生產(chǎn)丁二酸的重組大腸桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過(guò)大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)丁二酸的經(jīng)工程化的重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌含有如下的一或多種修飾：a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因的活性增強(qiáng)，b)sthA基因的活性增強(qiáng),和c)突變的lpdA基因。本發(fā)明還涉及使用所述經(jīng)工程化的重組大腸桿菌用于生產(chǎn)丁二酸的用途，以及使用所述經(jīng)工程化的重組大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸的方法。
【專利說(shuō)明】生產(chǎn)丁二酸的重組大腸桿菌及其應(yīng)用發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及通過(guò)大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)丁二酸的經(jīng)工程化的重組大腸桿菌。本發(fā)明還涉及使用所述經(jīng)工程化的重組大腸桿菌用于生產(chǎn)丁二酸的用途，及使用所述經(jīng)工程化的重組大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸的方法。
發(fā)明背景
[0002]丁二酸又稱作琥珀酸，是一種優(yōu)秀的平臺(tái)化合物，在化工、材料、醫(yī)藥、食品領(lǐng)域有著廣泛的用途，被美國(guó)能源部列為未來(lái)12種最有價(jià)值的平臺(tái)化合物之一(McKinlay etal.2007, Appl Microb1l B1technol76:727-740)。丁二酸目前主要應(yīng)用于酯化溶劑、除冰裝置、發(fā)動(dòng)機(jī)冷卻劑、食品香精、水處理化學(xué)品等。丁二酸還可以用于生產(chǎn)很多下游產(chǎn)品，如1，4-丁二醇、四氫呋喃、Y-丁內(nèi)酯、N-甲基吡咯烷酮、2-吡喏烷酮。另外，丁二酸和1，4-丁二醇聚合能得到PBS (聚丁二酸丁二醇酯)塑料，其是一種性能優(yōu)良的生物全降解塑料。據(jù)估計(jì)丁二酸未來(lái)的市場(chǎng)潛力每年將超過(guò)270萬(wàn)噸。大約有250種可以用苯為原料生產(chǎn)的化工產(chǎn)品都可以通過(guò)丁二酸為原料生產(chǎn)(McKinlay et al.2007, Appl Microb1lB1technoI76:727-740)。
[0003]目前丁二酸的生產(chǎn)主要是基于順酐為原料的石油化工路線。石油價(jià)格近年來(lái)波動(dòng)很大，這嚴(yán)重制約了丁二酸生產(chǎn)的可持續(xù)性和價(jià)格穩(wěn)定。另一方面，化學(xué)合成法工藝復(fù)雜且常需高溫高壓，這大大增加了生產(chǎn)所需的能耗物耗；同時(shí)化學(xué)合成還會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。開(kāi)發(fā)丁二酸的高效生物制造技術(shù)能從根本上解決石油化工路線的弊端:保證丁二酸價(jià)格穩(wěn)定不受制于石油價(jià)格波動(dòng)，降低PBS塑料的制造成本，促進(jìn)其進(jìn)一步的推廣應(yīng)用；實(shí)現(xiàn)綠色可持續(xù)生產(chǎn)、簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝、節(jié)能減排、減少環(huán)境污染。另外，丁二酸的生物制造過(guò)程中還可以吸收二氧化碳，對(duì)實(shí)現(xiàn)低碳經(jīng)濟(jì)具有很好的促進(jìn)作用。丁二酸生物制造技術(shù)的核心就是能夠?qū)⑸镔|(zhì)原料高效轉(zhuǎn)化為丁二酸的微生物菌株。
[0004]目前丁二酸發(fā)酵菌種主要有兩大類。第一類是天然產(chǎn)丁二酸菌，主要有產(chǎn)丁二酸放線桿菌(Actinobacillus succinogens) (Guettler et al.1996, US PatentN0.5504004)> 產(chǎn)丁二酸厭氧螺菌(Anaerob1spirillum succiniciproducens)(Glassner and Dattal992, US Patent N0.5143834)、產(chǎn)丁二酸曼海姆菌(Mannheimiasucciniciproducens) (Lee et al.2002, Appl Microb1l B1technol58:663-668)和巴斯夫玻拍菌(Basfia succiniciproducens) (Scholten et al.2009, B1technolLett31:1947-1951)。另一類是通過(guò)代謝工程改造的工程菌，主要是大腸桿菌。
[0005]天然產(chǎn)丁二酸菌雖然能夠高產(chǎn)丁二酸，但其自有很多缺陷。發(fā)酵過(guò)程中，糖酸轉(zhuǎn)化率低，有相當(dāng)一部分碳源流入到其他有機(jī)酸的合成。另外，天然產(chǎn)丁二酸菌發(fā)酵過(guò)程中需要豐富培養(yǎng)基，提高了生產(chǎn)成本和下游分離純化成本，限制了其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。大腸桿菌在糖發(fā)酵過(guò)程中雖然只積累少量的丁二酸，但由于其生理遺傳背景都很清晰，易于改造，因此很多研究單位都選取大腸桿菌作為出發(fā)菌種，將其改造成高產(chǎn)丁二酸的工程菌。
[0006]磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是丁二酸合成途徑的關(guān)鍵前體。將PEP羧化成草酰乙酸(OAA)是丁二酸合成途徑的關(guān)鍵步驟。Millard等人通過(guò)過(guò)表達(dá)大腸桿菌的PEP羧化酶基因 ppc,將丁二酸的產(chǎn)量提高了 3.5 倍(Millard et al., 1996, Appl EnvironMicrob1l62:1808-1810)。Kim等人發(fā)現(xiàn)在野生型大腸桿菌中過(guò)表達(dá)PEP羧化激酶基因pck,對(duì)丁二酸生產(chǎn)沒(méi)有影響，但在敲除了 ppc基因的大腸桿菌中過(guò)表達(dá)pck基因，能將丁二酸的產(chǎn)量提高 6.5 倍(Kim et al.，2004，Appl Environ Microb1l70:1238-1241)。韓國(guó)Kwon等人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵液中含有高濃度碳酸氫根離子時(shí)，在野生型大腸桿菌中過(guò)表達(dá)pck基因，能將丁二酸的產(chǎn)量提高2.2倍(Kwon et al., 2006, J Microb1lB1technoll6:1448 - 1452)。
[0007]Chatterjee等人通過(guò)在大腸桿菌中敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB和乳酸脫氫酶基因ldhA，構(gòu)建了工程菌NZN111。該菌株不能以葡萄糖為碳源發(fā)酵生長(zhǎng)，但可以以乳糖、果糖、甘露糖和海藻糖等為碳源發(fā)酵生成丁二酸、乙酸和乙醇。在此基礎(chǔ)上篩選出能夠重新利用葡萄糖為碳源發(fā)酵生長(zhǎng)的突變菌株AFPlll (Chatterjeeet al.，2001，Appl Environ Microb1167:148-154;Donnelly et al.，1998，ApplB1chem B1technol70_72:187-198)。Vemuri 等人通過(guò)在 AFPlll 中高表達(dá)埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)的丙酮酸羧化酶基因pyc,進(jìn)一步提高了丁二酸的產(chǎn)量。在兩步法培養(yǎng)(先好氧培養(yǎng)，然后厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸)條件下，丁二酸的最終濃度可達(dá)到99.2g/L (841mM),糖酸轉(zhuǎn)化率為 1.lg/g (1.68mol/mol) (Vemuri et al., 2002, J Ind Microb1lB1technol28:325-332)。
[0008]Sanchez等人通過(guò)敲除醇脫氫酶基因adhE、IdhA、乙酸激酶基因ackA、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因pta、異檸檬酸裂解酶調(diào)控蛋白基因iclR，構(gòu)建出工程菌SBS550MG。在兩步法培養(yǎng)(先好氧培養(yǎng)，然后厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸)條件下，可以生產(chǎn)40g/L(339mM)的丁二酸，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到 1.06g/g (1.61mol/mol) (Sanchez et al., 2005, Metab Eng7:229-239)。
[0009] Vemuri等人和Sanchez等人構(gòu)建出的重組大腸桿菌雖然能生產(chǎn)高濃度的丁二酸，但仍有一些缺陷。發(fā)酵過(guò)程采用的是兩步發(fā)酵，即先采用好氧過(guò)程將細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)起來(lái)，再轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬踹^(guò)程進(jìn)行發(fā)酵。這種工藝操作復(fù)雜，而且好氧工藝會(huì)大大提高設(shè)備的構(gòu)建和運(yùn)行成本。這些重組大腸桿菌都需要使用豐富培養(yǎng)基，這將極大地提高發(fā)酵的原料成本，并導(dǎo)致計(jì)算的轉(zhuǎn)化率偏高。
[0010]Jantama等人通過(guò)敲除ldhA、adhE、甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因focA、pflB、ackA、甲基乙二醛合成酶基因mgsA、丙酮酸氧化酶基因poxB，并經(jīng)過(guò)進(jìn)化代謝，構(gòu)建出重組大腸桿菌KJ073。使用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，在厭氧條件下可以生產(chǎn)79g/L(668mM)的丁二酸，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到 0.79g/g (1.2mol/mol) (Jantama et al., PCT/US2008/057439; Jantama etal., 2008a, B1technol B1eng99:1140-1153)。進(jìn)一步敲除丙酸激酶基因 tdcD、2_ 酮基丁酸甲酸裂解酶/丙酮酸甲酸裂解酶基因tdcE、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因aspC、蘋果酸酶基因sfcA，并經(jīng)過(guò)進(jìn)化代謝，構(gòu)建出重組大腸桿菌KJ122。使用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，在厭氧條件下可以生產(chǎn) 80g/L(680mM)的丁二酸,糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到 0.89g/g(l.36mol/mol) (Jantamaetal., PCT/US2008/057439; Jantama et al., 2008b, B1technol B1englOl: 881-893)。上述的兩個(gè)重組大腸桿菌都是經(jīng)過(guò)進(jìn)化代謝提高了丁二酸的生產(chǎn)能力。Zhang等人還通過(guò)敲除PEP-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的酶I基因ptsl、pflB基因，并增強(qiáng)PEP羧化激酶(PCK)的活性，構(gòu)建出重組大腸桿菌XZ721。使用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，在厭氧條件下可以生產(chǎn)39g/L(327mM)的丁二酸，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到 0.82g/g(l.25mol/mol) (Zhang et al., PCT/US2010/029728; Zhang etal.,2009b, Appl Environ Microb1l75:7807-7813)。
[0011]為了提高大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸的產(chǎn)量和/或轉(zhuǎn)化率，需要進(jìn)一步對(duì)大腸桿菌的代謝途徑進(jìn)行改造。
發(fā)明概述
