專利名稱：與二氫黃豆苷元合成有關(guān)的酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元活性的多肽、一種具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元活性的多肽、及一種具有以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚活性的多肽，并且涉及一種編碼上述多肽的多核苷酸。并且，本發(fā)明涉及一種使用上述多肽制備二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及雌馬酚的制備方法及在上述過程中使用的制備裝置，本發(fā)明還提供一種與上述內(nèi)容相關(guān)的技術(shù)。
背景技術(shù)：
一直以來，通常認(rèn)為異黃酮衍生物具有多種生理學(xué)和藥學(xué)活性，被用作食品原料和藥品原料。但是，隨著與異黃酮衍生物有關(guān)的功能的闡明，有報道指出并不是一直以來所 認(rèn)為的僅異黃酮衍生物具有雌激素樣活性，而是上述衍生物在各種腸內(nèi)細(xì)菌的作用下在菌體內(nèi)被代謝(生物合成)后生成了具有更強(qiáng)雌激素樣作用的雌馬酚，上述雌馬酚被釋放到菌體外，之后被腸吸收而在全身發(fā)揮雌激素作用。然而，并非所有人都有在腸內(nèi)產(chǎn)生雌馬酚的能力，雌馬酚的產(chǎn)生能力因人而異。例如，有些人在腸內(nèi)沒有雌馬酚產(chǎn)生菌，而有些人雖然在腸內(nèi)有雌馬酚產(chǎn)生菌但其雌馬酚產(chǎn)生能力較低。因此，在體內(nèi)有效利用雌馬酚對于面臨高齡化社會的日本等是重要的，特別是從應(yīng)對以骨質(zhì)疏松為代表的慢性老年性疾病方面考慮也是重要的。并且，考慮到如上所述的有些人內(nèi)在地含有雌馬酚產(chǎn)生腸內(nèi)細(xì)菌而有些人卻沒有的這一現(xiàn)實，需要研制一種能有效地人工生產(chǎn)雌馬酚的雌馬酚合成原料。在上述背景下，從提供一種雌馬酚合成原料這方面考慮，與上述生物合成通路有關(guān)的酶的鑒定及其使用是極其重要的。但是，對于生產(chǎn)或催化在上述生物合成通路中相關(guān)的幾個中間體的酶，尚無任何相關(guān)信息，因此人們期望能夠鑒定相關(guān)酶。專利文獻(xiàn)I :日本特開2006-296434號公報

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與用作雌馬酚合成原料的二氫黃豆苷元的合成有關(guān)的酶。具體而言，本發(fā)明的目的在于提供具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元活性的多肽。并且，本發(fā)明的目的在于提供編碼上述多肽的多核苷酸及與利用該多肽合成二氫黃豆苷元相關(guān)的技術(shù)等。另外，本發(fā)明的目的在于提供與用作雌馬酚合成原料的四氫黃豆苷元的合成有關(guān)的酶。具體而言，本發(fā)明的目的在于提供具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元活性的多肽。并且，本發(fā)明的目的在于提供編碼上述多肽的多核苷酸及與利用該多肽合成四氫黃豆苷元相關(guān)的技術(shù)等。
進(jìn)而，本發(fā)明的目的在于提供與雌馬酚合成有關(guān)的酶。具體而言，本發(fā)明的目的在于提供具有以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚活性的多肽。并且，本發(fā)明的目的在于提供編碼上述多肽的多核苷酸及與利用該多肽合成雌馬酚相關(guān)的技術(shù)等。進(jìn)而，本發(fā)明的目的在于提供在由黃豆苷元制備雌馬酚時所生成的二氫黃豆苷元和四氫黃豆苷元的制備方法即中間體的制備方法，及能夠利用所得的中間體制備雌馬酚的制備方法。并且，本發(fā)明的目的在于提供在上述制備中使用的制備裝置。本發(fā)明人等為了解決上述課題進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果成功地從雌馬酚產(chǎn)生腸內(nèi)細(xì)菌中分離出能夠合成二氫黃豆苷元的酶、能夠合成四氫黃豆苷元的酶及能夠合成雌馬酚的酶，用作合成雌馬酚的原料，并闡明了上述酶的結(jié)構(gòu)。另外，本申請發(fā)明人等通過進(jìn)一步的研究，利用上述酶成功地人工制備出二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及雌馬酚?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)并經(jīng)過進(jìn)一步改良完成了本發(fā)明。gp，本發(fā)明提供下述發(fā)明
