專利名稱：連續(xù)流pcr與毛細管電泳功能集成的微流控芯片裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
連續(xù)流PCR與毛細管電泳功能集成的微流控芯片裝置技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于分子生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種連續(xù)流PCR與毛細管電泳功能集成的微流控芯片裝置。
背景技術(shù)：
[0002]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)又被稱為無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術(shù)，是一種體外快速擴增DNA技術(shù)，作為一種主要的擴增復(fù)制手段，已經(jīng)在醫(yī)學(xué)診斷、基因分析、法醫(yī)鑒定等廣泛領(lǐng)域得到應(yīng)用，逐漸成為核酸分析和擴增的核心技術(shù)之一，并給基因相關(guān)研究帶來了深遠的影響。[0003]PCR技術(shù)通過調(diào)控聚合酶在DNA某些位點的活性來操縱DNA分子復(fù)制，該反應(yīng)具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點，并且能在數(shù)小時內(nèi)將試管內(nèi)所要研究的目的DNA分子或者片斷，擴增復(fù)制出幾十萬乃至幾百萬倍在一定的檢測儀器下用肉眼能夠直接觀察和判斷。PCR技術(shù)能夠從微量的樣品中擴增出足夠量的DNA分子供分析研究和檢測鑒定，實現(xiàn)痕量樣品的分析與檢測。過去幾天甚至幾個星期才能完成的樣品分析過程，用PCR技術(shù)幾個小時便可完成。[0004]隨著集成電路和微電子機械系統(tǒng)(Micro Electro Mechanicals system,MEMS)技術(shù)的日趨成熟，以硅/玻璃/聚合物為基底材料的PCR生物芯片得到了飛速的發(fā)展，它們都具有集成化程度高、熱循環(huán)速率快、交互式污染小及樣品消耗少等優(yōu)點，使整個生化反應(yīng)過程集成化、微型化和連續(xù)化，將促進微全分析系統(tǒng)(MicroTotal Analysis system-μ TAS) 的真正實現(xiàn)，并對醫(yī)藥開發(fā)、病毒檢測、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷及食品與環(huán)境檢測等領(lǐng)域產(chǎn)生重大影響。[0005]隨著PCR芯片在諸多領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，以及人們對分析儀器集成化、微型化的要求，傳統(tǒng)的PCR擴增儀器己經(jīng)不能滿足人們對PCR反應(yīng)的需要，尋求一種更加有效、更集成化的PCR反應(yīng)裝置成為日益迫切的任務(wù)。MEMS技術(shù)和集成電路的飛速發(fā)展，為研制新型PCR 反應(yīng)裝置提供了有力的保障，促進了 PCR芯片研究的飛速發(fā)展。[0006]到目前為止，PCR生物芯片主要有兩種結(jié)構(gòu)形式①微反應(yīng)腔式PCR芯片(Micro chamber PCR chip, MC-PCR),②連續(xù)流動式 PCR 芯片(Continuous-flow PCR chip, CF-PCR)。[0007]微反應(yīng)腔式PCR芯片實際上是傳統(tǒng)PCR的微型化，它將反應(yīng)混合物固定在微反應(yīng)池中，通過在外部對微反應(yīng)池不斷的加熱與降溫，實現(xiàn)三個溫區(qū)溫度的循環(huán)，它是一種時域式PCR反應(yīng)裝置。