[0012]一方面，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)丁二酸的重組大腸桿菌。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種重組大腸桿菌，所述大腸桿菌中含有如下修飾:(1)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中所涉及的基因表達(dá)的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制，⑵PflB和/或adhE基因表達(dá)的抑制、和/或PflB和/或adhE基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制，(3)ldhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制，和(4)galP基因和/或外源gif基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或galP基因和/或外源gif基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；其中所述大腸桿菌還含有如下的一或多種修飾:(a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和(b) SthA基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或SthA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)所涉及的基因表達(dá)的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制，其中所述基因是選自如下的一或多種基因:編碼PTS系統(tǒng)酶I的基因ptsl、編碼PTS系統(tǒng)酶Hpr的基因ptsH、編碼PTS系統(tǒng)酶IIAele的基因err和編碼PTS系統(tǒng)酶IICBae的基因ptsG。
[0015]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌的磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達(dá)增強(qiáng)、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)，其中所述基因是選自如下的一或多種基因:編碼轉(zhuǎn)酮醇酶的基因tktA、編碼6-磷酸葡萄糖脫氫酶的基因zwf、編碼6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的基因pgl、編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的基因gnd、編碼5-磷酸核糖異構(gòu)酶的基因rp1、編碼5-磷酸核酮糖差向異構(gòu)酶的基因rpe和編碼轉(zhuǎn)醛醇酶的基因talB。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中SthA基因和tktA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或SthA基因和tktA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的如下位置的位置上含有修飾:T81、P275和A358，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的，其中在對(duì)應(yīng)于T81的位置上的修飾是用I置換T，在對(duì)應(yīng)于P275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對(duì)應(yīng)于A358的位置上的修飾是用V置換A。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，并且所述突變的IpdA基因位于染色體中或者質(zhì)粒中。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中含有如下修飾:(a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和(b) SthA基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或SthA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和(c)突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQIDN0.:1所示氨基酸序列的如下位置的位置上含有修飾:T81、Ρ275和Α358，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的，其中在對(duì)應(yīng)于Τ81的位置上的修飾是用I置換Τ，在對(duì)應(yīng)于Ρ275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對(duì)應(yīng)于Α358的位置上的修飾是用V置換Α。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下的修飾:(5) ackA和pta基因表達(dá)的抑制、和/或ackA和pta基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；(6) aceBA基因簇表達(dá)的增強(qiáng)、和/或aceBA基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；(7)dcuC基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或dcuC基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和(8)mgsA基因表達(dá)的抑制、和/或mgsA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
[0021]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下修飾:(9)pck基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或PCk基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下修飾:(10) adhE基因表達(dá)的抑制、和/或adhE基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；和(11) tdcDE基因簇表達(dá)的抑制、和/或tdcDE基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下的修飾:(12)aceEF基因簇表達(dá)的增強(qiáng)、和/或aceEF基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0024]在第二方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)丁二酸的方法，其中包括培養(yǎng)本發(fā)明的大腸桿菌的步驟。
[0025]在第三方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的大腸桿菌在生產(chǎn)丁二酸中的用途。
附圖簡(jiǎn)述
[0026]圖1:改造大腸桿菌獲得重組菌株NZ-037的示意圖。X代表基因敲除，包括ldhA、pflB、ptsl、ackA-pta基因。四角星代表基因表達(dá)的增強(qiáng),包括galP、pck、aceBA、dcuC基因。
[0027]圖2:NZ-037經(jīng)過(guò)1080代進(jìn)化獲得菌株HX021。
[0028]圖3:HX023經(jīng)過(guò)360代進(jìn)化獲得菌株HX024。
[0029]圖4:HX024在5L發(fā)酵罐水平發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。
[0030]圖5:HX027經(jīng)過(guò)650代進(jìn)化獲得菌株HX028。
[0031]圖6:HX028在5L發(fā)酵罐水平發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。
[0032]圖7:HX024的轉(zhuǎn)錄組分析?；疑娇蚝桶咨娇蛑械臄?shù)字代表HX024基因表達(dá)強(qiáng)度和野生型大腸桿菌ATCC8739的相對(duì)值；縮寫詞:GLC:葡萄糖；G6P:6_磷酸葡萄糖；F6P:6-磷酸果糖；FBP:1，6-二磷酸果糖；GAP:3_磷酸甘油醛；DHAP:磷酸二羥基丙酮；GBP:1，3- 二磷酸甘油酸；G3P:3-磷酸甘油酸；PEP:磷酸烯醇式丙酮酸；0ΑΑ:草酰乙酸；MAL:蘋果酸；FUM:富馬酸；SUC:丁二酸；6PGCL:6_磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯；6PGC:6_磷酸葡萄糖酸；RL5P:5_磷酸核酮糖；X5P:5-磷酸核糖；R5P:5_磷酸木糖；S7P -J-磷酸景天庚酮糖；E4P:4-磷酸赤鮮糖；PYR:丙酮酸；ACA:酰基輔酶A;ACP:?；姿?；ACE:乙酸；CIT:檸檬酸；ICIT:異檸檬酸；GLO:乙醛酸；DLAC:D-乳酸;FOR:甲酸;ETH ;乙醇；NAD+:氧化型尼克煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；NADPH:還原型尼克煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；NADH:還原型尼克煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；NADP+:氧化型尼克煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。galP:半乳糖透型酶基因；glk:葡萄糖激酶基因；gapA:3-磷酸甘油脫氫酶基因；pfkA:6磷酸果糖激酶基因；pck:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因；mdh:蘋果酸脫氫酶基因；fumA:富馬酸水合酶酶I基因；frdAB⑶:富馬酸還原酶基因；zwf:6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因；pgl:6_磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶基因；gnd:6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因；rpe:5_磷酸核酮糖差向異構(gòu)酶基因；rpiAB:
5-磷酸核糖差向異構(gòu)酶基因；tktA:轉(zhuǎn)酮醇酶基因；tktB:轉(zhuǎn)酮醇酶基因；talB:轉(zhuǎn)醛醇酶基因；pykF:丙酮酸激酶基因；pdh:丙酮酸脫氫酶基因；pta:磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因；ackA:乙酸激酶基因；gltA:檸檬酸合成酶基因；acn:順烏頭酸酶基因；aceB:蘋果酸合成酶基因；aceA:異檸檬酸裂解酶基因；sthA:嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因；maeB:NADPH依賴蘋果酸酶基因；dcuB:厭氧C4雙羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；dcuC:C4雙羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；dctA:好養(yǎng)C4雙羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。
[0033]圖8: (A)野生型IpdA基因以及突變的IpdA基因(IpdA*)的核苷酸序列比對(duì)；(B)野生型以及突變的IpdA基因(IpdA*)所編碼的多肽的氨基酸序列比對(duì)。
[0034]發(fā)明詳述
[0035]除非另有說(shuō)明，所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有本領(lǐng)域所知的常見(jiàn)含義。所有專利、專利申請(qǐng)、公開(kāi)出版物、序列、以及其他公開(kāi)材料均援引加入本文，除非另有說(shuō)明。
[0036]一方面，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)丁二酸的經(jīng)工程化改造的重組大腸桿菌。在本發(fā)明的大腸桿菌中，通過(guò)調(diào)節(jié)代謝途徑中所涉及的一些酶的活性，從而改善了大腸桿菌丁二酸的產(chǎn)量和/或轉(zhuǎn)化率。
[0037]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)工程化改造的重組大腸桿菌”、“工程化的大腸桿菌”和“重組大腸桿菌”可互換使用，均是指經(jīng)過(guò)修飾的大腸桿菌，其中所述的修飾可以是，例如，基因表達(dá)的增強(qiáng)、基因表達(dá)的抑制、引入新的基因、引入突變的基因或者對(duì)基因進(jìn)行突變等，其中可以通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的增強(qiáng)或基因表達(dá)的抑制，例如基因的敲除、改變基因的拷貝數(shù)、引入質(zhì)粒、改變基因的啟動(dòng)子(例如使用強(qiáng)啟動(dòng)子或弱啟動(dòng)子)等。
[0038]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中含有如下的一或多種修飾:(a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達(dá)增強(qiáng)、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和(b)sthA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或SthA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0039]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“磷酸戍糖途徑(pentose-phosphate pathway) ”具有本領(lǐng)域內(nèi)熟知的含義。磷酸戊糖途徑是在動(dòng)物、植物和微生物中普遍存在的一條糖的分解代謝途徑，其特征在于葡萄糖被直接氧化脫氫和脫羧，而不經(jīng)過(guò)糖酵解，脫氫酶的輔酶不是NAD+而是NADP+,產(chǎn)生的NADPH作為還原力以供生物合成用，而不是傳遞給O2。