項AL選自以下(Aa) (Ac)中的多肽(Aa)多肽，由序列號I所示的氨基酸序列組成；(Ab)多肽，由在序列號I所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的活性；(Ac)多肽，由與序列號I所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的活性。項A2.選自以下(Ad) (Af)中的多核苷酸(Ad)多核苷酸，由序列號4所示的核苷酸序列組成；(Ae)多核苷酸，編碼由序列號I所示的氨基酸序列組成的多肽；(Af)多核苷酸，與上述(Ad)或(Ae)的多核苷酸的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有以黃豆苷元為底物生成二氫黃豆苷元活性的多肽。項A3. —種表達(dá)載體,含有項A2所述的多核苷酸。項A4. —種重組細(xì)胞，是由項A3所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到的。項A5.如項A4所述的重組細(xì)胞,該重組細(xì)胞為細(xì)菌性原核細(xì)胞。項A6.如項A5所述的重組細(xì)胞，其中，細(xì)菌性原核細(xì)胞屬于乳球菌屬。項A7. —種多肽的制備方法，所述方法包括培養(yǎng)項A4至A6中任一項所述的細(xì)胞，得到具有以黃豆苷元為底物生成二氫黃豆苷元活性的多肽的步驟。項A8. —種多肽，由項A7所述的制備方法得到。項A9. —種二氫黃豆苷兀的制備方法,所述方法包括使項A I或A8所述的多肽、及NADPH及/或NADH作用于黃豆苷元的步驟。項A10. —種二氫黃S 苷兀的制備方法,所述方法包括使項A4至A6中任一項所述的細(xì)胞作用于黃豆苷元的步驟。項All. —種抗體，所述抗體與項Al所述的多肽或由項A2所述的多核苷酸編碼的多肽具有親和性。項A12. —種免疫學(xué)方法，用于檢測或測定項Al所述的多肽或由項A2所述的多核苷酸編碼的多肽，所述方法包括使受試樣品與項A 11所述的抗體相接觸的步驟。
項A13.如項A12所述的方法，其中，用作檢測或測定對象的多肽存在于細(xì)菌性原核細(xì)胞內(nèi)。項A14. —種探針，所述探針含有能與編碼項A I所述多肽的多核苷酸或項A2所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列。項A15. —種引物，所述引物含有能與編碼項A I所述多肽的多核苷酸或項A2所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列。項A16. —種使用項A14所述的探針檢測或測定編碼項Al所述的多肽的多核苷酸或項A2所述的多核苷酸的方法。項A17.如項A16所述的方法，其中，用作檢測或測定對象的多肽存在于細(xì)菌性原核細(xì)胞內(nèi)。項A18.如項A16所述的方法，包括使用PCR擴(kuò)增全部或部分編碼Al所述多肽的 多核苷酸或項A2所述的多核苷酸的步驟。項A19. —種二氫黃豆苷元合成酶組合物，其特征在于，含有項Al所述的多肽或項A2的多核苷酸編碼的多肽。項A20.如項A19所述的組合物，所述組合物進(jìn)一步含有NADPH及/或NADH。項A21. —種二氫黃豆苷兀合成原料組合物,其特征在于,含有(Ai)項Al所述的多肽或項A2的多核苷酸編碼的多肽； (Aii) NADPH 及 / 或 NADH ;及(Aiii)黃豆苷元。項A22. —種二氫黃豆苷兀合成原料組合物,其特征在于,含有(Aiv)項A4至A6中任一項所述的細(xì)胞；及(Aiii)黃豆苷元。項A23. —種二氫黃豆苷兀合成用試劑盒,所述試劑盒含有(Ai)項Al所述的多肽或項A2的多核苷酸編碼的多肽；(Aii) NADPH 及 / 或 NADH ;及(Aiii)黃豆苷元。項A24. —種二氫黃豆苷兀合成用試劑盒,所述試劑盒含有(Aiv)項A4至A6中任一項所述的細(xì)胞；及(Aiii)黃豆苷元。項A25. —種免疫學(xué)測定用試劑盒，用于測定項Al所述的多肽或項A2的多核苷酸編碼的多肽，所述試劑盒至少含有項All所述的抗體。項A26. —種PCR用試劑盒，用于檢測編碼項A I所述多肽的多核苷酸或項A2所述的多核苷酸，所述試劑盒至少含有項A15所述的引物。項A27.如項A26所述的鑒定用試劑盒，所述試劑盒用于鑒定含有編碼項Al所述多肽的多核苷酸或項A2所述的多核苷酸的細(xì)胞。項A28.如項A27所述的鑒定用試劑盒，所述試劑盒為PCR用試劑盒。項A29. —種二氫黃豆苷兀合成酶，由項Al所述的多肽組成。項BI.選自下述(Ba) (Be)中的多肽(Ba)多肽，由序列號I所示的氨基酸序列組成；