MC-PCR芯片成本低，體積小，結(jié)構(gòu)簡單，熱循環(huán)次數(shù)不受限制，容易實現(xiàn)批量生產(chǎn)，易于制作成一次性PCR芯片。但是，微反應(yīng)池的尺寸常常限制了樣品的體積和反應(yīng)時間，其能量消耗主要受系統(tǒng)的熱容量所控制，加熱和冷卻的速度相對較慢，為了取得較快的加熱/冷卻速度，需要對系統(tǒng)熱容量進行精確的優(yōu)化。[0008]鑒于微反應(yīng)腔式PCR芯片存在的問題，研究人員設(shè)計了連續(xù)流動式PCR芯片，主要工作原理是擴增試劑在PCR反應(yīng)所需的三個固定溫區(qū)內(nèi)連續(xù)流動，樣品在每溫區(qū)滯留的時間由其流經(jīng)的路程決定，每流過三個溫區(qū)就完成了一次溫度循環(huán)，即完一次擴增。CF-PCR 芯片利用空域方式實現(xiàn)PCR反應(yīng)，已成為PCR芯片的重要研究方向之一。CF-PCR芯片的主要優(yōu)點包括(I)擴增反應(yīng)所需的加熱/冷卻速度僅由混合物的流動速度來控制，不受系統(tǒng)的熱容量所限制。(2)操縱小體積樣品液體運動時，不僅方便易行，且密閉性良好，可有效避免樣品溶液的蒸發(fā)。(3)可通過連續(xù)提供不同生物樣品的方法，實現(xiàn)不同生物樣品的連續(xù)擴增，這不僅大大節(jié)省了反應(yīng)時間，而且簡化了操作程序。(4)PCR混合物的體積可在μ -ml 量級范圍內(nèi)改變。(5)利用CF-PCR芯片，可以把樣品制備、PCR擴增以及產(chǎn)物檢測等多項功能集成在一起，以連續(xù)流動的方式進行快速的、集成化分析。[0009]目前，CF-PCR芯片可分為基于MEMS技術(shù)的片式芯片和非芯片式兩種。前者是通過微加工技術(shù)將微通道加工在硅/玻璃/聚合物襯底材料上，集成化程度高，系統(tǒng)所占空間體積較小。1998年，Martin U. Kopp等首次提出了一種CF-PCR芯片，該芯片的三個溫度區(qū) (95°C、77t^P60°C )分別利用了三個恒溫銅塊來實現(xiàn)加熱，Pt電阻溫度傳感器固定在玻璃的背面，由恒流泵驅(qū)動樣品和緩沖液在微通道內(nèi)的流動。該系統(tǒng)最快可在90s內(nèi)實現(xiàn)20個循環(huán)。根據(jù)實驗要求將芯片加工成“蜿蜒”型或“螺旋”型通道，其循環(huán)數(shù)目通常是不可改變。[0010]為了使循環(huán)數(shù)目可調(diào)節(jié)，有人提出基于毛細管的單向型CF-PCR芯片。這種形式的PCR擴增體系把毛細管環(huán)繞在PCR擴增所需的3個恒溫系統(tǒng)上，循環(huán)數(shù)目易于改變。這種非芯片連續(xù)流動式PCR的3個溫度帶總是呈圓(柱)形式，這可避免已解鏈的單鏈DNA樣品經(jīng)過延伸溫度 帶時，可能與模板鏈或它們的互補鏈結(jié)合形成雙鏈而降低PCR擴增效率。但是，該結(jié)構(gòu)中的3個恒溫體系大都采用熱容較大的液體浴或者金屬塊來實現(xiàn)，能量消耗較大，不易利用電池為PCR裝置提供能量，不能實現(xiàn)便攜式連續(xù)流動PCR微裝置。[0011]毛細管電泳(capillary Electrophoresis,CE)是以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的液相分離分析技術(shù)，它使分析科學(xué)從微升量級進入納升水平，并使單細胞分析、乃至單分子分析成為可能。電泳的宏觀表現(xiàn)是指帶電粒子在一定介質(zhì)中因電場作用而發(fā)生定向運動的物理現(xiàn)象，這種電遷移現(xiàn)象被用于物質(zhì)的分離，形成為一系列電泳技術(shù)。