[0040]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌的磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達(dá)增強(qiáng)、或者磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)，其中所述基因是選自如下的一或多種基因:編碼轉(zhuǎn)酮醇酶的基因tktA、編碼6-磷酸葡萄糖脫氫酶的基因zwf、編碼6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的基因pgl、編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的基因gnd、編碼5-磷酸核糖異構(gòu)酶的基因rp1、編碼5-磷酸核酮糖差向異構(gòu)酶的基因rpe和編碼轉(zhuǎn)醒醇酶的基因talB。
[0041]在本發(fā)明中，tktA基因(Genbank No:ACA76448.1)所編碼的蛋白質(zhì)的是轉(zhuǎn)酮醇酶(ECNo: 2.2.1.l)，zwf基因(Genbank No:ACA77430.1)所編碼的蛋白質(zhì)的是6-磷酸葡萄糖脫氫酶(EC No: 1.1.1.49) ;pgl基因(Genbank No:ACA78522.1)所編碼的蛋白質(zhì)的是6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(EC No:3.1.1.31) ;gnd基因(Genbank No:ACA76645.1)所編碼的蛋白質(zhì)的是6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(EC No: 1.1.1.44) ;rpi基因(Genbank No:ACA76468.1)所編碼的蛋白質(zhì)的是5_憐酸核糖異構(gòu)酶(EC No:5.3.1.6) ;rpe基因(Genbank No:ACA76005.1)所編碼的蛋白質(zhì)的是5-磷酸核酮糖差向異構(gòu)酶(EC No:5.1.3.1) ;talB基因(GenbankNo:ACA79258.1)所編碼的蛋白質(zhì)的是轉(zhuǎn)醛醇酶(EC No:2.2.1.2)。
[0042]sthA 基因(Genbank No: ACA79653.1)編碼一種可溶性轉(zhuǎn)氧酶(EC No: 1.6.1.1)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的sthA基因的序列如SEQ ID N0.:5所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的sthA基因的序列與SEQ ID N0.: 5所示的核苷酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列相同性。
[0043]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的tktA基因的序列如SEQ ID N0.: 6所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的tktA基因的序列與SEQ ID N0.:6所示的核苷酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 的序列相同性
[0044]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因表達(dá)增強(qiáng)”，其具有本領(lǐng)域內(nèi)熟知的含義，是指基因表達(dá)強(qiáng)度的增強(qiáng)，并導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的mRNA數(shù)量的增加?；虮磉_(dá)增強(qiáng)可以通過(guò)如下方式實(shí)現(xiàn)，例如但不限于:在基因前引入強(qiáng)啟動(dòng)子、增加基因的拷貝數(shù)、或者增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性等。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因所編碼的蛋白活性增強(qiáng)”具有本領(lǐng)域內(nèi)熟知的含義，是指基因轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生的蛋白活性的增加。其可以例如通過(guò)基因表達(dá)強(qiáng)度的增強(qiáng)、增加酶在細(xì)胞中的含量、氨基酸位點(diǎn)的突變來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)現(xiàn)“基因的表達(dá)增強(qiáng)”以及“基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)”的各種技術(shù)手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
[0045]在本發(fā)明中，基因表達(dá)增強(qiáng)可以例如通過(guò)引入強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用的強(qiáng)啟動(dòng)子例如是:Ppck*(SEQ ID N0.: 108) (Zhang etal.,2009b,ApplEnviron Microb1l75:7807-7813)、M1_37(SEQ ID N0.:109)、或Ml-93 (SEQID N0.:110) (Lu et al., 2012, Appl Microb1l B1technol93:2455-2426)。
[0046]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中含有如下的一或多種修飾:(a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達(dá)增強(qiáng)、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)；(b)sthA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或sthA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)；和(C)突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的如下位置的一個(gè)或多個(gè)位置上含有修飾:T81、Ρ275和Α358，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的，其中在對(duì)應(yīng)于Τ81的位置上的修飾是用I置換Τ，在對(duì)應(yīng)于Ρ275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對(duì)應(yīng)于Α358的位置上的修飾是用V置換Α。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0047]術(shù)語(yǔ)“突變”具有本領(lǐng)域內(nèi)常用的含義，是指在核苷酸序列中插入、添加、缺失、或者取代一或多個(gè)核苷酸，或者是指在多肽序列中插入、添加、缺失、或者取代一或多個(gè)氨基酸。
[0048]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，并且所述突變的IpdA基因位于質(zhì)粒中或者染色體中。
[0049]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，并且所述突變的IpdA基因位于染色體中。
[0050]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，并且所述突變的IpdA基因位于質(zhì)粒中。
[0051]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“質(zhì)粒”具有本領(lǐng)域熟知的定義，其是以附加體形式存在于細(xì)胞中的非染色體DNA并且能夠自主復(fù)制的DNA分子。本發(fā)明中可以使用的質(zhì)粒例如有:pEASY-Blunt、pACYC184、pTrc99A、pTrc99A_M、pTrc99A-M_Kan、pKD4 和 pKD46 等。
[0052]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“染色體”具有本領(lǐng)域熟知的定義。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所涉及的經(jīng)修飾的基因位于染色體中。將經(jīng)修飾的基因整合至染色體的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如可以參見(jiàn)Michael R.Green和 Joseph Sambrook的〃Molecular Cloning:ALaboratory Manual〃(Fourth Edit1n)。
[0053]IpdA基因(Genbank No:ACA79157.1)是編碼硫辛酰胺脫氫酶(EC No: 1.8.1.4)的基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所使用的初始大腸桿菌菌株中的野生型IpdA基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.: 2所示，其所編碼的多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.:1所示，而本發(fā)明的大腸桿菌中所引入的突變的IpdA基因則含有如下的一或多種突變:C242T、C823T、和C1073T ;而所述突變的IpdA基因所編碼的多肽具有如下的一或多種氨基酸置換:T811、P275S、和 A358V(參見(jiàn)圖 8)。
[0054]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的如下位置的一個(gè)或多個(gè)位置上含有修飾:T81、P275和A358，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的，其中在對(duì)應(yīng)于T81的位置上的修飾是用I置換T，在對(duì)應(yīng)于P275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對(duì)應(yīng)于A358的位置上的修飾是用V置換A。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0055]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，所述突變的IpdA基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:2所示核苷酸序列的如下位置的一個(gè)或多個(gè)位置上含有突變:C242、C823和C1073，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.: 2進(jìn)行序列比對(duì)而確定的，其中所述突變均是用T置換C。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0056]本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到不同大腸桿菌菌株的IpdA基因序列可能與SEQ IDN0.:2所示IpdA基因序列不完全等同，以及不同大腸桿菌菌株的IpdA基因所編碼的多肽序列可能與SEQ ID N0.:1所示的多肽序列不完全等同。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述突變的IpdA基因中的突變位于對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:2的第C242位、第823位、和/或第1073位的位置上。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述突變的IpdA基因所編碼的多肽中的置換位于對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1的第81位、第275位、和/或第358位的位置上。
[0057]在本發(fā)明中，“對(duì)應(yīng)于” SEQ ID N0.:1或SEQ ID N0.:2中某一特定位置的位置可以通過(guò)序列比對(duì)而確定，包括如使用人工排列對(duì)比及通過(guò)使用眾多可利用的排列對(duì)比程序(例如BLASTP)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法。通過(guò)對(duì)比多肽或核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在適當(dāng)?shù)奈恢靡胂鄳?yīng)的突變，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以使用保守和類似的氨基酸殘基來(lái)置換相應(yīng)位置上的氨基酸殘基，或者在IpdA基因序列中引入同義突變，而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果。
