac-206在500ml發(fā)酵罐水平發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸。發(fā)酵溫度為42度。圖9A 為細(xì)胞生長(zhǎng)、葡萄糖消耗和D-乳酸生產(chǎn)情況。圖9B為發(fā)酵所產(chǎn)D-乳酸的光學(xué)純度。
[0031] 發(fā)明詳述
[0032] 除非另有說明，所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本領(lǐng)域所知的常見含義。所有專利、專 利申請(qǐng)、公開出版物、序列、以及其他公開材料均援引加入本文，除非另有說明。
[0033] -方面，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其中含有突變的IdhA基因。
[0034] 如本文所用，術(shù)語"經(jīng)工程化改造的重組大腸桿菌"、"工程化的大腸桿菌"和"重 組大腸桿菌"可互換使用，均是指經(jīng)過修飾的大腸桿菌，其中所述的修飾可以是，例如，基因 表達(dá)的增強(qiáng)、基因表達(dá)的抑制、引入新的基因、引入突變的基因或者對(duì)基因進(jìn)行突變等，其 中可以通過本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的增強(qiáng)或基因表達(dá)的抑制，例如基因的敲 除、改變基因的拷貝數(shù)、引入質(zhì)粒、改變基因的啟動(dòng)子（例如使用強(qiáng)啟動(dòng)子或弱啟動(dòng)子）等。
[0035] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌含有突 變的IdhA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列中的R282的位置 上含有修飾，對(duì)應(yīng)的位置是通過與SEQ ID No. :1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，所述大腸桿菌中所述突變的IdhA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或所述突變的IdhA所編 碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0036] 如本文所用，術(shù)語"突變"具有本領(lǐng)域內(nèi)常用的含義，是指在核苷酸序列中插入、添 力口、缺失、或者取代一或多個(gè)核苷酸，或者是指在多肽序列中插入、添加、缺失、或者取代一 或多個(gè)氨基酸。
[0037] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌含有突 變的IdhA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列中的R282的位 置上含有修飾，其中在對(duì)應(yīng)于R282的位置上的修飾是用C置換R，對(duì)應(yīng)的位置是通過與SEQ ID No. :1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌含有突 變的IdhA基因，其中所述突變的IdhA基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. :2所示核苷酸序列中的 C844的位置上含有突變，對(duì)應(yīng)的位置是通過與SEQ ID No. : 2進(jìn)行序列比對(duì)而確定的。在一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述大腸桿菌中所述突變的IdhA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或所述突變 的IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0039] IdhA 基因 （GenBank No:ACA77176. 1)編碼 D-乳酸脫氫酶（D-Iactate dehydrogenase) (EC No: I. 1. 1.28)的基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所使用的初始大 腸桿菌菌株中的野生型IdhA基因的核苷酸序列如SEQ ID No. :2所示，其所編碼的多肽的 氨基酸序列如SEQ ID No. :1所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中所包含的突變 的IdhA基因含有對(duì)應(yīng)于如下突變：C844T(參見圖6A)，所述突變的基因含有SEQ ID No. : 4 所示的序列；而所述突變的IdhA基因所編碼的多肽具有對(duì)應(yīng)于如下突變的氨基酸置換： R282C(參見圖6B)，所述突變的多肽含有SEQ ID No. :3所示的序列。
[0040] 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到不同大腸桿菌菌株的IdhA基因序列可能與SEQ ID No. :2所示IdhA基因序列不完全等同，以及不同大腸桿菌菌株的IdhA基因所編碼的多肽序 列可能與SEQ ID No. :1所示的多肽序列不完全等同。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述突 變的IdhA基因中的突變位于對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 2的第844位的位置上。在本發(fā)明的某些 實(shí)施方案中，所述突變的IdhA基因所編碼的多肽中的置換位于對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. :1的第 282位的位置上。