電泳的基本原理是利用不同物質(zhì)分子的相對分子質(zhì)量、帶電量和體積等存在差異，在外加電場的作用下受到不同的電場力和阻力，使得不同分子具有不同的運動狀態(tài)，如速度、運動方向和位置的不同，通過適當(dāng)?shù)氖侄渭皺z測設(shè)備就可以分辨出不同的分子，實現(xiàn)物質(zhì)的成分分析。當(dāng)一荷電粒子置于電場中時，它受到一個正比于它的有效電荷q和電場強度E產(chǎn)生的力F作用，S卩F=qE ;在電場作用下，荷電粒子以速度V作平移運動，與此同時它又受到一個與其速度成正比的粘滯阻力(F’ )的作用，即F’ =fv, f為比例常數(shù)，稱為平動摩擦系數(shù)，與粒子大小和形狀有關(guān)。當(dāng)這兩個作用力相對平衡時，F(xiàn)=F’，粒子以穩(wěn)態(tài)速度V’運動， 于是V’=qE/f,對于球形粒子ν’=( ε ξ eE)/6 π η ;對于棒狀粒子V’= ( ε ξ eE) /4 π η, 其中rI為介質(zhì)粘度，ξ e為zeta電勢。[0012]由此可見，荷電粒子在電場中的遷移速度，除了與電場強度和介質(zhì)特性有關(guān)外，還與粒子的有效電荷、大小及其形狀有關(guān)。因此，粒子的大小和形狀，以及有效電荷的差異，就構(gòu)成了電泳的分析基礎(chǔ)。毛細管電泳芯片是在常規(guī)毛細管電泳理論和技術(shù)的基礎(chǔ)上利用微機械加工(MEMS)技術(shù)，在硅、玻璃、塑料、橡膠等為材料的基片上形成微細溝道，然后用蓋片將管道封接，在外加電場的作用下，通過不同的管道、反應(yīng)器、檢測單元等的設(shè)計和布局，實現(xiàn)樣品的進樣、反應(yīng)、分離和檢測。整個過程可以在一塊幾平方厘米的基片上得以實現(xiàn)。[0013]毛細管電泳芯片與傳統(tǒng)毛細管相比具有以下優(yōu)點1、減少了樣品、緩沖液用量、 可以節(jié)約試劑用量，減少廢液產(chǎn)生量，降低環(huán)境污染。2、比傳統(tǒng)的毛細管散熱能力強，可以進一步提高電場的強度，達到高速高效分離。3、可制得高性能、連通的管道網(wǎng)絡(luò)。4、采用 MEMS技術(shù)可以將反應(yīng)器、過濾器甚至檢測器等集成在一個芯片上，使得進樣、反應(yīng)、分 離、檢測等過程能在一個芯片中進行，即所謂的芯片實驗室(lab-on-a-chip)，達到小型化、系統(tǒng)化、集成化的目的。5、利用MEMS技術(shù)可以在一個基片上制作微管道陣列，可同時對一系列樣品進行分離和分析，具有并行處理的能力。6、利于低成本大規(guī)模生產(chǎn)。[0014]毛細管電泳芯片通常設(shè)計有進樣溝道和分離溝道，如豎向的溝道為進樣溝道，橫向的溝道為分離溝道，進樣溝道與分離溝道交叉成“十”字型，交叉處為樣品進樣口，在溝道的頂端設(shè)計了四個儲液池，分別是樣品池、緩沖液池、樣品廢液池和廢液池，微溝道長度一般為3-20厘米，寬為10-100微米，深為10-100微米，檢測口設(shè)在距離廢液池O. 1_10厘米處。[0015]毛細管電泳芯片的材料有單晶硅、無定形硅、玻璃、石英、金屬和有機聚合物，如環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)、環(huán)烯烴共聚物 (COC)等。材料的選擇主要取決于其機械強度、化學(xué)穩(wěn)定性、光學(xué)性能、生物兼容性、易加工、 容易鍵合、熱傳導(dǎo)率和絕緣性。表I為各種材料作為毛細管電泳芯片的性能對比結(jié)果。[0016]表I各種材料作為毛細管電泳芯片的性能對比結(jié)果[0017]單晶硅具有強度好、耐腐蝕等優(yōu)點，但是硅是半導(dǎo)體，實驗表明，硅在外加電壓不到IOOOv時便會被擊穿，此外，深度刻蝕困難。