(Bb)多肽，由在序列號7所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性；(Be)多肽，由與序列號7所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性。項B2.選自以下(Bd) (Bf)中的多核苷酸(Bd)多核苷酸，由序列號10所示的核苷酸序列組成的；(Be)多核苷酸，編碼由序列號7所示的氨基酸序列組成的多肽； (Bf)多核苷酸，與上述(Bd)或(Be)的多核苷酸的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有以二氫黃豆苷元為底物生成四氫黃豆苷元活性的多肽。項B3. —種表達(dá)載體,含有項B2所述的多核苷酸。項B4. —種重組細(xì)胞，是由項B3所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到的。項B5.如項B4所述的重組細(xì)胞,該重組細(xì)胞為細(xì)菌性原核細(xì)胞。項B6.如項B5所述的重組細(xì)胞，其中，細(xì)菌性原核細(xì)胞屬于乳球菌屬。項B7. —種多肽的制備方法，所述方法包括培養(yǎng)項B4至B6中任一項所述的細(xì)胞，得到具有以二氫黃豆苷元為底物生成四氫黃豆苷元活性的多肽的步驟。項B8. —種多肽，由項B7所述的制備方法得到。項B9. —種四氫黃豆苷元的制備方法，所述方法包括使項B I或B8所述的多肽、及NADPH及/或NADH作用于二氫黃豆苷元的步驟。項B10. —種四氫黃豆苷元的制備方法，所述方法包括使項B4至B6中任一項所述的細(xì)胞作用于二氫黃豆苷元的步驟。項Bll. —種抗體，所述抗體與BI所述的多肽或由項B2所述的多核苷酸編碼的多肽具有親和性。項B12. —種免疫學(xué)方法，用于檢測或測定項BI所述的多肽或由項B2所述的多核苷酸編碼的多肽，所述方法包括使項Bll所述的抗體與受試樣品相接觸的步驟。項B13.如項B12所述的方法，其中，用作檢測或測定對象的多肽存在于細(xì)菌性原核細(xì)胞內(nèi)。項B14. —種探針，所述探針含有能與編碼項BI所述多肽的多核苷酸或項B2所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列。項B15. —種引物，所述引物含有能與編碼項BI所述多肽的多核苷酸或項B2所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列。項B16. —種使用項B14所述的探針檢測或測定編碼項BI所述多肽的多核苷酸或項B2所述的多核苷酸的方法。項B17.如項B16所述的方法，其中，用作檢測或測定對象的多肽存在于細(xì)菌性原核細(xì)胞內(nèi)。項B18.如項B16所述的方法，包括使用PCR擴(kuò)增全部或部分編碼BI所述多肽的多核苷酸或項B2所述的多核苷酸的步驟。項B19. —種四氫黃豆苷元合成酶組合物，其特征在于，含有項BI所述的多肽或項B2的多核苷酸編碼的多肽。
項B20.如項B19所述的組合物，所述組合物進(jìn)一步含有NADPH及/或NADH。項B21. —種四氫黃豆苷元合成原料組合物，其特征在于，含有(Bi)項BI所述的多肽或項B2的多核苷酸編碼的多肽；(Bii) NADPH 及 / 或 NADH ;及(Biii) 二氫黃豆苷元。項B22. —種四氫黃豆苷元合成原料組合物，其特征在于，含有(Biv)項B4至B6中任一項所述的細(xì)胞；及(Biii) 二氫黃豆苷元。 項B23. —種四氫黃豆苷元合成用試劑盒，所述試劑盒含有(Bi)項BI所述的多肽或項B2的多核苷酸編碼的多肽；(Bii) NADPH 及 / 或 NADH ;及(Biii) 二氫黃豆苷元。項B24. —種四氫黃豆苷元合成用試劑盒，所述試劑盒含有(Biv)項B4至B6中任一項所述的細(xì)胞；及(Biii) 二氫黃豆苷元。項B25. —種免疫學(xué)測定用試劑盒，用于測定項BI所述的多肽或項B2多核苷酸編碼的多肽，所述試劑盒至少含有項Bll所述的抗體。項B26. —種PCR用試劑盒，用于檢測編碼項BI所述多肽的多核苷酸或項B2所述的多核苷酸，所述試劑盒至少含有項B15所述的引物。項B27.