專利名稱：高產酸性糖苷水解酶的分枝桿菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物領域，具體地涉及高產酸性糖苷水解酶的菌株。
背景技術：
在植物細胞壁中，纖維素和半纖維素是自然界中最豐富的可再生的生物質資源；其結構與組成十分復雜。但這一重要的可再生資源一直難以得到有效的利用。尤其在飼料行業(yè)，由于動物胃腸道處于酸性PH下，需要添加大量的微生物來源的酸性糖苷水解酶，例如纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等復合酶進行飼料有效利用。嗜酸菌是一類極其重要的微生物，廣泛分布在酸性礦山廢水、含硫溫泉和土壤中。其中，酸性礦山廢水PH值通常在3以下，并含有高濃度的鐵、鋁、銅等重金屬陽離子和硫酸根陰離子。嗜酸菌分泌的胞外酶往往是相應的嗜酸酶。多種嗜酸酶已經被分離純化，如用于淀粉降解的嗜酸淀粉酶、嗜酸木聚糖酶、嗜酸甘露聚糖酶以及嗜酸纖維素酶。其在酸性條件下也具有較高活力，這些優(yōu)良的酶學性質使其在飼料、能源工業(yè)等領域具有潛在的應用價值。嗜酸菌作為極端微生物的重要類群，在工業(yè)生產及人類生活中發(fā)揮著巨大的作用。但目前，對嗜酸菌的研究還十分有限，只對少數(shù)幾種菌的生理生化和分子遺傳學特征進行了研究，而對許多在自然界發(fā)揮著重要作用的嗜酸菌知之甚少。因此，還需要對嗜酸菌進行更為廣泛深入的研究，以真正發(fā)揮其科學價值和應用價值。本發(fā)明從江西鈾礦微生物浸鈾尾液(PH2. 0-3. O)這一極端嗜酸環(huán)境中分離嗜酸菌株，并利用液體發(fā)酵的方法分析其產酶情況，結果發(fā)現(xiàn)分枝桿菌Mycobacterium sp. RBS-4產豐富的糖苷水解酶,其最適PH3. O - 4. O,在酸性和中性條件下具有很高的酶活力。為研究嗜酸菌的產酶特性及后期應用提供了良好的科研材 料。

發(fā)明內容
基于目前對嗜酸菌研究不足，本發(fā)明的目的是從特色的嗜酸環(huán)境江西鈾礦微生物浸鈾尾液中分離產酸性酶的菌株，從而研究嗜酸及產酶機制。本發(fā)明提供了高產酸性糖苷水解酶的菌株，該細菌菌株命名為分枝桿菌(Mycobacterium sp. ) RBS-4,于2012年4月11日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，100101 )，其保藏編號是CGMCC No. 5986。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，從江西鈾礦微生物浸鈾尾液分離產酸性糖苷水解酶菌株，其分離方法是取樣品20mL，加入到80mL富集培養(yǎng)基(pH3. O)中30°C、160rpm振蕩培養(yǎng)72h后，分別轉接至LB培養(yǎng)基以同樣的條件培養(yǎng)兩代，平行重復3次。取富集培養(yǎng)物在YF固體培養(yǎng)基和BSYG固體培養(yǎng)基進行劃線稀釋，獲得單菌落，多次重復劃線稀釋以獲得純培養(yǎng)，斜面保藏于4°C冰箱。本發(fā)明的再一目的是提供一種產酸性糖苷水解酶的液體發(fā)酵方法。
因此,本發(fā)明還提供了上述分枝桿菌Mycobacterium sp. RBS-4用于發(fā)酵制備酸性糖苷水解酶的應用。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，上述細菌在LB液體培養(yǎng)基(pH3. O)培養(yǎng)16h后獲得新鮮種子液，再將種子液按照1%的接種量轉入產酶培養(yǎng)基中，30°C，160rpm振蕩培養(yǎng)72h后，離心取上清液，利用不同糖苷水解酶標準測定方法測定其酶活，并利用不同pH緩沖液測定酶的最適pH。本發(fā)明首先所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有對嗜酸環(huán)境微生物分離，提供一種產酸性酶的菌株。本發(fā)明的菌株最適pH為3. 0，其產酶在pH3. O 4. O都有較高的酶活性；可使其在需求酸性環(huán)境的工業(yè)生產上應用。


圖1菌株RBS-4菌落及菌體形態(tài)；圖2菌株RBS-4所產葡萄糖苷酶的最適pH ；圖3菌株RBS-4所產a_半乳糖苷酶的最適pH ；圖4菌株RBS-4所產β -半乳糖苷酶的最適pH ；圖5菌株RBS-4所產甘露聚糖酶的最適pH。分枝桿菌(Mycobacterium sp. ) RBS-4,于2012年4月11日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，100101)，其保藏編 號是CGMCC No. 5986。
具體實施方式
實施例1菌株分離YF 液體培養(yǎng)基(300mL) :8ml HBS (50 X)(基礎鹽溶液)；0· 08g yeast extract ；0. 12g Fructose ；292ml distilled water ；0.4ml trace elements solution ；pH3. 0 (H2SO4)。富集培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2SO4 3.0，KCl 0. LK2HPO4 0· 5，MgSO4 ·7Η20 0. 5, Ca(NO3)2O. 01，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 3. 0，葡萄糖 2，pH 值 2· O 2. 5。分離培養(yǎng)基(g/L)=(NH4)2SO4 2. O, KCl 0. 1，MgS04 · 7H20 O. 25，Ca (NO3) 2 0.01，葡萄糖1. 0，酵母提取物0. 1，pH值2. 