玻璃和石英則是應(yīng)用最多的基片材料，因為玻璃和石英的微加工技術(shù)較為成熟，它們的光學(xué)、電學(xué)和化學(xué)性能較好，有較多的表面鍵合技術(shù)，封裝較容易，并且具有較好的散熱性能，電泳分離時產(chǎn)生的焦耳熱能得到有效的散發(fā)，可以在通道中施加較高的驅(qū)動電壓。[0019]微流動通道不僅提供流體流動和進行微流控操作的場所，而且經(jīng)過特殊設(shè)計的微通道網(wǎng)絡(luò)本身可以作為微流體控制的一種手段。毛細管電泳芯片的基本通道設(shè)計主要有十字形通道、T形和雙τ形等形式。由于τ形通道很難控制進入分離通道中的樣品量和形狀， 在芯片電泳時很少有人使用，但在混合和反應(yīng)進樣中應(yīng)用較多。十字形通道與雙τ形通道的進樣方式基本相同，十字型電泳芯片豎向兩個溝道與橫向分離溝道相交于同一點，而雙τ 形電泳芯片豎向兩個溝道與分離溝道相交于不同的點。設(shè)計雙T型溝道的目的是保證在交叉口處有足夠的樣品量，降低對檢測器靈敏度的要求。[0020]根據(jù)電壓調(diào)節(jié)的不同，又可以分為簡單進樣(floating injection)、門進樣 (gated injection)和收縮進樣(pinched injection)三種方式。十字通道進樣是毛細管電泳中最為常用的進樣方法，該進樣系統(tǒng)由垂直交叉的兩條通道(進樣通道和分離通道)組成，通過電壓在進樣通道和分離通道之間的切換可以實現(xiàn)進樣操作，具有方便、快速、進樣體積小及易自動化的特點。[0021]最簡單的十字通道進樣方法被稱為簡單進樣法，其操作過程分為充樣和進樣(含分離)兩步，其中緩沖液池、試樣池、兩個廢液池為試劑槽，也是高電壓電極的引入點。試劑首先被注入試樣池，在試樣池和與其水平的廢液池之間施加高電壓，為了遏制樣品溶液向緩沖液池和垂直方向的廢液池方向擴散，在緩沖液池和垂直方向的廢液池之間也加上一定的電壓，使樣品主要從試樣池流向與其水平的廢液池。在電滲流的作用下，試樣由試樣池流向與其水平的廢液池的過程中，將十字交叉口處的通道充滿試樣。進入分離階段時，將電壓切換到緩沖液池和垂直方向的廢液池之間，使儲存在十字交叉口處的一小段試樣溶液在電滲流的推動下進入十字交叉口到垂直方向的廢液池之間的分離通道，樣品通過細長的毛細管后就實現(xiàn)了堿基片段的分離。分離通道接近垂直方向的廢液池的附近處設(shè)置檢測點，就可以檢測出DNA片段的信息。[0022]微全分析系統(tǒng)(μ TAS)是將樣品提取、擴增、分離、檢測等多種微分析操作單元集成在一個系統(tǒng)中，PCR芯片做為一種有效的擴增工具，是微全分析系統(tǒng)的重要組成部分。目前，PCR芯片研究的發(fā)展趨勢除了實現(xiàn)快速高效的擴增之外，就是通過和其它芯片(如毛細管電泳芯片或雜交芯片等)的聯(lián)接，實現(xiàn)全過程自動控制的微全分析，將對醫(yī)藥開發(fā)、病毒檢測、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、法醫(yī)鑒定及食品與環(huán)境檢測等領(lǐng)域產(chǎn)生重大影響。連續(xù)流動式PCR芯片(CF-PCR)是一種動態(tài)、快速的PCR芯片，它比其它類型的PCR芯片更易與生物芯片集成，從而實現(xiàn)整個生化分析過程的集成化。目前，與PCR擴增單元集成在一起的主要是毛細管電泳芯片。毛細管電泳(capillary Electrophoresis, CE)是以毛細管為分離通道、高壓直流電場為驅(qū)動力的液相分離分析技術(shù)，它使分析科學(xué)從微升量級進入納升水平， 并使單細胞分析乃至單分子分析成為可能，并且兩者的集成可以減少操作步驟，顯著的降低分析過程中出現(xiàn)的誤差。本發(fā)明因此而來。發(fā)明內(nèi)容[0023]本發(fā)明目的在于提供一種連續(xù)流PCR與毛細管電泳功能集成的微流控芯片裝置， 解決了現(xiàn)有技術(shù)中連續(xù)流PCR擴增和毛細管電泳儀器分析耗費較多DNA檢測的試劑和儀器成本，不利于儀器小型化和便攜式等問題。