如項B26所述的鑒定用試劑盒，所述試劑盒用于鑒定含有編碼項BI所述多肽的多核苷酸或項B2所述的多核苷酸的細(xì)胞。項B28.如項B27所述的鑒定用試劑盒，所述試劑盒為PCR用試劑盒。項B29. —種四氫黃豆苷元合成酶，由項BI所述的多肽組成。項CL選自下述(Ca) (Ce)中的多肽(Ca)多肽，由序列號13所示的氨基酸序列組成；(Cb)多肽，由在序列號13所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚的活性；(Ce)多肽，由與序列號13所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚的活性。項C2.選自下述(Cd) (Cf)中的多核苷酸(Cd)多核苷酸，由序列號16所示的核苷酸序列組成；(Ce)多核苷酸，編碼由序列號13所示的氨基酸序列組成的多肽；(Cf)多核苷酸，與上述(Cd)或(Ce)的多核苷酸的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有以四氫黃豆苷元為底物生成雌馬酚活性的多肽。項C3. —種表達(dá)載體,含有項C2所述的多核苷酸。項C4. 一種重組細(xì)胞，是由項C3所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到的。項C5.如項C4所述的重組細(xì)胞,該重組細(xì)胞為細(xì)菌性原核細(xì)胞。項C6.如項C5所述的重組細(xì)胞，其中，細(xì)菌性原核細(xì)胞屬于乳球菌屬。項C7. —種多肽的制備方法，所述方法包括培養(yǎng)項C4至C6中任一項所述的細(xì)胞，得到具有以四氫黃豆苷元為底物生成雌馬酚活性的多肽的步驟。項C8. —種多肽，由項C7所述的制備方法得到。項C9. 一種雌馬酚的制備方法，所述方法包括使項Cl或CS所述的多肽作用于四
氫黃豆苷元的步驟。項C10. —種雌馬酚的制備方法，所述方法包括使項C4至C6中任一項所述的細(xì)胞作用于四氫黃豆苷元的步驟。項Cll. 一種抗體，所述抗體與項Cl所述的多肽或由項C2所述的多核苷酸編碼的多肽具有親和性。項C12. —種免疫學(xué)方法，用于檢測或測定項Cl所述的多肽或由項C2所述的多核苷酸編碼的多肽，所述方法包括使項Cll所述的抗體與受試樣品相接觸的步驟。 項C13.如項C12所述的方法，其中，用作檢測或測定對象的多肽存在于細(xì)菌性原核細(xì)胞內(nèi)。項C14. 一種探針，所述探針含有能與編碼項Cl所述多肽的多核苷酸或項C2所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列。項C15. —種引物，所述引物含有能與編碼項Cl所述多肽的多核苷酸或項C2所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列。項C16. —種使用項C14所述的探針檢測或測定編碼項Cl所述多肽的多核苷酸或項C2所述的多核苷酸的方法。項C17.如項C16所述的方法，其中，用作檢測或測定對象的多肽存在于細(xì)菌性原核細(xì)胞內(nèi)。項C18.如項C16所述的方法，所述方法包括使用PCR擴(kuò)增全部或部分編碼Cl所述多肽的多核苷酸或項C2所述的多核苷酸的步驟。項C19. 一種雌馬酚合成酶組合物，其特征在于，含有項Cl所述的多肽或C2的多核苷酸編碼的多肽。項C20. —種雌馬酚合成原料組合物，其特征在于，含有(Ci)項Cl所述的多肽或項C2的多核苷酸編碼的多肽 '及(Cii)四氫黃豆苷元。項C21. —種雌馬酚合成原料組合物，其特征在于，含有(Ciii)項C4至C6中任一項所述的細(xì)胞；及(Cii)四氫黃豆苷元。項C22. —種雌馬酚合成用試劑盒，所述試劑盒含有(Ci)項Cl所述的多肽或項C2的多核苷酸編碼的多肽 '及(Cii)四氫黃S 苷兀。項C23. —種雌馬酚合成用試劑盒，所述試劑盒含有(Ciii)項C4至C6中任一項所述的細(xì)胞 '及(Cii)四氫黃豆苷元。項C24. —種免疫學(xué)測定用試劑盒，用于測定項Cl所述的多肽或項C2的多核苷酸編碼的多肽，所述試劑盒至少含有項Cll所述的抗體。項C25. —種PCR用試劑盒，用于檢測編碼項Cl所述多肽的多核苷酸或項C2所述的多核苷酸，所述試劑盒至少含有項C15所述的引物。項C26.如項C25所述的鑒定用試劑盒，所述試劑盒用于鑒定含有編碼項Cl所述多肽的多核苷酸或項C2所述的多核苷酸的細(xì)胞。項C27.如項C26所述的鑒定用試劑盒，所述試劑盒為PCR用試劑盒。項C28. —種雌馬酚合成酶，由項Cl所述的多肽組成。