[0041] 在本發(fā)明中，"對(duì)應(yīng)于" SEQ ID No. :1或SEQ ID No. : 2中某一特定位置的位置可 以通過序列比對(duì)而確定，包括如使用人工排列對(duì)比及通過使用眾多可利用的排列對(duì)比程序 (例如BLASTP)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法。通過對(duì)比多肽或核苷酸序列，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以在適當(dāng)?shù)奈恢靡胂鄳?yīng)的突變，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果。另外，本領(lǐng)域技 術(shù)人員也可以使用保守和類似的氨基酸殘基來置換相應(yīng)位置上的氨基酸殘基，或者在IdhA 基因序列中引入同義突變，而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果。
[0042] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述大腸桿菌中所述突變的IdhA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和 /或所述突變的IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0043] 如本文所用，術(shù)語"基因表達(dá)增強(qiáng)"，其具有本領(lǐng)域內(nèi)熟知的含義，是指基因表達(dá)強(qiáng) 度的增強(qiáng)，并導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的mRNA數(shù)量的增加?；虮磉_(dá)增強(qiáng)可以通過如下方式 實(shí)現(xiàn)，例如但不限于：在基因前引入強(qiáng)啟動(dòng)子、增加基因的拷貝數(shù)、或者增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性 等。如本文所用，術(shù)語"基因所編碼的蛋白活性增強(qiáng)"具有本領(lǐng)域內(nèi)熟知的含義，是指基因 轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生的蛋白活性的增加。其可以例如通過基因表達(dá)強(qiáng)度的增強(qiáng)、增加酶在細(xì)胞 中的含量、氨基酸位點(diǎn)的突變來實(shí)現(xiàn)。實(shí)現(xiàn)"基因的表達(dá)增強(qiáng)"以及"基因所編碼的蛋白質(zhì) 的活性增強(qiáng)"的各種技術(shù)手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
[0044] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中含有突變的IdhA基因，并且所述突變的 IdhA基因位于質(zhì)粒中。
[0045] 如本文所用，術(shù)語"質(zhì)粒"具有本領(lǐng)域熟知的定義，其是以附加體形式存在于細(xì) 胞中的非染色體DNA并且能夠自主復(fù)制的DNA分子。本發(fā)明中可以使用的質(zhì)粒例如有： pEASY-Blunt、pEASY_Blunt Simple 和 pKD46 等。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中含有突變的IdhA基因，并且所述突變的 IdhA基因位于染色體中。
[0047] 如本文所用，術(shù)語"染色體"具有本領(lǐng)域熟知的定義。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所 涉及的經(jīng)修飾的基因位于染色體中。將經(jīng)修飾的基因整合至染色體的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的，例如可以參見 Michael R. Green 和 Joseph Sambrook 的〃Molecular Cloning:A Laboratory Manual"（Fourth Edition)。
[0048] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含選自如下一或多種修飾：pflB基因表 達(dá)的抑制、和/或PflB基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；frdABCD基因簇表達(dá)的抑制、和/ 或frdABCD基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
[0049] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含選自如下的修飾：mgsA基因表達(dá)的 抑制、和/或mgsA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
[0050] 在本發(fā)明中，pf IB基因 （GenBank No: ACA78322. 1)編碼丙酮酸甲酸裂解酶 (EC No:2. 3. 1.54)。frdABCD基因簇編碼富馬酸還原酶（EC No: 1.3. 5.4)，包括frdA基 因 （GenBank N〇:ACA79460.1)編碼富馬酸還原酶黃素蛋白亞基、frdB基因 （GenBank No:ACA79461. 1)編碼富馬酸還原酶黃素蛋白亞基、frdC基因 （GenBank No:ACA79462. 1)編 碼富馬酸還原酶C亞基、和frdD基因 （GenBank No:ACA79463. 1)編碼富馬酸還原酶D亞基。 mgsA 基因 （GenBank No:ACA78263. 1)編碼甲基乙二醛合成酶（EC Νο:4· 2. 3. 3)。