[0024]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是[0025]一種連續(xù)流PCR與毛細管電泳功能集成的微流控芯片裝置，包括連續(xù)流動式PCR 芯片和毛細管電泳芯片，其特征在于所述連續(xù)流動式PCR芯片的輸出通道直接連入毛細管電泳芯片的試樣池內(nèi)，所述毛細管電泳芯片設(shè)置有進樣通道和分離通道，所述進樣通道和分離通道呈十字交叉，所述進樣通道的頂端為試樣池和樣品廢液池，所述分離通道的頂端為緩沖液池和廢液池。[0026]優(yōu)選的，所述裝置為基片_蓋片復(fù)合結(jié)構(gòu)，基片上設(shè)置蓋片，蓋片內(nèi)設(shè)置連續(xù)流動式PCR通道和毛細管電泳通道，基片與鍵合，基片背面設(shè)置加熱電極。[0027]優(yōu)選的，所述裝置為基片_蓋片復(fù)合結(jié)構(gòu)，基片上設(shè)置蓋片，蓋片內(nèi)設(shè)置連續(xù)流動式PCR通道，蓋片的PCR反應(yīng)腔下端設(shè)置加熱電極，并通過設(shè)置在蓋片與基片之間的隔膜隔離PCR反應(yīng)腔。[0028]優(yōu)選的，所述蓋片上端設(shè)置導(dǎo)入通孔和導(dǎo)出通孔，蓋片內(nèi)的CF-PCR微流通溝道的變性、退火、延伸三個溫度區(qū)域的長度比為2:2:5或者4:4:9。[0029]優(yōu)選的，所述蓋片內(nèi)的CF-PCR微流通溝道的寬度為1-200微米，深度為1_100微米。[0030]優(yōu)選的，所述試樣池、樣品廢液池、緩沖液池和廢液池的內(nèi)徑大小均在l_5mm范圍內(nèi)。[0031]本發(fā)明為實現(xiàn)分析過程的微型化和集成化，提出了將CF-PCR芯片與毛細管電泳芯片集成，并設(shè)計出CF-PCR-CE功能集成芯片，將DNA片段的進樣、擴增、分離和檢測等過程集成。CF-PCR與CE的連接方式是CF-PCR與CE做在一塊芯片上通過微通道連接。[0032]制作PCR微流控芯片的常用材料主要有硅、玻璃和高聚物等。[0033]硅是最常用的半導(dǎo)體材料，在PCR微流控芯片發(fā)展的過程中，起著極其重要的作用。目前PCR微流控芯片中的微反應(yīng)池/微反應(yīng)通道絕大多數(shù)都是由硅材料構(gòu)成的，這是因為硅材料具有優(yōu)良的化學(xué)惰性和熱傳導(dǎo)性，其熱導(dǎo)率為157W/(m · K)，與傳統(tǒng)的集成電路工藝的兼容性很好，便于集成。但是，硅基PCR微流控芯片的制作工藝較為復(fù)雜，并且容易碎，電絕緣性、透光性和生物兼容性都較差。[0034]玻璃也是早期常用的材料之一，它的透光性好，易于檢測，也有很好的絕緣性。 但是其刻蝕的成本較高，工藝較復(fù)雜。此外，玻璃的熱導(dǎo)率較低，普通玻璃熱導(dǎo)率一般為O.7 I. Iff/(m · K)，硼硅酸玻璃(Pyrex)的熱導(dǎo)率僅為O. 78ff/(m · K)。對于靜態(tài)微腔式 PCR微流控芯片來說，硅和玻璃具有相對較好的導(dǎo)熱性能，適宜用作基底材料，當(dāng)溫度循環(huán)變化時，微腔內(nèi)混合液的溫度會隨溫控裝置的溫度迅速的變換。[0035]近年來，高分子聚合物作為PCR微流控芯片的襯底材料越來越受到研究者的重視，是由于其不需要鍍膜，制作方法簡單，材料價格便宜，成本大大的降低，促進了 PCR微流控芯片的推廣和應(yīng)用。常見的聚合物有下面幾種[0036]聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)俗稱有機玻璃,為剛性硬質(zhì)無色透明材料，透光率達92%，有良好的透光性和電絕緣性能。