項Dl. —種四氫黃豆苷元的制備方法，所述方法包括以下(第I步驟)及(第2步驟)(第I步驟)通過使由下述(Aa) (Ac)中任一種多肽組成的酶、及NADPH及/或NADH作用于黃豆苷元，生成二氫黃豆苷元的步驟；(Aa)多肽，由序列號I所示的氨基酸序列組成； (Ab)多肽，由在序列號I所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的活性；(Ac)多肽，由與序列號I所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的活性。(第2步驟)通過使由下述(Ba) (Be)中任一種多肽組成的酶、及NADPH及/或NADH作用于二氫黃豆苷元，生成四氫黃豆苷元的步驟；(Ba)多肽，由序列號7所示的氨基酸序列組成；(Bb)多肽，由在序列號7所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性；(Be)多肽，由與序列號7所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性。項D2. —種產(chǎn)物,含有由項Dl所述方法制備的四氫黃豆苷兀。項D3. —種雌馬酚的制備方法，所述方法包括以下(第2步驟)及(第3步驟)(第2步驟)通過使由下述(Ba) (Be)中任一種多肽組成的酶、及NADPH及/或NADH作用于二氫黃豆苷元，生成四氫黃豆苷元的步驟；(Ba)多肽，由序列號7所示的氨基酸序列組成；(Bb)多肽，由在序列號7所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性；(Be)多肽，由與序列號I所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性。(第3步驟)通過使由下述(Ca) (Ce)中任一種多肽組成的酶、及NADPH及/或NADH作用于四氫黃豆苷元，制備雌馬酚的步驟；(Ca)多肽，由序列號13所示的氨基酸序列組成；(Cb)多肽，由在序列號13所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚的活性；(Ce)多肽，由與序列號13所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚的活性。項D4. —種產(chǎn)物，含有由項D3所述的方法制備的雌馬酚。項D5. —種雌馬酚的制備方法，所述方法包括(第I步驟) (第3步驟)。項D6. —種產(chǎn)物，含有由項D5所述的方法制備的雌馬酚。項D7. —種表達(dá)載體，含有選自下述(Ad) (Af)、(Bd) (Bf)及(Cd) (Cf) 中的至少一種多核苷酸(Ad)多核苷酸，由序列號4所示的核苷酸序列組成；(Ae)多核苷酸，編碼由序列號I所示的氨基酸序列組成的多肽；(Af)多核苷酸，與上述(Ad)或(Ae)的多核苷酸互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有以黃豆苷元為底物生成二氫黃豆苷元活性的多肽。(Bd)多核苷酸，由序列號10所示的核苷酸序列組成； (Be)多核苷酸，編碼由序列號7所示的氨基酸序列組成的多肽；(Bf)多核苷酸，與上述(Bd)或(Be)的多核苷酸互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有以二氫黃豆苷元為底物生成四氫黃豆苷元活性的多肽。(Cd)多核苷酸，由序列號16所示的核苷酸序列組成；(Ce)多核苷酸，編碼由序列號13所示的氨基酸序列組成的多肽；(Cf)多核苷酸，與上述(Cd)或(Ce)的多核苷酸互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有以四氫黃豆苷元為底物生成雌馬酚活性的多肽。項D8. —種重組細(xì)胞，由項D7所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到。項D9.如項D8所述的重組細(xì)胞,該重組細(xì)胞為細(xì)菌性原核細(xì)胞。項D10.如項D9所述的重組細(xì)胞，其中，細(xì)菌性原核細(xì)胞屬于乳球菌屬。項Dll. —種二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚的制備方法，所述制備方法包括以下(第4步驟) (第6步驟)中的至少2個步驟(第4步驟)通過在含有黃豆苷元的培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有(Ad) (Af)中任一種多核苷酸的重組細(xì)胞，生成二氫黃豆苷元的步驟(Ad)多核苷酸，由序列號4所示的核苷酸序列組成；(Ae)多核苷酸，編碼由序列號I所示的氨基酸序列組成的多肽；(Af)多核苷酸，與上述(Ad)或(Ae)的多核苷酸互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有以黃豆苷元為底物生成二氫黃豆苷元活性的多肽。