[0051] 如本文所用，術(shù)語"基因表達(dá)的抑制"具有本領(lǐng)域內(nèi)熟知的含義，是指基因表達(dá)強(qiáng) 度的降低，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的mRNA數(shù)量的減少?；虮磉_(dá)的抑制可以通過如下方 式實(shí)現(xiàn)，例如但不限于：基因的敲除、減少基因的拷貝數(shù)、改變基因的啟動(dòng)子（例如使用弱 啟動(dòng)子）等。如本文所用，術(shù)語"基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制"具有本領(lǐng)域內(nèi)熟知的含 義，是指基因轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生的蛋白活性的降低。其可以例如通過基因表達(dá)強(qiáng)度的降低、基 因中核苷酸的插入或缺失、氨基酸位點(diǎn)的突變來實(shí)現(xiàn)。實(shí)現(xiàn)"基因表達(dá)的抑制"以及"基因 所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制"的各種技術(shù)手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌是以保藏號(hào)CGMCC7678保藏于CGMCC的菌 株。
[0053] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌是以保藏號(hào)CGMCC7679保藏于CGMCC的菌 株。
[0054] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌是以保藏號(hào)CGMCC7871保藏于CGMCC的菌 株。
[0055] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的大腸桿菌是用于生產(chǎn)D-乳酸的大腸桿菌。
[0056] 用于生產(chǎn)D-乳酸的大腸桿菌是指具有生產(chǎn)D-乳酸所必需的常規(guī)遺傳背景的大腸 桿菌，用于生產(chǎn)D-乳酸所必需的遺傳背景是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
[0057] 在第二方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)乳酸的方法，其中包括培養(yǎng)本發(fā)明的大腸桿 菌的步驟。
[0058] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明生產(chǎn)乳酸的方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的大腸桿菌，以及任 選的收集或者純化乳酸。
[0059] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的"培養(yǎng)"包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)。
[0060] 如本文所用，術(shù)語"種子培養(yǎng)"是指將用于發(fā)酵的菌種在固體培養(yǎng)基上活化后，再 經(jīng)過搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種的過程。
[0061] 如本文所用，術(shù)語"發(fā)酵培養(yǎng)"是指利用微生物菌種，在適宜的條件下，將培養(yǎng)基組 分經(jīng)過特定的代謝途徑轉(zhuǎn)化為某些特定產(chǎn)物的過程。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的生產(chǎn)乳 酸的方法包括在高溫下（42-50°C )進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的步驟，例如42-43°C、43-44°C、44-45°C、 45-46 °C、46-47 °C、47-48 °C、48-49 °C、或 49-50 °C。
[0062] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中包括將本發(fā)明的大腸桿菌厭氧發(fā)酵。
[0063] 如本文所用，術(shù)語"厭氧發(fā)酵"是指利用厭氧發(fā)酵菌株，在隔絕空氣的條件下，經(jīng)特 定代謝途徑將培養(yǎng)基組分轉(zhuǎn)化為某些特定產(chǎn)物的過程。
[0064] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中的培養(yǎng)過程不進(jìn)行任何通氣步驟。
[0065] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)的方法包括以下步驟：
[0066] (1)將本發(fā)明的重組大腸桿菌接種于種子培養(yǎng)基，在適宜大腸桿菌生長(zhǎng)的條件下 培養(yǎng)一段時(shí)間得到種子液；
[0067] (2)將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在厭氧條件下發(fā)酵。
[0068] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明生產(chǎn)乳酸的方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)pH值的 步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明生產(chǎn)乳酸的方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)PH的步驟， 其中將pH值調(diào)節(jié)至：6. 0-8. 0,例如6. 0-6. 5、6. 5-7. 0、7. 0-7. 5和7. 5-8. 0。在一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明生產(chǎn)乳酸的方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)過程中使用氨水或氫氧化鈉作為中和劑來 調(diào)節(jié)pH值的步驟。
[0069] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)的方法包括以下步驟：
[0070] (1)將本發(fā)明的重組大腸桿菌接種于種子培養(yǎng)基，在適宜大腸桿菌生長(zhǎng)的條件下 培養(yǎng)一段時(shí)間得到種子液；
[0071] (2)將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在厭氧條件下培養(yǎng)，并在發(fā)酵過程中使用氨水或 氫氧化鈉作為中和劑來調(diào)節(jié)pH值。