但是其表面硬度低，容易擦傷，耐熱不高。其熱導(dǎo)率為O. 19ff/(M · K)。[0037]聚碳酸酯(PC)是一種非晶體熱塑性工程塑料，熱導(dǎo)率為O. 19W/ (m · K)，軟化溫度為150°C，具有極為優(yōu)良的力學(xué)性能、熱穩(wěn)定性、透明度(透光率80% 90%)及生物兼容性等綜合性能，它已在許多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。[0038]聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)是最為常用的硅氧烷，其熱導(dǎo)率為O. 2ff/ (M · K)。具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、電絕緣性和耐候性、疏水性好，良好的透光性能， 并具有很高的抗剪切能力，可在_50°C 200°C下長期使用，還具有良好的生物兼容性。聚酰亞胺(PD具有良好的力學(xué)性能、電絕緣性、耐熱性和高的尺寸穩(wěn)定性等，也正是由于PI 的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(350°C )很高，在波長為600 3000nm范圍內(nèi)都具有高的透明度，在集成DNA分析微芯片中有可能是PCR微芯片反應(yīng)池較好的候選材料。[0039]聚對苯二甲酸乙二酯(PET)是開發(fā)最早、產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的聚酯，它具有價格低廉、耐摩擦、尺寸穩(wěn)定性好、透明行好、電絕緣性能好、受溫度影響小、抗化學(xué)藥品穩(wěn)定性好、耐熱性高及韌性好等優(yōu)點，被越來越廣泛使用。目前，在PCR微流控芯片中，高聚物材料已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用。它們具有很多硅和玻璃不具有的優(yōu)點，如透光性能較好便于檢測，熱穩(wěn)定性高、化學(xué)穩(wěn)定性高、尺寸穩(wěn)定性高、具有優(yōu)良的生物兼容性，加工簡便、成本低廉，便于大批量生產(chǎn)。[0040]各種材料有不同的應(yīng)用，根據(jù)需要選擇不同的芯片材料。[0041]相對于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點是[0042]本發(fā)明采用CF-PCR-CE功能集成芯片，其中連續(xù)流式PCR微流控芯片使得熱容降低，升/降溫速率有了大幅度的提高(一般為15-40度/s)，而且微流控通道中的運動增加了分子之間的碰撞，反應(yīng)時間也相應(yīng)的成倍縮短。微流控芯片的通道尺寸一般為微米量級甚至更低，從而減少了反應(yīng)試劑的消耗。[0043]本發(fā)明CF-PCR-CE功能集成芯片易于集成化，提高自動化程度和全過程運行的速度。將PCR和毛細管電泳集成減少了操作步驟，便于儀器的小型化和便攜式。由于儀器功能的集成化和便于工程實現(xiàn)，減少了 DNA檢測的試劑和儀器成本。


[0044]
以下結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述[0045]圖I為本發(fā)明CF-PCR-CE芯片結(jié)構(gòu)示意圖；[0046]圖2為本發(fā)明加熱集成CF-PCR-CE芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；[0047]圖3為本發(fā)明加熱集成CF-PCR-CE芯片的另一結(jié)構(gòu)示意圖；[0048]圖4為本發(fā)明CF-PCR-CE芯片結(jié)構(gòu)的詳細結(jié)構(gòu)示意圖。[0049]I為CE芯片；2為CF-PCR芯片；11為樣品池；12為樣品廢液池；13為緩沖池；14 為廢液池；21為變性區(qū)；22為退火區(qū)；23為延伸區(qū)；24為微泵；25為導(dǎo)入通孔；26為導(dǎo)出通孔；3為蓋片；4為基板；5為連續(xù)流動式PCR通道；6為加熱電極。