(第5步驟)通過在含有二氫黃豆苷元的培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有(Bd) (Bf)中任一種多核苷酸的重組細(xì)胞，生成四氫黃豆苷元的步驟(Bd)多核苷酸，由序列號10所示的核苷酸序列組成；(Be)多核苷酸，編碼由序列號7所示的氨基酸序列組成的多肽；(Bf)多核苷酸，與上述(Bd)或(Be)的多核苷酸互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有以二氫黃豆苷元為底物生成四氫黃豆苷元活性的多肽。(第6步驟)通過在含有四氫黃豆苷元的培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有(Cd) (Cf)中任一種多核苷酸的重組細(xì)胞，生成雌馬酚的步驟(Cd)多核苷酸，由序列號16所示的核苷酸序列組成；(Ce)多核苷酸，編碼由序列號13所示的氨基酸序列組成的多肽；
(Cf)多核苷酸，與上述(Cd)或(Ce)的多核苷酸互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有以四氫黃豆苷元為底物生成雌馬酚活性的多肽。此處，于一個重組細(xì)胞內(nèi)可以存在選自(Ad) (Af)、(Bd) (Bf)及(Cd) (Cf) 中的至少兩種多核苷酸。項D12.如項Dll所述的制備方法，其中，重組細(xì)胞為細(xì)菌性原核細(xì)胞。項D13.如項D12所述的制備方法，其中，細(xì)菌性原核細(xì)胞屬于乳球菌屬。項D14. —種產(chǎn)物，含有由項Dll D13中任一項所述的方法制備的二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酹。項D15. —種二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚的制備裝置，所述制備裝置具有下述(第I反應(yīng)槽) (第3反應(yīng)槽)中的至少一種反應(yīng)槽(第I反應(yīng)槽)該反應(yīng)槽內(nèi)具有反應(yīng)裝置,所述反應(yīng)裝置中固定有由(Aa) (Ac) 中任一種多肽組成的酶，所述反應(yīng)槽用于使用由上述多肽組成的酶由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元，其中，上述反應(yīng)裝置被配置在能夠與反應(yīng)槽內(nèi)的黃豆苷元接觸的位置；
(第2反應(yīng)槽)該反應(yīng)槽內(nèi)具有反應(yīng)裝置，所述反應(yīng)裝置中固定有由(Ba) (Be) 中任一種多肽組成的酶，所述反應(yīng)槽用于使用由上述多肽組成的酶由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元，其中，上述反應(yīng)裝置被配置在能夠與反應(yīng)槽內(nèi)的二氫黃豆苷元接觸的位置；(第3反應(yīng)槽)該反應(yīng)槽內(nèi)具有反應(yīng)裝置，所述反應(yīng)裝置中固定有由(Ca) (Ce) 中任一種多肽組成的酶，所述反應(yīng)槽用于使用由上述多肽組成的酶由四氫黃豆苷元制備雌馬酚，其中，上述反應(yīng)裝置被配置在能夠與反應(yīng)槽內(nèi)的四氫黃豆苷元接觸的位置；此處，在一個反應(yīng)槽內(nèi)可以同時存在至少兩種上述反應(yīng)裝置。項D16. —種二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚的制備裝置，所述制備裝置具有以下(第4反應(yīng)槽) (第6反應(yīng)槽)中的至少一種反應(yīng)槽(第4反應(yīng)槽)該反應(yīng)槽內(nèi)具有反應(yīng)裝置,所述反應(yīng)裝置中固定有含有(Ad) (Af)中任一種多核苷酸的重組細(xì)胞，所述反應(yīng)槽用于使用上述反應(yīng)裝置由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元，其中上述反應(yīng)裝置被配置在能夠與反應(