[0072] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)的方法包括以下步驟：
[0073] (1)將本發(fā)明的重組大腸桿菌接種于種子培養(yǎng)基，在適宜大腸桿菌生長(zhǎng)的條件下 培養(yǎng)一段時(shí)間得到種子液；
[0074] (2)將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在厭氧條件下進(jìn)行發(fā)酵，并在發(fā)酵過程中使用氨 水或氫氧化鈉作為中和劑來將pH值調(diào)節(jié)至6. 0-8. 0。
[0075] 本發(fā)明的方法中可以使用本領(lǐng)域中常規(guī)用于培養(yǎng)大腸桿菌的各種培養(yǎng)條件，例如 培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和是否搖動(dòng)以及搖動(dòng)速度等。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要可以選 擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。本發(fā)明的方法中所使用的培養(yǎng)條件以及發(fā)酵條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟 知的（諸葛健等，1994,工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)，中國(guó)輕工業(yè)出版社）。
[0076] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于：溫度為30_50°C，例如 30-31 °C、31-32 °C、32-33 °C、33-34 °C、34-35 °C、35-36 °C、36-37 °C、37-38 °C、38-39 °C、 39-40 °C、40-41 °C、41-42 °C、42-43 °C、43-44 °C、44-45 °C、45-46 °C、46-47 °C、47-48 °C、 48-49 °C、或 49-50 °C。
[0077] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于：種子培養(yǎng)的時(shí)間為6-16小 時(shí),例如6-7小時(shí)、7-8小時(shí)、8-9小時(shí)、9-10小時(shí)、10-11小時(shí)、11-12小時(shí)、12-13小時(shí)、13-14 小時(shí)、14-15小時(shí)、或15-16小時(shí)。
[0078] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于：發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為1-5天， 例如1天、2天、3天、4天、或5天。
[0079] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于：將本發(fā)明的重組大腸桿菌 按照0. 1-10%(V/V)的接種量接種于種子培養(yǎng)基，例如0. 1%、0. 5%、1%、2. 5%、5%、或10%。
[0080] 在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于：將種子液按照終濃度 OD55tl=O. 01-0. 5 的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，例如 OD55tl 為 0· 01-0. 05、0· 05-0. 1、0· 1-0. 2、 0· 2_0· 3、0· 3_0· 4 或 0· 4_0· 5。
[0081] 在一實(shí)施方案中，可以使用常用于大腸桿菌的培養(yǎng)基。用于本發(fā)明的大腸桿菌的 培養(yǎng)基可以包括合適的氮源，例如有機(jī)含氮化合物或無機(jī)含氮化合物或其混合物。在一實(shí) 施方案中，所述有機(jī)含氮化合物例如選自豆餅粉、花生餅粉、牛肉膏、魚粉、酵母膏、蛋白 胨、玉米漿中的一種或任意幾種的混合物，所述無機(jī)含氮化合物選自硝酸鹽（如硝酸鈉、硝 酸鉀、硝酸鈣），銨鹽（如磷酸銨、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨）中的一種或任意幾種的混合物。 在一實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的大腸桿菌的培養(yǎng)基可以包括合適的碳源，例如選自葡萄糖、 淀粉、淀粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麥芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮 酸、和富馬酸中的一種或任意幾種的混合物。
[0082] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中所使用的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成 分組成（溶劑為水） ：
[0083] 大量元素：葡萄糖、NH4H2P04、（NH4) 2HP04、MgSO4 · 7H20、和甜菜堿-HCl ;
[0084] 微量元素：FeCl3 · 6H20、CoCl2 · 6H20、CuCl2 · 2H20、ZnCl2、Na2MoO4 · 2H20、 MnCl2 · 4H202、和 H3BO3。
[0085] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基由以下成分組成（溶劑為水）：
[0086] 大量元素：葡萄糖 20-140g/L，NH4H2PO4O. 5-1. 5g/L、（NH4) 2HP042-5g/L、 MgSO4 · 7Η200· 1-0. 3g/L、以及甜菜堿-HC10. 1-lg/L ;