[0058]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中SthA基因和tktA基因的表達(dá)增強(qiáng)、或者sthA基因和tktA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0059]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中含有如下遺傳修飾:(a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達(dá)增強(qiáng)、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)；(b)sthA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或SthA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增；和(c)突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQIDN0.:1所示氨基酸序列的如下位置的一個(gè)或多個(gè)位置上含有修飾:T81、Ρ275和Α358，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的，其中在對(duì)應(yīng)于Τ81的位置上的修飾是用I置換Τ，在對(duì)應(yīng)于Ρ275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對(duì)應(yīng)于Α358的位置上的修飾是用V置換Α。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0060]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列如下位置的位置上含有修飾:Τ81、Ρ275和Α358，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的，其中在對(duì)應(yīng)于Τ81的位置上的修飾是用I置換Τ，在對(duì)應(yīng)于Ρ275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對(duì)應(yīng)于Α358的位置上的修飾是用V置換Α。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0061]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因在對(duì)應(yīng)于SEQID N0.: 2所示核苷酸序列如下位置的位置上含有突變:C242、C823和C1073，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:2進(jìn)行序列比對(duì)而確定的，其中所述突變均是用T置換C。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0062]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中含有如下遺修飾:(a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達(dá)增強(qiáng)、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)；(b) sthA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或sthA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)；和(c)突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQIDN0.:1所示氨基酸序列如下位置的位置上含有修飾:T81、Ρ275和Α358，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的，其中在對(duì)應(yīng)于Τ81的位置上的修飾是用I置換Τ，在對(duì)應(yīng)于Ρ275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對(duì)應(yīng)于Α358的位置上的修飾是用V置換Α。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0063]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中含有如下修飾:(a) tktA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或tktA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)，(b)sthA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或sthA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)，和(c)突變的IpdA基因，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:2所示核苷酸序列如下位置的位置上含有突變:C242、C823和C1073，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:2進(jìn)行序列比對(duì)而確定的，其中所述突變均是用T置換C。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng),和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0064]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有選自如下的一或多種修飾:(1)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)所涉及的基因表達(dá)的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；(2)pflB和/或adhE基因表達(dá)的抑制、和/或pflB或adhE基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；(3) IdhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；(4) galP基因和/或外源gif基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或galP基因或外源gif基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和(9)pck基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或pck基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0065]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)所涉及的基因表達(dá)的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制，其中所述基因是選自如下的一或多種基因:編碼PTS系統(tǒng)酶I的基因ptsl、編碼PTS系統(tǒng)酶Hpr的基因ptsH、編碼PTS系統(tǒng)酶IIAGlc的基因err和編碼PTS系統(tǒng)酶IICBele的基因ptsG。
[0066]在本發(fā)明中，ptsl基因(GenBank No:ACA76928.1、NC_010468.1)編碼磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶I (EC No:2.7.3.9)。ptsH基因(GenBank No:ACA76929.1)編碼磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶Hpr(EC No:2.7.1.69)。err基因(GenBank No:ACA76927.1)編碼磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶IIAGle(EC No:2.7.1.69)。ptsG基因(GenBankNo:ACA78131.1)編碼磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶IICBele(EC No:2.7.1.69)。
[0067]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有選自如下的一或多種修飾:(l)ptsl基因表達(dá)的抑制、和/或PtsI基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制；(2) pflB和/或adhE基因表達(dá)的抑制、和/或PflB和/或adhE基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；(3) IdhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；(4) galP基因和/或外源gif基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或galP基因和/或外源gif基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和(9)pck基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或pck基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0068]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有選自如下的一或多種修飾:(I) PtsI基因表達(dá)的抑制、和/或PtsI基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制；(2)pflB和/或adhE基因表達(dá)的抑制、和/或PflB和/或adhE基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；(3) IdhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；(4) galP基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或galP基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和(9)pck基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或pck基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0069]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有選自如下的一或多種修飾:(I) PtsI基因表達(dá)的抑制、和/或PtsI基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制；(2) pflB基因表達(dá)的抑制、和/或pflB所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；(3) IdhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；(4)galP基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或galP基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和(9)pck基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或pck基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0070]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有選自如下修飾:(l)ptsl基因表達(dá)的抑制、和/或PtSl基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制；(2)pflB基因表達(dá)的抑制、和/或PflB所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；(3) IdhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；(4) galP基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或galP基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和(9)pck基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或pck基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0071]在本發(fā)明中，pflB基因(GenBank No:ACA78322.1)編碼丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate formate lyase)(EC N0.2.3.1.54)。adhE 基因(Genbank No:ACA78022.1)編碼乙醇 / 乙醒脫氫酶(Alcohol/acetaldehyde dehydrogenase) (EC No: 1.1.1.1, ECNo: 1.2.1.10)。IdhA 基因(GenBank No:ACA77176.1)編碼乳酸脫氫酶 A(lactatedehydrogenase A) (EC No: 1.1.1.28)。galP 基因(GenBank No:ACA76443.1)編碼半乳糖MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。gif基因(GenBank No:AAA27691.1)編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glf (glucosefacilitator protein)。pck 基因(GenBank No:ACA75988.1)編碼憐酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，又稱作 PCK 酶(EC No:4.1.1.49)。