yīng)槽內(nèi)的黃豆苷元接觸的位置；(第5反應(yīng)槽)該反應(yīng)槽內(nèi)具有反應(yīng)裝置，所述反應(yīng)裝置中固定有含有(Bd) (Bf)中任一種多核苷酸的重組細(xì)胞，所述反應(yīng)槽用于使用上述反應(yīng)裝置由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元，其中，上述反應(yīng)裝置被配置在能夠與反應(yīng)槽內(nèi)的二氫黃豆苷元接觸的位置；(第6反應(yīng)槽)該反應(yīng)槽內(nèi)具有反應(yīng)裝置，所述反應(yīng)裝置中固定有含有(Cd) (Cf)中任一種多核苷酸的重組細(xì)胞，所述反應(yīng)槽用于使用上述反應(yīng)裝置由四氫黃豆苷元制備雌馬酚，其中，上述反應(yīng)裝置被配置在能夠與反應(yīng)槽內(nèi)的四氫黃豆苷元接觸的位置；此處，在一個反應(yīng)槽內(nèi)可以同時存在至少兩種上述反應(yīng)裝置。由本發(fā)明的多肽，可以⑴以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元，⑵以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元及(3)以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚。因此，對于實現(xiàn)在由黃豆苷元制備雌馬酚時產(chǎn)生的中間體即二氫黃豆苷元及/或四氫黃豆苷元的工業(yè)合成，以及雌馬酚的工業(yè)合成方面，本發(fā)明是有用的。目前為止，對于雌馬酚產(chǎn)生菌，只發(fā)現(xiàn)了難以處理的厭氧菌，但是利用本發(fā)明可以不使用現(xiàn)有的雌馬酚產(chǎn)生菌，為雌馬酚的工業(yè)制備開辟了一條道路。
具體實施例方式本說明書中的氨基酸、多肽、堿基序列、核酸等的縮寫表示方式，遵照IUPAC-IUB 的規(guī)定[IUPAC-1UB Communication on Biological Nomenclature,Eur. J. Biochem. , 138 9 (1984)]、“the Guideline for Drafting Specifications containing Base Sequene or Amino Acid Sequence” (Japan Patent Office)及該領(lǐng)域的慣用符號。以下詳細(xì)說明本發(fā)明。A :二氫黃豆苷元合成酶本項詳細(xì)說明二氫黃豆苷元合成酶(以下有時也記為El酶)。除了另有說明外， 關(guān)于二氫黃豆苷元合成酶的一般說明也適用于下述四氫黃豆苷元合成酶及雌馬酚合成酶。 A-1.多狀本發(fā)明中，作為利用黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的多肽，提供了下述 (Aa) (Ac)的多肽(以下有時也將該多肽記為“E1多肽”)(Aa)多肽，由序列號I所示的氨基酸序列組成；可以舉出例如為I 250個，優(yōu)選為I 200個，較優(yōu)選為I 150個，較優(yōu)選為I 100個，較優(yōu)選為I 50個，較優(yōu)選為 I 30個，更優(yōu)選為I 15個，更較優(yōu)選為I 5個，特別優(yōu)選為I 4個，較特別優(yōu)選為 I 3個，最優(yōu)選為I或2個。(Ab)多肽，由在序列號I所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的活性；(Ac)多肽，由與序列號I所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的活性。上述(Ab)多肽中，對于“一個或多個”的范圍沒有特殊限定，只要該多肽具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的活性即可，作為上述(Ab)多肽的具體例子，可以舉出由序列號2所示的氨基酸序列組成的多肽及由序列號3所示的氨基酸序列組成的多肽。與序列號I所示的氨基酸序列相比，序列號2所示的氨基酸序列含有3個被取代的氨基酸。 與序列號I所示的氨基酸序列相比，序列號3所示的氨基酸序列含有10個被取代的氨基酸。序列號2所示的氨基酸序列相當(dāng)于來自卵形假桿菌(Bacteroides ovatus)E-23-15 株(FERM BP-6435號)的El酶。序列號3所示的氨基酸序列相當(dāng)于來自咽峽炎鏈球菌 (Streptococcus constellatus) A6G-225 株(FERM BP-6437 號)的 El 酶。另外，對于上述(Ab)多肽中氨基酸的取代沒有特別限定，從不引起多肽表型的變化這一觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選使用類似的氨基酸進(jìn)行取代。具體而言，作為類似氨基酸，可以如下分組芳香族氨基酸Phe、Trp、Tyr脂肪族氨基酸:Ala、Leu、lie、Val極性氨基酸Gln、Asn堿性氨基酸Lys、Arg、His酸性氨基酸Glu、Asp具有羥基的氨基酸Ser、Thr