[0087] 微量元素：FeCl3 · 6Η201-5 μ g/L、CoCl2 · 6Η200· 05-1 μ g/L、CuCl2 · 2Η200· 05-1 μ g/ L、ZnCl2O. 05-1 μ g/L、Na2MoO4 · 2Η200· 05-1 μ g/L、MnCl2 · 4Η2020· H μ g/ L, H3BO3O. 01-0. 5 μ g/L〇
[0088] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)的具體方法如下：
[0089] 將菌株厭氧發(fā)酵，包括以下步驟：
[0090] (1)種子培養(yǎng)：將1/3-1/2體積的種子培養(yǎng)基置于三角瓶中，高溫高壓滅菌。冷 卻后將本發(fā)明的重組大腸桿菌按照〇. 1-10%(V/V)的接種量接種于種子培養(yǎng)基，在37°C或 42°C以及搖動(dòng)的條件下培養(yǎng)6-16小時(shí)得到種子液，用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種；
[0091] (2)發(fā)酵培養(yǎng)：將1/3-1/2體積的發(fā)酵培養(yǎng)基體積置于厭氧發(fā)酵罐中，將種子液按 照終濃度OD 55tl=O. 01-0. 5的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C或42°C培養(yǎng)1-5天，得到發(fā)酵 液。
[0092] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明生產(chǎn)乳酸的方法中還包括從發(fā)酵液中提取和/或純化 乳酸的步驟。
[0093] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括如下步驟：
[0094] (1)發(fā)酵培養(yǎng)本發(fā)明的大腸桿菌；和
[0095] (2)收獲產(chǎn)生的D-乳酸；任選地分離或純化所述D-乳酸。
[0096] 在第三方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的大腸桿菌在生產(chǎn)乳酸中的用途。 實(shí)施例
[0097] 本發(fā)明通過下述實(shí)施例進(jìn)一步闡明，但任何實(shí)施例或其組合不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā) 明的范圍或?qū)嵤┓绞降南拗?。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定，結(jié)合本說明書和本領(lǐng) 域一般常識(shí)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以清楚地明白權(quán)利要求書所限定的范圍。在不偏離本 發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行任何修改或改 變，這種修改和改變也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0098] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所 用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0099] 本發(fā)明包括如下實(shí)施例：
[0100] 實(shí)施例1、重纟目大腸桿菌Dlac-006的構(gòu)律
[0101] 重組大腸桿菌Dlac-006的構(gòu)建（表1)，分為以下3個(gè)步驟：
[0102] (1)丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因 PflB的敲除
[0103] (1-1):首先構(gòu)建質(zhì)粒pXZ-CS，用于基因敲除、基因表達(dá)調(diào)控和外源基因整合。
[0104] 質(zhì)粒構(gòu)建操作步驟共四步：
[0105] 第一步，以 pACYC184 質(zhì)粒 DNA (Mok et al.，1991，Nucleic Acids Resl9:2321-2323)為模板，使用引物 184-cat-up(SEQ ID No. :5)和 184-cat-down(SEQ ID No. :6)，擴(kuò)增得到氯霉素抗性基因，基因片段大小為994bp，包含有氯霉素基因啟動(dòng)子序列， 稱為片段I。
[0106] 擴(kuò)增體系為：NewEngland Biolabs Phusion5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP 各 IOmM) 1 μ 1、DNA 模板 20ng、引物（ΙΟμΜ)各 2μ1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶 (2. 5U/μ 1)0. 5 μ 1、蒸餾水 33. 5 μ 1，總體積為 50 μ 1。
[0107] 擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘（1個(gè)循環(huán)）；98°C變性10秒、56°C退火10秒、72°C 延伸30秒（30個(gè)循環(huán)）；72 °C延伸5分鐘（1個(gè)循環(huán)）。
[0108] 第二步，以芽抱桿菌Bacillus subtilis sp subtilisl68的染色體DNA(該菌購(gòu) 自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，CGMCC No. 1. 1390)為模板，使用引物Bs-sacB-up(SEQ ID No. :7)和Bs-sacB_down(SEQ ID No. :8)進(jìn)行PCR擴(kuò)增果聚糖鹿糖轉(zhuǎn)移酶基因（sacB)，基 因片段大小為1618bp，含有sacB基因啟動(dòng)子序列，稱為片段II。擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參見 上文第一步。