[0072]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因表達(dá)的抑制”具有本領(lǐng)域內(nèi)熟知的含義，是指基因表達(dá)強(qiáng)度的降低，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的mRNA數(shù)量的減少?；虮磉_(dá)的抑制可以通過(guò)如下方式實(shí)現(xiàn)，例如但不限于:基因的敲除、減少基因的拷貝數(shù)、改變基因的啟動(dòng)子(例如使用弱啟動(dòng)子)等。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制”具有本領(lǐng)域內(nèi)熟知的含義，是指基因轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生的蛋白活性的降低。其可以例如通過(guò)基因表達(dá)強(qiáng)度的降低、基因中核苷酸的插入或缺失、氨基酸位點(diǎn)的突變來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)現(xiàn)“基因表達(dá)的抑制”以及“基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制”的各種技術(shù)手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
[0073]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下修飾:(l)ptsl基因表達(dá)的抑制、和/或PtsI基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制；(2) pflB基因表達(dá)的抑制、和/或pflB所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；(3) IdhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；(4)galP基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或galP基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0074]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下的修飾:(5) ackA和pta基因表達(dá)的抑制、和/或ackA和pta基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；(6) aceBA基因簇表達(dá)的增強(qiáng)、和/或aceBA基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；(7)dcuC基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或dcuC基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和(8)mgsA基因表達(dá)的抑制、和/或mgsA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
[0075]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下的修飾:(9)pck基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或pck基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中的pck基因被敲除。
[0076]pta 基因(GenBank No:ACA77021.1)編碼磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC No:2.3.1.8)，而ackA 基因(GenBank No:ACA77022.1)編碼乙酸激酶(EC No: 2.7.2.1)。aceBA 基因簇包括aceB 基因(GenBank No:ACA79615.1)編碼蘋果酸合成酶(EC No:2.3.3.9)和 aceA 基因(GenBank No:ACA79614.1)編碼異檸檬酸裂解酶(EC No:4.1.3.1) ? dcuC 基因(GenBankNo:ACA78647.1)編碼 C4 二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 DcuC。mgsA 基因(GenBank No:ACA78263.1)編碼甲基乙二醛合成酶(EC No:4.2.3.3)。
[0077]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下修飾:(10) adhE基因表達(dá)的抑制、和/或adhE基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；和(11) tdcDE基因簇表達(dá)的抑制、和/或tdcDE基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
[0078]tdcDE 基因簇包括 tdcD 基因(GenBank No:ACA76259.1)和 tdcE 基因(GenBankNo:ACA76260.1)，其中tdcD基因編碼丙酸激酶(EC No:2.7.2.15)，而tdcE基因編碼2-酮基丁酸甲酸裂解酶/丙酸甲酸裂解酶(EC No:2.3.1.54)。adhE基因(GenBankNo:ACA78022.1)編碼乙醇 / 乙醛脫氫酶(EC No: 1.1.1.1/EC No: 1.2.1.10)。
[0079]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下的一或多種修飾:(12)aceEF基因簇表達(dá)的增強(qiáng)、和/或aceEF基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；(13)dcuB基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或dcuB基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；(14)mdh基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或mdh基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；(15)fumA基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或fumA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；(16)fumB基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或fumB基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和(17)frdABCD基因簇表達(dá)的增強(qiáng)、和/或frdABCD基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0080] aceEF基因簇編碼丙酮酸復(fù)合體E1/E2 (EC No: 1.2.4.1)，包括aceE基因(GenBankNo:ACA79159.1)編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合體El和aceF基因(GenBank No:ACA79158.1)編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2。dcuB基因(GenBank No:ACA79506.1)編碼厭氧C4 二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 DcuB0 mdh 基因(GenBank No:ACA76147.1)編碼蘋果酸脫氫酶(EC No: 1.1.1.37)。fumA 基因(GenBank No:ACA77662.1)編碼好氧富馬酸酶 I(EC No:4.2.1.2) ? fumB 基因(GenBank No:ACA79507.1)編碼厭氧富馬酸酶 I (EC No:4.2.1.2)。frdABCD 基因簇編碼富馬酸還原酶(EC No: 1.3.5.4),包括frdA基因(GenBank No:ACA79460.1)編碼富馬酸還原酶黃素蛋白亞基、frdB基因(GenBank No:ACA79461.1)編碼富馬酸還原酶鐵硫蛋白亞基、frdC基因(GenBank No:ACA79462.1)編碼富馬酸還原酶C亞基、和frdD基因(GenBankNo:ACA79463.1)編碼富馬酸還原酶D亞基。
[0081]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌是以保藏號(hào)CGMCC7260 (2013年2月25日，分類命名:大腸埃希氏菌E.coli)保藏于CGMCC(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中科院微生物所)的菌株。
[0082]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌是以保藏號(hào)CGMCC7259 (2013年2月25日，分類命名:大腸埃希氏菌E.coli)保藏于CGMCC(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中科院微生物所)的菌株。
[0083]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌是以保藏號(hào)CGMCC7550(2013年5月3日，分類命名:大腸埃希氏菌E.coli)保藏于CGMCC(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中科院微生物所)的菌株。
[0084]在第二方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)丁二酸的方法，其中包括培養(yǎng)本發(fā)明的大腸桿菌的步驟。
[0085]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明生產(chǎn)丁二酸的方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的大腸桿菌，以及任選的收集或者純化丁二酸。
[0086]在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明所述的“培養(yǎng)”包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)。
[0087]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“種子培養(yǎng)”是指將用于發(fā)酵的菌種在固體培養(yǎng)基上活化后，再經(jīng)過(guò)搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種的過(guò)程。
[0088]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵培養(yǎng)”是指利用微生物菌種，在適宜的條件下，將培養(yǎng)基組分經(jīng)過(guò)特定的代謝途徑轉(zhuǎn)化為某些特定產(chǎn)物的過(guò)程。
[0089]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中包括將本發(fā)明的大腸桿菌厭氧發(fā)酵。
[0090]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“厭氧發(fā)酵”是指利用厭氧發(fā)酵菌株，在隔絕空氣的條件下，經(jīng)特定代謝途徑將培養(yǎng)基組分轉(zhuǎn)化為某些特定產(chǎn)物的過(guò)程。
[0091 ] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中的培養(yǎng)過(guò)程不進(jìn)行任何通氣步驟。
[0092]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)的方法包括以下步驟:
[0093](I)將本發(fā)明的重組大腸桿菌接種于種子培養(yǎng)基，在適宜大腸桿菌生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)一段時(shí)間得到種子液；
[0094](2)將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在厭氧條件下培養(yǎng)。
[0095]本發(fā)明的方法中可以使用本領(lǐng)域中常規(guī)用于培養(yǎng)大腸桿菌的各種培養(yǎng)條件，例如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和是否搖動(dòng)以及搖動(dòng)速度等。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要可以選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。本發(fā)明的方法中所使用的培養(yǎng)條件以及發(fā)酵條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(諸葛健等，1994，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)，中國(guó)輕工業(yè)出版社)。
[0096]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于:溫度為30_45°C，例如30-31 0C >31-32 °C >32-33 °C >33-34 °C >34-35 °C >35-36 °C >36-37 °C >37-38 °C >38-39 °C、39-40 O、40-410、41-42 O、42-43 O、43-44 O、或 44-45 V。
[0097]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于:種子培養(yǎng)的時(shí)間為6-16小時(shí),例如6-7 小時(shí)、7-8小時(shí)、8-9小時(shí)、9-10小時(shí)、10-11小時(shí)、11-12小時(shí)、12-13小時(shí)、13-14小時(shí)、14-15小時(shí)、或15-16小時(shí)。
[0098]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于:發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為2-5天，例如2天、3天、4天、或5天。