具體實施方式
[0050]以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進一步說明。應(yīng)理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。[0051]實施例ICF-PCR-CE功能集成芯片及其制備[0052]I、CF-PCR-CE 芯片結(jié)構(gòu)[0053]利用玻璃的良好的光學(xué)性能和PDMS便于微通道的形成價格便宜的特性，制作玻璃-PDMS結(jié)構(gòu)的微流通芯片。因為進行PCR需要溫度，或者將加熱器和溫度傳感器集成在芯片上，或者將加熱器和溫度傳感器與芯片分離。將加熱器和溫度傳感器與芯片分離的結(jié)構(gòu)如圖所示。利用軟光刻技術(shù)，在上層PDMS蓋片上制作出可選擇擴增數(shù)目的微流通循環(huán)與分離溝道，并通過打孔技術(shù)制作出導(dǎo)入和導(dǎo)出通孔，采用鍵合技術(shù)與下層玻璃基片鍵合在一起制成微流通溝道芯片。然后將芯片固定在外部的加熱器和傳感器上，用以實現(xiàn)變性、退火、延伸三個溫度區(qū)域的溫度檢測與控制。[0054]將加熱器和溫度傳感器集成在芯片上，兩者都含有PDMS蓋片和玻璃基片。PDMS蓋片中有適當(dāng)高度的PCR反應(yīng)腔室；加熱電極為Pt、銅、鋁、氧化銦錫等。第一種結(jié)構(gòu)如圖2所示，電極位于PCR反應(yīng)腔正下面，由一層位于PDMS蓋片與玻璃基片間的PDMS薄膜隔開；第二種結(jié)構(gòu)電極位于PCR反應(yīng)腔正下方玻璃基底的背面，PDMS薄膜依然處于PDMS蓋片與玻璃基片間，如圖3所示。[0055]2、芯片微流通道設(shè)計[0056]詳細結(jié)構(gòu)如圖4所示，根據(jù)一般生物樣品對擴增循環(huán)的需要，設(shè)計的循環(huán)數(shù)在 15-40個循環(huán)之間，CF-PCR微流通溝道的變性、退火、延伸三個溫度區(qū)域的長度比約為 2:2:5或者4:4:9，溝道設(shè)計的寬度為1-200微米，寬度為1_100微米，溝間距與寬度相同。 將溝道的彎曲處設(shè)計成圓弧形，可以使試樣更加暢通的流經(jīng)微循環(huán)溝道，具有盡可能少的 “死區(qū)”，更有利于形成連續(xù)流動。電泳部分的儲液池大小為l_5mm。[0057]3、芯片加工流程[0058](I)掩膜制作用CorelDRAW軟件分別繪制出流體通道構(gòu)型的微流控芯片圖形，用高分辨率激光照排機將繪制好的芯片圖形打印到照相底片上，制得光刻掩膜。[0059](2)基片的處理用濃H2S04浸泡拋光片以除去其表面油污，用自來水沖洗，吹干。 再用濃NaOH溶液浸泡，使其表面的羥基暴露出來，以便于光膠和玻璃之間的結(jié)合。[0060](3)涂膠用勻膠機進行勻膠(30s，1000RPM)，將AZ-P4620光刻膠均勻的涂覆在基片上。在烤膠機上80°C加熱45min以除去溶劑。[0061](4)曝光與顯影掩膜用石英片壓在光膠層上,曝光99s (365nm, 3. 07mW/cm2),用配制好的顯影液(VAZ 400K:VH20=1:2)進行顯影，2min左右可完全顯影。[0062](5)堅膜在110°C下加熱25min，使光膠回軟，時陽模的邊角形成圓弧形，得到用于制作PDMS芯片的光膠陽模。[0063](6)光膠陽膜的處理將光膠陽膜用三甲基氯硅烷蒸氣熏2_3min，然后用自來水沖洗干凈。