5 3. O。LB培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蒸餾水配制，pH值自然。取江西鈾礦微生物浸鈾的尾液20mL，加入到80mL富集培養(yǎng)基中30°C、160rpm振蕩培養(yǎng)72h后，挑取單菌落分別轉接至YF培養(yǎng)基以同樣的條件培養(yǎng)兩代，平行重復3次。取富集培養(yǎng)物在YF固體培養(yǎng)基進行劃線稀釋，獲得單菌落，再在LB固體培養(yǎng)基多次重復劃線稀釋以獲得純培養(yǎng)。利用體視顯微鏡和相差顯微鏡觀察分離到菌株的菌落形態(tài)和菌體形態(tài)。RBS-4單菌落分離于LB培養(yǎng)基，到2天時，可看見米粒大小的不規(guī)則白色菌落，周圍有白色菌絲深入培養(yǎng)基，菌落不隆起，粗糙，在培養(yǎng)基蓋有白色氣生菌絲。在顯微鏡下觀察，菌體呈現(xiàn)分枝狀，延伸不明顯(圖1)。本發(fā)明的菌株最適pH為3.0，生長溫度為30°C。經16SrDNA比對發(fā)現(xiàn)其屬于分枝桿菌Mycobacterium,因此，將菌株RBS-4命名為分枝桿菌Mycobacteriumsp. RBS-4ο實施例2菌株液體發(fā)酵產酶分析發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)=(NH4)2SO4 2. O，K2HPO41. O, ；MgS04 · 7H20 0.5;麥麩豆渣=1:1(總量 1%)，ρΗ 3.0。DNS法具體方法如下在pH4. 0，50°C條件下，ImL的反應體系包括100 μ L適當?shù)南♂屆敢海?0(^1^膠豆角，反應1011^11，加入1.51^ DNS終止反應，沸水煮5min。冷卻至室溫后于540nm測定OD值。I個酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出I μ mol還
原糖的酶量。pNPG法底物對硝基苯β -D葡萄糖苷(pNPG)或對硝基苯_ β -吡喃半乳糖苷，對硝基苯酚a -D吡喃半乳糖苷以2mM的濃度250uL溶于pH 4. O緩沖液中，加入250uL適當稀釋的酶液，在50°C反應IOmin后，加入1. 5mL IM Na2CO3，在405nm下測定OD值。酶活單位定義為在最適溫度和條件下，每分鐘釋放lumol pNP所需要的酶量(U/mL)。用滅過菌的牙簽挑取LB固體平板上的單菌落于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C、220r/min、150mL/500mL的條件下振蕩培養(yǎng)72h，培養(yǎng)過程中觀察菌體生長狀況。發(fā)酵液經尼龍絲網(wǎng)過濾、在4°C下10000r/min離心20min，上清液即為粗酶液，用于檢測α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、甘露聚糖酶等4種不同糖苷水解酶的酶活力。經測定，菌株培養(yǎng)72h后均可檢測到4中酶活力，分別為1.2,3. 1,2. 1,4. 5U/ml。實施例3不同酶的最適pH
分離純化α-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、甘露聚糖酶，在不同的PH下進行酶促反應以測定其最適pH。底物用不同pH的O. lmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中50°C下進行酶活力測定。結果(圖2)表明，α-半乳糖苷酶的最適pH為4.0，在ρΗ3· 5 6. 5有80%以上的相對酶活性。β _半乳糖苷酶pH為4. 0，在ρΗ3· 0 7· O有50%以上的相對酶活性。β -葡萄糖苷酶的最適pH為3. 0，在pH2. 5飛.O有60%以上的相對酶活性。甘露聚糖酶的最適PH為3. 5，在ρΗ3. (Γ7. O有40%以上的相對酶活性。以上結果表明，菌株RBS-4所產糖苷水解酶最適pH在酸性范圍內，并且在酸性及中性pH條件下具有較高的活性。
權利要求
1.高產酸性糖苷水解酶菌株，其特征在于，其保藏編號為CGMCCNo. 5986。
2.權利要求1所述高產酸性糖苷水解酶菌株用于發(fā)酵制備酸性糖苷水解酶的應用。
3.一種產酸性糖苷水解酶的液體發(fā)酵方法，其特征在于，其特征在于，所述方法包括步驟將權利要求1所述菌株在PH3. O的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16h后獲得新鮮種子液，再將種子液按照1%的接種量轉入產酶培養(yǎng)基中，30°C，160rpm振蕩培養(yǎng)72h后，離心取上清液，利用不同糖苷水解酶標準測定方法測定其酶活。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領域，具體地涉及高產酸性糖苷水解酶的菌株，其保藏編號為CGMCC No.5986。本發(fā)明首先所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有對嗜酸環(huán)境微生物分離，提供一種產酸性酶的菌株。本發(fā)明的菌株經鑒定為分枝桿菌，最適pH為3.0，其產酶在pH3.0～4.0都有較高的酶活性；可使其在需求酸性環(huán)境的工業(yè)生產上應用。
文檔編號C12N9/40GK103045513SQ201210556579
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月20日 優(yōu)先權日2012年12月20日
發(fā)明者李江, 劉亞潔, 呂飛龍, 王學剛, 孫占學, 徐玲玲, 史維俊, 徐蔚云, 石鵬君, 姚斌 申請人:東華理工大學