[0109] 第三步，將第一步得到的片段I和第二步得到的片段II分別用限制性內(nèi)切酶 SacKNEB公司）在37°C酶切30分鐘；PCR純化試劑盒清洗（Gel/PCR Extration Kit，購(gòu) 自BioMIGA生物技術(shù)有限公司）；各取20ng片段I和片段II，加入1 μ 110XT4連接緩沖液 (ΝΕΒ公司）、1 μ I T4-DNA連接酶（ΝΕΒ公司），補(bǔ)充蒸餾水至10 μ 1，25°C反應(yīng)5分鐘；以酶 連片段為底物，取1 μ 1，用引物184-cat-up和Bs-sacB-down進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和擴(kuò) 增條件參見上文第一步，得到含有cat-sacB的連接片段III。
[0110] 第四步，將經(jīng)所述PCR所獲得的片段III取1μ 1，加入1μ I pEASY-blunt simple 載體（試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司），25°C反應(yīng)15分鐘；氯化鈣轉(zhuǎn)化法：加入 50 μ I TranslO感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司）中進(jìn)行，冰浴30分鐘。 42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250μ I LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育1小時(shí)。 取200 μ 1菌液涂在含有氨芐霉素（終濃度為100 μ g/ml)和氯霉素（終濃度為34 μ g/ml) 的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽性單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，引物為M13-F(SEQ ID No. :9)/M13-R(SEQ ID No. :10)。送樣測(cè)序分析，結(jié)果正確的為陽性克隆，得到質(zhì)粒 pXZ-CS (表 3)。
[0111] (1-2):從大腸桿菌ATCC8739 (Gunsalus et al.，1941，J Biol ChemHl: 853-858) 出發(fā)，采用兩步同源重組的方法敲除PflB基因，獲得重組大腸桿菌Dlac-002,包括以下六 1 K 少：
[0112] 第一步，以大腸桿菌ATCC8739基因組DNA為模板，使用引物XZ-pflB-up(SEQ ID No. :11)和 XZ-pflB-down(SEQ ID No. :12)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物為 2260bp，該 PCR 產(chǎn)物 包含大腸桿菌ATCC8739的丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因 pflB(GenBank No:ACA78322. 1)及 其上下游各大約400個(gè)堿基。擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參考實(shí)施例上文U二11中的第一步。
[0113] 將擴(kuò)增得到的2260bp PCR產(chǎn)物克隆到pEASY-Blunt克隆載體（購(gòu)自北京全式金 生物技術(shù)有限公司）上?？寺◇w系及氯化鈣轉(zhuǎn)化法參見上文(1-1)中質(zhì)粒ρΧΖ-CS構(gòu)建方 法中的第四步。取200 μ 1菌液涂在含有卡那霉素（終濃度為50 μ g/ml)的LB平板上，過 夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽性單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，引物為M13-F/M13-R。送樣測(cè)序分析， 結(jié)果正確的為陽性克隆，將得到的重組質(zhì)粒命名為pXZO 14。
[0114] 第二步，以 pXZ014 質(zhì)粒 DNA 為模板，使用引物 XZ-pflB-l(SEQ ID No. : 13)和 XZ-pflB-2(SEQ ID No. : 14)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到4828bp的PCR產(chǎn)物，該P(yáng)CR產(chǎn)物包含 pEASY-Blunt載體和丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因上下游各約400個(gè)堿基。擴(kuò)增體系和擴(kuò)增 條件參考實(shí)施例上文（1二11中的第一步。
[0115] 第三步，將含有氯霉素基因（cat)和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因（sacB)DNA片段 cat-sacB連接至第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，具體如下：
[0116] 以 pXZ-CS 為模板，使用引物 cat-sacB-up (SEQ ID No. : 15)和 cat-sacB-down (SEQ ID No. :16)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2618bp的PCR產(chǎn)物，即為含有氯霉素基因（cat)和果聚糖 蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因（sacB)的DNA片段。
[0117] 連接體系為：10ng的第二步4828bp的PCR產(chǎn)物、30ng的cat-sacB DNA片段， 2 μ IlOXT4連接緩沖液（NEB 公司），1μ1 T4 連接酶（NEB 公司，400,000 cohesive end units/ml)，補(bǔ)充蒸饋水至20 μ 1。室溫連接2小時(shí)。取IOul用氯化I丐轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入TranslO， 過程參見上文（1二11中質(zhì)粒pXZ-CS構(gòu)建方法中的第四步。取200 μ 1菌液涂在含有氯霉素 (終濃度為34ug/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽性單菌落，將陽性克隆進(jìn)行液體 培養(yǎng)，提取陽性克隆質(zhì)粒（將cat-sacB DNA片段克隆到pXZ014中的質(zhì)粒）進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證， 測(cè)序結(jié)果在上述第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上連接了 cat-sacB DNA片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確， 將得到的重組質(zhì)粒命名為PXZ015C。