[0099]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于:將本發(fā)明的重組大腸桿菌按照0.1-10% (V/V)的接種量接種于種子培養(yǎng)基，例如0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、或10%。。
[0100]在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于:將種子液按照終濃度OD550=0.05-0.5 的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，例如 OD55tl 為 0.05-0.1,0.1-0.2,0.2-0.3、0.3-0.4 或 0.4-0.5。
[0101]在一實(shí)施方案中，可以使用常用于大腸桿菌的培養(yǎng)基。用于本發(fā)明的大腸桿菌的培養(yǎng)基可以包括合適的氮源，例如有機(jī)含氮化合物或無(wú)機(jī)含氮化合物或其混合物。在一實(shí)施方案中，所述有機(jī)含氮化合物例如選自豆餅粉、花生餅粉、牛肉膏、魚(yú)粉、酵母膏、蛋白胨、玉米漿中的一種或任意幾種的混合物，所述無(wú)機(jī)含氮化合物選自硝酸鹽(如硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸鈣)，銨鹽(如磷酸銨、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨)中的一種或任意幾種的混合物。在一實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的大腸桿菌的培養(yǎng)基可以包括合適的碳源，例如選自葡萄糖、淀粉、淀粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麥芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮酸、和富馬酸中的一種或任意幾種的混合物。
[0102]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中所使用的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成(溶劑為水):
[0103]大量元素:葡萄糖、KH2PO4、K2HP04、(NH4)2HPO4^MgSO4.7H20、和甜菜堿-KCl ；
[0104]微量元素:FeCl3.6H20、CoCl2.6H20、CuCl2.2H20、ZnCl2、Na2MoO4.2H20、MnCl2.4H202、和 H3BO3。
[0105]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基由以下成分組成(溶劑為水):
[0106]大量元素:葡萄糖20-120g/L，KH2P042_5g/L、K2HP044_8g/L、(NH4) 2HP043_5g/L、MgSO4.7H200.1-0.3g/L、以及甜菜堿-KC10.1-lg/L ；
[0107]微量元素=FeCl3.6H20 1-5 μ g/L、CoCl2.6H20 0.05-1 μ g/L、CuCl2.2H200.05-1 μ g/L、ZnCl20.05-1 μ g/L、Na2MoO4.2H20 0.05-1 μ g/L、MnCl2.4H2020.1-1 μ g/L, H3BO30.01-0.5 μ g/L。
[0108]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中所使用的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成(溶劑為水):
[0109]大量元素:葡萄糖、NH4H2PO4、(NH4)2HPO4^MgSO4.7H20、和甜菜堿-KCl ；
[0110]微量元素:FeCl3.6H20、CoCl2.6H20、CuCl2.2H20、ZnCl2、Na2MoO4.2H20、MnCl2.4H202、和 H3BO3。
[0111]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基由以下成分組成(溶劑為水):
[0112]大量元素:葡萄糖20-120g/L，NH4H2PO40.5-1.5g/L、(NH4) 2HP042_5g/L、MgSO4.7H200.1-0.3g/L、以及甜菜喊-KCl 0.1-lg/L ；
[0113]微量元素:FeCl3.6Η201-5μ g/L、CoCl2.6Η20 0.05-1 μ g/L、CuCl2.2Η20
0.05-1 μ g/L、ZnC l20.05-1 μ g/L、Na2MoO4.2Η200.05-1 μ g/L、MnCl2.4Η2020.1-1 μ g/L, H3BO30.01-0.5 μ g/L。
[0114]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)的具體方法如下:
[0115]將菌株厭氧發(fā)酵，包括以下步驟:
[0116](I)種子培養(yǎng):將1/3-1/2體積的種子培養(yǎng)基置于三角瓶中，高溫高壓滅菌。冷卻后將本發(fā)明的重組大腸桿菌按照0.1-10%(V/V)的接種量接種于種子培養(yǎng)基，在37°C以及搖動(dòng)的條件下培養(yǎng)6-16小時(shí)得到種子液，用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種；
[0117](2)發(fā)酵培養(yǎng):將1/3-1/2體積的發(fā)酵培養(yǎng)基體積置于厭氧發(fā)酵罐中，將種子液按照終濃度OD55tl=0.05-0.5的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)2_5天，得到發(fā)酵液。
[0118]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明生產(chǎn)丁二酸的方法中還包括從發(fā)酵液中提取和/或純化丁二酸的步驟。
[0119]在第三方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的大腸桿菌在生產(chǎn)丁二酸中的用途。
實(shí)施例
[0120]本發(fā)明通過(guò)下述實(shí)施例進(jìn)一步闡明，但任何實(shí)施例或其組合不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┓绞降南拗啤１景l(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書(shū)限定，結(jié)合本說(shuō)明書(shū)和本領(lǐng)域一般常識(shí)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以清楚地明白權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行任何修改或改變，這種修改和改變也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0121]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0122]本發(fā)明具體包括如下實(shí)施例:
[0123]實(shí)施例1、重組大腸桿菌NZ-037的構(gòu)建
[0124]重組大腸桿菌NZ-037的構(gòu)建(表1)，分為以下八個(gè)步驟:
[0125](I)乳酸脫氫酶基因IdhA的敲除
[0126](1-1):首先構(gòu)建質(zhì)粒pXZ-CS，用于基因敲除、基因表達(dá)調(diào)控和外源基因整合。
[0127]質(zhì)粒構(gòu)建操作步驟共四步:
[0128]第一步，以pACYC184 質(zhì)粒 DNA (Mok et al., 1991, Nucleic AcidsResl9:2321-2323)為模板，使用引物 184-cat-up (SEQ ID N0.:7)和 184-cat-down(SEQ IDN0.:8)，擴(kuò)增得到氯霉素抗性基因，基因片段大小為994bp，包含有氯霉素基因啟動(dòng)子序列，稱為片段I。
[0129]擴(kuò)增體系為:NewEnglandB1labs Phus1n5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP 各1mM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phus1n High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0130]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、56°C退火10秒、72°C延伸30秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0131]第二步，以芽抱桿菌Bacillus subtilis sp subtilisl68的染色體DNA(該菌購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，CGMCC N0.1.1390)為模板，使用引物Bs-sacB-up (SEQ IDN0.: 9)和Bs-sacB-down (SEQ ID N0.:10)進(jìn)行PCR擴(kuò)增果聚糖鹿糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB),基因片段大小為1618bp，含有sacB基因啟動(dòng)子序列，稱為片段II。擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參見(jiàn)上文第一步。
[0132]第三步，將第一步得到的片段I和第二步得到的片段II分別用限制性內(nèi)切酶SacI (NEB公司)在37°C酶切30分鐘；PCR純化試劑盒清洗(Gel/PCR Extrat1n Kit，購(gòu)自B1MIGA生物技術(shù)有限公司);各取20ng片段I和片段II，加入I μ 110ΧΤ4連接緩沖液(NEB公司)、I μ I T4-DNA連接酶(NEB公司)，補(bǔ)充蒸餾水至10 μ 1，25°C反應(yīng)5分鐘；以酶連片段為底物，取I μ 1，用引物184-cat-up和Bs-sacB-down進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參見(jiàn)上文第一步，得到含有cat-sacB的連接片段III。
[0133]第四步，將PCR獲得的片段III取1μ 1，加入1μ I pEASY-blunt simple載體(試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，25°C反應(yīng)15分鐘；氯化鈣轉(zhuǎn)化法:加入50 μ ITranslO感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)中進(jìn)行，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250 μ I LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育I小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有氨芐霉素(終濃度為100 μ g/ml)和氯霉素(終濃度為34 μ g/ml)的LB平板上，過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，引物為M13-F(SEQ IDN0.:11)/M13-R(SEQ ID N0.: 12)。送樣測(cè)序分析，結(jié)果正確的為陽(yáng)性克隆，得到質(zhì)粒pXZ_CS (表3)。
[0134](1-2):從大腸桿菌ATCC8739 (Gunsalus et al.，1941，J B1l ChemHl: 853-858)出發(fā)，采用兩步同源重組的方法敲除IdhA基因，獲得重組大腸桿菌SUC-T102，包括以下六
I K
少:
[0135]第一步，以大腸桿菌ATCC8739基因組DNA為模板，使用引物XZ-ldhA-up(SEQIDN0.:13 和 XZ-ldhA-down(SEQ ID N0.: 14)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物為 1753bp，該 PCR 產(chǎn)物包含大腸桿菌ATCC8739的乳酸脫氫酶編碼基因IdhA (GenBank No:ACA77176.1)及其上下游各大約400個(gè)堿基。擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參考實(shí)施例上文(1-1)中的第一步。
[0136]將擴(kuò)增得到的1753bp PCR產(chǎn)物克隆到pEASY-Blunt克隆載體(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)上?？寺◇w系及氯化鈣轉(zhuǎn)化法參見(jiàn)上文(1-1)中質(zhì)粒ρΧΖ-CS構(gòu)建方法中的第四步。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(終濃度為15 μ g/ml)的LB平板上，過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，引物為M13-F/M13-R。送樣測(cè)序分析，結(jié)果正確的為陽(yáng)性克隆，將得到的重組質(zhì)粒命名為PXZ001。
[0137]第二步，以pXZOOl質(zhì)粒DNA為模板，使用引物XZ-1dhA-1 (SEQ ID N0.: 15和XZ-1 dhA-2 (SEQ ID N0.: 16)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到4758bp的PCR產(chǎn)物，該P(yáng)CR產(chǎn)物包含pEASY-Blunt載體和乳酸脫氫酶編碼基因上下游各約400個(gè)堿基。擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參考實(shí)施例上文(1-1)中的第一步。
[0138]第三步，將含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)DNA片段cat-sacB連接至第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,具體如下:
[0139]以pXZ-CS 為模板,使用引物 cat-sacB-up (SEQ ID N0.: 17)和 cat-sacB-down (SEQIDN0.:18)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2618bp的PCR產(chǎn)物，即為含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)的DNA片段。
[0140]連接體系為:10ng的第二步4758bp的PCR產(chǎn)物、30ng的cat-sacB DNA片段，2μ 110XT4 連接緩沖液(NEB 公司)，1μ I Τ4 連接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive endunits/ml),補(bǔ)充蒸懼水至20 μ I。室溫連接2小時(shí)。取1ul用氯化|丐轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入TranslO,過(guò)程參見(jiàn)上文(1-1)中質(zhì)粒PXZ-CS構(gòu)建方法中的第四步。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(終濃度為17ug/ml)的LB平板上，過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒(將cat-sacB DNA片段克隆到pXZOOl中的質(zhì)粒)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果在上述第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上連接了 cat-sacB DNA片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的重組質(zhì)粒命名為PXZ002C。
[0141]第四步，以pXZ002C質(zhì)粒DNA為模板，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA_down擴(kuò)增出3447bp DNA片段I。擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參見(jiàn)上文(1-1)中質(zhì)粒ρΧΖ-CS構(gòu)建步驟中的第一步。DNA片段I包含乳酸脫氫酶編碼基因IdhA上游約400個(gè)堿基、cat-sacB DNA片段、乳酸脫氫酶編碼基因IdhA下游約400個(gè)堿基。
[0142]將DNA片段I用于第一次同源重組:首先將pKD46質(zhì)粒(Datsenko andWanner2000, Proc Natl Acad Sci USA97:6640-6645;質(zhì)粒購(gòu)買于美國(guó)耶魯大學(xué) CGSC 大腸桿菌保藏中心)通過(guò)氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ATCC8739，然后將DNA片段I電轉(zhuǎn)至帶有pKD46的大腸桿菌ATCC8739。
[0143]電轉(zhuǎn)條件為:首先準(zhǔn)備帶有PKD46質(zhì)粒的大腸桿菌ATCC8739的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Dower et al.，1988，Nucleic Acids Resl6:6127-6145);將 50 μ I 感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ng DNA片段I，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的B1-Rad電擊杯。使用MicroPulser (B1-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75rpm，30°C孵育2小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(終濃度為17ug/ml)的LB平板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down進(jìn)行驗(yàn)證，挑選一個(gè)正確的單菌落，命名為Suc-TlOl。
[0144]第五步，將第二步得到的4758bp的PCR產(chǎn)物進(jìn)行磷酸化處理，自連得到的質(zhì)粒用于第二次同源重組；具體步驟如下:將第二步的4758bp的PCR產(chǎn)物首先用PCR純化試劑盒清洗(Gel/PCR Extrat1n KU，購(gòu)自B1MIGA生物技術(shù)有限公司)；取30ng純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2 μ 110ΧΤ4連接緩沖液(NEB公司)、I μ I Τ4多核苷酸激酶(NEB公司)，補(bǔ)充蒸餾水至20 μ 1，37°C反應(yīng)30分鐘；加入1μ I Τ4連接酶(NEB公司，400，000粘附末端單位/ml)，室溫反應(yīng)2小時(shí)得到連接產(chǎn)物。酶連產(chǎn)物取1ul用氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入Trans 10，過(guò)程參見(jiàn)上文(1-1)中質(zhì)粒ρΧΖ-CS構(gòu)建步驟中的第四步。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(終濃度為15ug/ml)的LB平板上，過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果上述第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了自連，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，得到質(zhì)粒PXZ003。
[0145]第六步，以pXZ003質(zhì)粒DNA為模板，用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down擴(kuò)增出829bp DNA片段ILDNA片段II用于第二次同源重組。將DNA片段II電轉(zhuǎn)至菌株Suc_T101。
[0146]電轉(zhuǎn)條件為:首先準(zhǔn)備帶有PKD46質(zhì)粒的Suc-TlOl的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(制備方法參見(jiàn)Dower et al., 1988);將50 μ I感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的B1-Rad電擊杯。使用MicroPulser (B1-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75轉(zhuǎn)，30°C孵育4小時(shí)，去除pKD46質(zhì)粒。將菌液轉(zhuǎn)移至含有10%蔗糖的沒(méi)有氯化鈉的LB液體培養(yǎng)基(250ml燒瓶中裝50ml培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時(shí)后在含有6%蔗糖的沒(méi)有氯化鈉的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證，所用引物為XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down，正確的菌落擴(kuò)增產(chǎn)物為763bp的片段，挑選一個(gè)正確的單菌落，將其命名為Suc-T102(表I)。
[0147]敲除IdhA基因所構(gòu)建的質(zhì)粒見(jiàn)表3,使用的引物序列見(jiàn)表2。
[0148](2)丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因PflB的敲除
[0149]從重組大腸桿 SUC-T102出發(fā)，使用上文(I)部分中相同的方法敲除pfIB基因(GenBank No:ACA78322.1)，獲得重組大腸桿菌Suc_T104。構(gòu)建的質(zhì)粒見(jiàn)表3，使用的引物序列見(jiàn)表2，其中引物的命名對(duì)應(yīng)于敲除IdhA基因過(guò)程中所使用的引物的名稱，僅將IdhA替換為PflB。
[0150](3)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶I基因PtsI的敲除
[0151]從重組大腸桿菌SUC-T104出發(fā)，使用上文(I)部分中相同的方法敲除ptsl基因(GenBank No:ACA76928.1)，獲得重組大腸桿菌Suc_T106。構(gòu)建的質(zhì)粒見(jiàn)表3，使用的引物序列見(jiàn)表2，其中引物的命名對(duì)應(yīng)于敲除IdhA基因過(guò)程中所使用的引物的名稱，僅將IdhA替換為ptsl。
[0152](4)半乳糖MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GalP的激活
[0153]從重組大腸桿菌Suc-T106出發(fā)，將galP基因(GenBank No:ACA76443.1)的原始調(diào)控元件替換為調(diào)控元件Ppck* (SEQ ID N0.108)，獲得重組大腸桿菌SUC-T108。在本發(fā)明中，Ppck*代表大腸桿菌pck啟動(dòng)子突變體，也即在相對(duì)于ATG起始處的-64位處G變?yōu)锳(Zhang et al., 2009b, Appl Environ Microb1l75:7807-7813)。
[0154]包括以下六步:
[0155]第一步，以大腸桿菌ATCC8739基因組DNA為模板，使用引物XZ-galP-P-up (SEQIDN0.:27)和 XZ-galP-P-down (SEQ ID N0.:28)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到 841bp 擴(kuò)增產(chǎn)物，為大腸桿菌ATCC8739的半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因galP調(diào)控元件以及其上下游各約400個(gè)堿基。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到PEASY-Blunt克隆載體上。提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體pEASY-Blunt上插入了敲除半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因galP調(diào)控元件及其上下游各400個(gè)左右堿基，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的重組質(zhì)粒命名為pXZOll。
[0156]第二步，以pXZOll 質(zhì)粒 DNA 為模板，使用引物 XZ-galP-P_l(SEQ ID N0.:29 和XZ-galP-P-2 (SEQ ID N0.: 30)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到4614bp擴(kuò)增產(chǎn)物，其擴(kuò)增產(chǎn)物包含pEASY-Blunt載體和半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因galP調(diào)控元件及上下游各約400個(gè)堿基。
[0157]第三步，以pXZ-CS質(zhì)粒為模板,使用引物cat-sacB-up/cat-sacB-down進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2618bp的PCR產(chǎn)物，即為含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)的 DNA 片段。
[0158]將含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)DNA片段連接至第二步的4614bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(終濃度為17 μ g/ml)的LB平板上，過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒(將cat-sacB DNA片段克隆到ρΧΖΟΙΟ中的質(zhì)粒)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果在上述第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上連接了 cat-sacB DNA片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的重組質(zhì)粒命名為PXZ012C。
[0159]第四步，以pXZ012C 質(zhì)粒 DNA 為模板，使用引物 XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到3303bp DNA片段I ;該0嫩片段I包含半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因galP調(diào)控元件上游約400個(gè)堿基、cat-sacB DNA片段、半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因galP調(diào)控元件下約400個(gè)堿基。
[0160]將DNA片段I用于第一次同源重組。首先將PKD46質(zhì)粒通過(guò)氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至菌株Suc-T106，然后將DNA片段I電轉(zhuǎn)至帶有pKD46的菌株Suc_T106。