[0064](7)模塑法加工芯片將20:1配比的PDMS混合物傾倒在流體通道光膠陽模上，用勻膠機甩PDMS，得到大約300nm厚的PDMS膜，加熱固化(80°C，30min)。將帶有流體通道的 PDMS芯片從光膠膜上撕下，打孔。在顯微鏡下將其與PDMS薄膜對齊、貼合，加熱完成相互間封合(80°C，lh)。[0065]上述實例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求1.一種連續(xù)流PCR與毛細管電泳功能集成的微流控芯片裝置，包括連續(xù)流動式PCR芯片(2)和毛細管電泳芯片(I )，其特征在于所述連續(xù)流動式PCR芯片的輸出通道直接連入毛細管電泳芯片的試樣池(11)內(nèi)，所述毛細管電泳芯片設(shè)置有進樣通道和分離通道，所述進樣通道和分離通道呈十字交叉，所述進樣通道的頂端為試樣池(11)和樣品廢液池(12) ，所述分離通道的頂端為緩沖液池(13)和廢液池(14)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的連續(xù)流PCR與毛細管電泳功能集成的微流控芯片裝置，其特征在于所述裝置為基片-蓋片復(fù)合結(jié)構(gòu)，基片(4)上設(shè)置蓋片(3)，蓋片內(nèi)設(shè)置連續(xù)流動式 PCR通道(5)和毛細管電泳通道，蓋片與基片鍵合，基片背面設(shè)置加熱電極(6)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的連續(xù)流PCR與毛細管電泳功能集成的微流控芯片裝置，其特征在于所述裝置為基片-蓋片復(fù)合結(jié)構(gòu)，基片上設(shè)置蓋片，蓋片內(nèi)設(shè)置連續(xù)流動式PCR通道，蓋片的PCR反應(yīng)腔下端設(shè)置加熱電極，并通過設(shè)置在蓋片與基片之間的隔膜隔離PCR反應(yīng)腔。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的連續(xù)流PCR與毛細管電泳功能集成的微流控芯片裝置，其特征在于所述蓋片上端設(shè)置導(dǎo)入通孔和導(dǎo)出通孔，蓋片內(nèi)的CF-PCR微流通溝道的變性區(qū)(21)、退火區(qū)(22)、延伸區(qū)(23)的長度比為2:2:5或者4:4:9。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的連續(xù)流PCR與毛細管電泳功能集成的微流控芯片裝置，其特征在于所述蓋片內(nèi)的CF-PCR微流通溝道的寬度為1-200微米，深度為1-100微米。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的連續(xù)流PCR與毛細管電泳功能集成的微流控芯片裝置，其特征在于所述試樣池、樣品廢液池、緩沖液池和廢液池的內(nèi)徑大小均在l_5mm范圍內(nèi)。
專利摘要本實用新型公開了一種連續(xù)流PCR與毛細管電泳功能集成的微流控芯片裝置，包括連續(xù)流動式PCR芯片和毛細管電泳芯片，其特征在于所述連續(xù)流動式PCR芯片的輸出通道直接連入毛細管電泳芯片的試樣池內(nèi)，所述毛細管電泳芯片設(shè)置有進樣通道和分離通道，所述進樣通道和分離通道呈十字交叉，所述進樣通道的頂端為試樣池和樣品廢液池，所述分離通道的頂端為緩沖液池和廢液池。該裝置提高DNA檢測的自動化程度和全過程運行的速度，減少了操作步驟，便于儀器的小型化和便攜式。
文檔編號C12M1/34GK202744555SQ20122036317
公開日2013年2月20日 申請日期2012年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月19日
發(fā)明者楊楠, 艾洪新, 何越, 臧伯瑋 申請人:凱晶生物科技(蘇州)有限公司