[0118] 第四步，以PXZ015C質(zhì)粒DNA為模板，使用引物XZ-pf ΙΒ-up/XZ-pf IB-down擴(kuò)增出 3515bp DNA片段I。擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參見上文(1_1)中質(zhì)粒dXZ-CS構(gòu)津步驟中的第 一步。DNA片段I包含丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因 pflB上游約400個(gè)堿基、cat-sacB DNA 片段、丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因 PflB下游約400個(gè)堿基。
[0119] 將DNA片段I用于第一次同源重組：首先將pKD46質(zhì)粒（Datsenko and Wanner 2000，Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645;質(zhì)粒購(gòu)買于美國(guó)耶魯大學(xué)CGSC大腸桿菌保 藏中心，CGSC#7739)通過氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ATCC8739,然后將DNA片段I電轉(zhuǎn) 至帶有PKD46的大腸桿菌ATCC8739。
[0120] 電轉(zhuǎn)條件為：首先準(zhǔn)備帶有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌ATCC8739的電轉(zhuǎn)化感受態(tài) 細(xì)胞（Dower et al.，1988，Nucleic Acids Resl6:6127-6145);將 50μ1 感受態(tài)細(xì)胞置 于冰上，加入50ng DNA片段I，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0. 2cm的Bio-Rad電擊杯。使用 MicroPulser (Bio-Rad公司）電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2. 5kv。電擊后迅速將Iml LB培 養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75rpm，30°C孵育2小時(shí)。取200 μ 1菌液 涂在含有氯霉素（終濃度為34ug/ml)的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)單菌落進(jìn)行 PCR驗(yàn)證，使用引物XZ-pf ΙΒ-up/XZ-pf IB-down進(jìn)行驗(yàn)證，挑選一個(gè)正確的單菌落，命名為 Dlac-001。
[0121] 第五步，將第二步得到的4828bp的PCR產(chǎn)物進(jìn)行磷酸化處理，自連接得到的質(zhì)粒 用于第二次同源重組；具體步驟如下：將第二步的4818bp的PCR產(chǎn)物首先用PCR純化試劑 盒清洗（Gel/PCR Extration Kit，購(gòu)自BioMIGA生物技術(shù)有限公司）；取30ng純化后的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2 μ 110XT4連接緩沖液（NEB公司）、1 μ I T4多核苷酸激酶（NEB公司），補(bǔ) 充蒸餾水至20μ 1，37°C反應(yīng)30分鐘；加入1μ I Τ4連接酶（ΝΕΒ公司，400,000粘附末端單 位/ml)，室溫反應(yīng)2小時(shí)得到連接產(chǎn)物。酶連產(chǎn)物取IOul用氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入TranslO， 過程參見上文(1-1)中質(zhì)粒PXZ-CS構(gòu)建步驟中的第四步。取200 μ 1菌液涂在含有卡那霉 素（終濃度為50ug/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽性單菌落，將陽性克隆進(jìn)行 液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果上述第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了 自連，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，得到質(zhì)粒PXZO16。
[0122] 第六步，以pXZ016質(zhì)粒DNA為模板，用引物XZ-pflB-up/XZ-pflB-down擴(kuò)增出 897bp DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重組。將DNA片段II電轉(zhuǎn)至菌株Dlac-001。
[0123] 電轉(zhuǎn)條件為：首先準(zhǔn)備帶有pKD46質(zhì)粒的DlaclOl的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（制備方 法參見Dower et al.，1988);將50 μ 1感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上 放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0. 2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司）電穿孔 儀，電擊參數(shù)為電壓2. 5kv。電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移 至試管中，75轉(zhuǎn)，30°C孵育4小時(shí)。將菌液轉(zhuǎn)移至含有10%蔗糖的沒有氯化鈉的LB液體培 養(yǎng)基（250ml燒瓶中裝50ml培養(yǎng)基），培養(yǎng)24小時(shí)后在含有6%蔗糖的沒有氯化鈉的LB固 體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。經(jīng)過PCR驗(yàn)證，所用引物為XZ-pflB-up/XZ-pflB-down，正確的菌落 擴(kuò)增產(chǎn)物為897bp的片段，挑選一個(gè)正確的單菌落，將其命名為Dlac-002(表1)。