[0161]電轉(zhuǎn)條件參見(jiàn)上文(1-2)中IdhA基因敲除的第四步。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(終濃度為17ug/ml)的LB平板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，使用引物為XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down，得到驗(yàn)證正確的單菌落，將其命名為SUC-T107。
[0162]第五步，以大腸桿菌ATCC8739基因組DNA為模板，使用引物P-pck*-up-SpeI (SEQID N0.:31)和 P-pck*-down-KpnI (SEQ ID N0.:32)擴(kuò)增大腸桿菌 ATCC8739 的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的調(diào)控元件pck，引物序列見(jiàn)表2。PCR產(chǎn)物進(jìn)行SpeI (購(gòu)自NEB公司)和KpnI (購(gòu)自NEB公司)酶切。將其克隆到經(jīng)過(guò)相同酶酶切的質(zhì)粒pTrc99A (Amann etal., 1998, Gene69:301-15)表達(dá)載體上，命名為質(zhì)粒pXZ602。以質(zhì)粒pXZ602為模板，使用引物pck*-F(SEQ ID N0.:33)和pck*-R(SEQ ID N0.:34)進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為見(jiàn)表2。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)T4多核苷酸激酶(購(gòu)自NEB公司)磷酸化，自連得到陽(yáng)性質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后，命名為PXZ603。
[0163]以pXZ603 為模板，使用引物 P-pck^-up-Spel 和 P-pck^-down-Kpnl 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到378bp磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的突變調(diào)控元件Ppck*，與第二步得到的4614bp擴(kuò)增產(chǎn)物連接，得到質(zhì)粒pXZ013。
[0164]用XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down引物對(duì)以質(zhì)粒pXZ013為模板擴(kuò)增出DNA片段II。
[0165]第六步，DNA片段II用于第二次同源重組。將DNA片段II電轉(zhuǎn)至Suc_T107。電轉(zhuǎn)條件參見(jiàn)上文(1-2)中IdhA基因敲除步驟中的第六步。用引物XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down進(jìn)行PCR以及測(cè)序驗(yàn)證，得到1051bp為正確的單菌落，將其命名為Suc-T108(表 I)。
[0166]將半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因galP調(diào)控元件置換成Ppck*所構(gòu)建的質(zhì)粒見(jiàn)表3，使用的引物序列見(jiàn)表2。
[0167](5)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的激活
[0168]從重組大腸桿菌Suc-T108出發(fā)，將pck基因(GenBank No:ACA75988.1)的原始調(diào)控元件替換為調(diào)控元件Ppck*,獲得重組大腸桿菌Suc-TllO (表1)。
[0169]具體如下:
[0170]第一步同源重組:以pXZ-CS 為模板,使用引物 pck-cat-sacB-up (SEQ ID N0.:35)和pck-cat-sacB-down(SEQ ID N0.:36)擴(kuò)增DNA片段I,用于第一次同源重組。引物序列見(jiàn)表2 ;得到2717bp DNA片段I，將所得DNA擴(kuò)增片段I電轉(zhuǎn)至帶有pKD46質(zhì)粒的重組菌Suc-TlOS，篩選氨芐青霉素與氯霉素抗性的菌落，得到中間重組菌；
[0171]第二步同源重組:以pXZ603質(zhì)粒為模板，使用引物P-pcP-up-Spel/P-pck*-down-KpnI擴(kuò)增(引物序列見(jiàn)表2)，得到378bp人工調(diào)控元件Ppck* ;將378bp人工調(diào)控元件Ppck*電轉(zhuǎn)入整合了片段I的中間重組菌，得到重組菌I。重組菌IPCR驗(yàn)證的引物pck-YZ-up(SEQ ID N0.:37)和pck-YZ-down(SEQ ID N0.:38)，得到 676bp且測(cè)序正確的單菌落，將其命名為菌株Suc-TllO。
[0172](6)磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA的敲除
[0173]從重組大腸桿菌Suc-TllO出發(fā)，使用上文(I)部分中相同的方法敲除磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因pta(GenBank N0.ACA77021.1)和乙酸激酶編碼基因ackA(GenBankN0.ACA77022.1)，獲得重組大腸桿菌NZ-035 (表1)。構(gòu)建的質(zhì)粒見(jiàn)表3，使用的引物序列見(jiàn)表2，其中引物的命名對(duì)應(yīng)于敲除IdhA基因過(guò)程中所使用的引物的名稱，僅分別將IdhA替換為ackA或者pta。
[0174](7)蘋果酸合成酶AceA和異檸檬酸裂解酶AceB的激活
[0175]以重組大腸桿菌NZ-035出發(fā)，使用和實(shí)施案例上文(4)部分中相同的方法將aceBA 基因簇(aceB GenBank No:ACA79615.1, aceA GenBank No:ACA79614.1)的原始啟動(dòng)子替換為Ppck*啟動(dòng)子，獲得重組大腸桿菌NZ-036(表1)。構(gòu)建的質(zhì)粒見(jiàn)表3，使用的引物序列見(jiàn)表2，其中引物的命名對(duì)應(yīng)于激活galP基因過(guò)程中所使用的引物的名稱，僅將galP替換為aceB。
[0176](8) 二羧酸Dcu轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DcuC的激活
[0177]以重組大腸桿菌NZ036出發(fā)，使用和上文(4)部分中相同的方法將dcuC基因(GenBank N0.ACA78647.1)的原始調(diào)控元件替換為調(diào)控元件Ppck*,獲得重組大腸桿菌NZ-037(表1)。構(gòu)建的質(zhì)粒見(jiàn)表3，使用的引物序列見(jiàn)表2，其中引物的命名對(duì)應(yīng)于激活galP基因過(guò)程中所使用的引物的名稱，僅將galP替換為dcuC。
[0178]表1、生產(chǎn)丁二酸的重組大腸桿菌
[0179]
【權(quán)利要求】
1.一種重組大腸桿菌，所述大腸桿菌中含有如下修飾: (1)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中所涉及的基因表達(dá)的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制， (2)pflB和/或adhE基因表達(dá)的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制， (3)IdhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制，和 (4)galP基因和/或外源gif基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或galP基因和/或外源gif基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)； 其中所述大腸桿菌還含有如下的一或多種修飾: (a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和 (b)SthA基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或SthA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
2.權(quán)利要求1的大腸桿菌，其中所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中所涉及的基因是選自如下的一或多種基因:編碼PTS系統(tǒng)酶I的基因ptsl、編碼PTS系統(tǒng)酶Hpr的基因ptsH、編碼PTS系統(tǒng)酶IIAele的基因err和編碼PTS系統(tǒng)酶IICBele的基因ptsG。
3.權(quán)利要求1或2的大腸桿菌，其中所述磷酸戊糖途徑中所涉及的基因是選自如下的一或多種基因:編碼轉(zhuǎn)酮醇酶的基因tktA、編碼6-磷酸葡萄糖脫氫酶的基因zwf、編碼6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的基因pgl、編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的基因gnd、編碼5-磷酸核糖異構(gòu)酶的基因rp1、編碼5-磷酸核酮糖差向異構(gòu)酶的基因rpe和編碼轉(zhuǎn)醛醇酶的基因talBo
4.權(quán)利要求3的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中SthA基因和tktA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或SthA基因和tktA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌還含有如下的修飾: (5)ackA和pta基因表達(dá)的抑制、和/或ackA和pta基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制； (6)aceBA基因簇表達(dá)的增強(qiáng)、和/或aceBA基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)； (7)dcuC基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或dcuC基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和 (8)mgsA基因表達(dá)的抑制、和/或mgsA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中還含有突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的如下位置的位置上含有修飾:T81、Ρ275和Α358，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的，其中在對(duì)應(yīng)于Τ81的位置上的修飾是用I置換Τ，在對(duì)應(yīng)于Ρ275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對(duì)應(yīng)于Α358的位置上的修飾是用V置換Α， 任選地，所述大腸桿菌中所述突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
7.權(quán)利要求6的大腸桿菌，其中所述突變的IpdA基因位于質(zhì)?；蛉旧w中。
8.權(quán)利要求6的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌以保藏號(hào)CGMCC7260保藏于CGMCC。
9.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌還含有如下的修飾:(9)pck基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或pck基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
10.權(quán)利要求9的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌以保藏號(hào)CGMCC7259保藏于CGMCC。
11.權(quán)利要求9的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌還含有如下修飾: (10)adhE基因表達(dá)的抑制、和/或adhE基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；和 (11)tdcDE基因簇表達(dá)的抑制、和/或tdcDE基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
12.權(quán)利要求11的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌以保藏號(hào)CGMCC7550保藏于CGMCC。
13.權(quán)利要求9的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌還含有如下的遺傳改造:aceEF基因簇表達(dá)的增強(qiáng)、和/或aceEF基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
14.生產(chǎn)丁二酸的方法,所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的大腸桿菌。
15.權(quán)利要求1- 13任一項(xiàng)的大腸桿菌在生產(chǎn)丁二酸中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104178443SQ201310198953
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2013年5月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月24日
【發(fā)明者】張學(xué)禮, 朱欣娜, 徐洪濤, 譚在高 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所