[0124] 敲除pf IB基因所構(gòu)建的質(zhì)粒見表3,使用的引物序列見表2。
[0125] (2)富馬酸還原酶編碼基因 frdAB⑶的敲除
[0126] 從重組大腸桿菌Dlac-002出發(fā)，使用和實(shí)施例1(1-2)相同的方法敲除富馬酸還 原酶編碼基因 frdABCD(frdA GenBank N〇:ACA79460. l，frdB GenBank No:ACA79461. l，frdC GenBank No:ACA79462. l，frdD GenBank No:ACA79463. I)，得到重組大腸桿菌Dlac-004。構(gòu) 建的質(zhì)粒見表3,使用的引物序列見表2。其中引物的命名對(duì)應(yīng)于敲除pflB基因過程中所 使用的引物的名稱，僅分別將PflB替換為frdB或frdC。
[0127] (3)甲基乙二醛合成酶基因 mgsA的敲除
[0128] 從重組大腸桿菌Dlac-004出發(fā)，使用和實(shí)施例1(1-2)相同的方法敲除甲基乙二 醛合成酶mgsA基因 （GenBank No:ACA78263. 1)，得到重組大腸桿菌Dlac-006。構(gòu)建的質(zhì)粒 見表3,使用的引物序列見表2。其中引物的命名對(duì)應(yīng)于敲除pflB基因過程中所使用的引 物的名稱，僅分別將PflB替換為mgsA。
[0129] 表1、生產(chǎn)乳酸的重組大腸桿菌
[0130]
【權(quán)利要求】
1. 一種重組大腸桿菌，其含有如下修飾： pflB基因表達(dá)的抑制、和/或pflB基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；和 frdABCD基因簇表達(dá)的抑制、和/或frdABCD基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制， 其中所述大腸桿菌還含有突變的ldhA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. :1 所示氨基酸序列中的R282的位置上含有修飾，任選地，所述大腸桿菌中所述突變的ldhA基 因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或所述突變的ldhA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
2. 權(quán)利要求1的大腸桿菌，其中在對(duì)應(yīng)于R282的位置上的修飾是用C置換R。
3. 權(quán)利要求1的大腸桿菌，其中所述突變的ldhA基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 2所示核 苷酸序列中的C844的位置上含有突變。
4. 權(quán)利要求3的大腸桿菌，其中所述突變是用T置換C。
5. 權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的大腸桿菌，其中所述突變的ldhA基因位于質(zhì)?；蛉旧w中。
6. 權(quán)利要求5的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌以保藏號(hào)CGMCC7871保藏于CGMCC。
7. 權(quán)利要求5的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中還含有如下修飾： mgsA基因表達(dá)的抑制、和/或mgsA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
8. 權(quán)利要求7的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌以保藏號(hào)CGMCC7678保藏于CGMCC。
9. 權(quán)利要求7的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌以保藏號(hào)CGMCC7679保藏于CGMCC。
10. 權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的大腸桿菌，其用于生產(chǎn)D-乳酸。
11. 生產(chǎn)D-乳酸的方法，所述方法包括： (1) 發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的大腸桿菌；和 (2) 收獲產(chǎn)生的D-乳酸；任選地分離或純化所述D-乳酸。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中在步驟⑴中包括使用中和劑調(diào)節(jié)pH值，所述中和劑選 自氨水和氫氧化鈉。
13. 權(quán)利要求11的方法，其中在步驟（1)中的發(fā)酵過程于高溫下進(jìn)行，所述高溫是指 42-50。。。
14. 權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的大腸桿菌在生產(chǎn)D-乳酸中的用途。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK104278003SQ201310293659
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月12日
【發(fā)明者】馬延和, 張學(xué)禮, 徐洪濤, 朱欣娜, 劉萍萍, 唐金磊 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所