具有小側(cè)鏈的氨基酸Gly、Ala、Ser、Thr、Met。進(jìn)而，上述(Ab)多肽中氨基酸的取代、缺失、插入或添加，優(yōu)選發(fā)生在對多肽的高級結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生大的影響的區(qū)域、或?qū)ψ鳛槎潼S豆苷元合成酶的活性中心不產(chǎn)生阻礙影響的區(qū)域。上述區(qū)域可以舉出例如序列號1、2及3所示的氨基酸序列之間的低保守區(qū)域及其周邊，或N末端區(qū)域或C末端區(qū)域。具體而言，在序列號I所示的氨基酸序列中，可以舉出第45位的亮氨酸、第80位的天冬酰胺、第167位的纈氨酸、第231位的天冬氨酸、第233位的異亮氨酸、第435位的精氨酸、第459位的天冬氨酸、第462位的纈氨酸、第528位的精氨酸、第540位的絲氨酸、第639位的異亮氨酸及上述氨基酸的周邊區(qū)域。上述“周邊區(qū)域”是在對二氫黃豆苷元合成酶活性不產(chǎn)生影響的范圍內(nèi)，以上述特定位置的氨基酸為基點(diǎn)，例如前后5個以內(nèi)的氨基酸，優(yōu)選前后4個以內(nèi)的氨基酸，較優(yōu)選前后3個的氨基酸，特別優(yōu)選前后2個的氨基酸，較特別優(yōu)選前后I個的氨基酸。序列號I所示的氨基酸序列中第112位 第116位的氨基酸序列被認(rèn)為相當(dāng)于 NADPH結(jié)合域。只要不阻礙NADPH結(jié)合域的功能，可以在上述5個氨基酸的序列中取代、缺失、插入或添加氨基酸。該序列中，優(yōu)選3個以下氨基酸發(fā)生上述變異，較優(yōu)選2個以下，更優(yōu)選I個，最優(yōu)選該氨基酸序列不發(fā)生變異。特別是優(yōu)選第112位、115位及116位的氨基酸不發(fā)生取代、缺失、插入或添加。
序列號I所示的氨基酸序列中第260位組氨酸也被認(rèn)為與上述質(zhì)子中繼站 (proton relay site)有關(guān)。因此，只要不阻礙質(zhì)子中繼站的功能，上述組氨酸可以被其他氨基酸取代，但優(yōu)選不被取代。序列號I所示的氨基酸序列中的第343位 第363位氨基酸序列被認(rèn)為相當(dāng)于 Fe-S簇模序(cluster motif)。因此，只要不阻礙上述模序的功能，可以在上述序列中取代、 缺失、插入或添加任意氨基酸，但優(yōu)選第343位、第346位、第350位及第363位的半胱氨酸不發(fā)生變異。上述序列中上述3個氨基酸之外的氨基酸被其他氨基酸取代時，優(yōu)選4個以下的氨基酸被取代，較優(yōu)選3個以下的氨基酸被取代，更優(yōu)選2個以下的氨基酸被取代，特別優(yōu)選I個氨基酸被取代。最優(yōu)選上述序列中不發(fā)生氨基酸的取代、缺失、插入或添加。序列號I所示的氨基酸序列中第390位 第413位氨基酸序列被認(rèn)為相當(dāng)于FAD 結(jié)合域。因此，只要不阻礙上述區(qū)域的功能，可以在上述序列中取代、缺失、插入或添加任意氨基酸，但優(yōu)選第390位、第392位及第395位的甘氨酸不發(fā)生變異。在上述序列中取代、 缺失、插入或添加氨基酸時，優(yōu)選4個以下的氨基酸發(fā)生上述變異，較優(yōu)選3個以下的氨基酸，更優(yōu)選2個以下的氨基酸，特別優(yōu)選I個氨基酸。最優(yōu)選上述序列中不發(fā)生氨基酸的變
巳序列號I所示的氨基酸序列中第512位 第540位的氨基酸序列也被認(rèn)為相當(dāng)于 FAD結(jié)合域。因此，只要不阻礙上述區(qū)域的功能，可以在上述序列中取代、缺失、插入或添加任意氨基酸，但優(yōu)選第512位、第514位及第517位的甘氨酸不發(fā)生變異。在上述序列中取代、缺失、插入或添加氨基酸時，優(yōu)選4個以下的氨基酸發(fā)生上述變異，較優(yōu)選3個以下的氨基酸，更優(yōu)選2個以下的氨基酸，特別優(yōu)選I個氨基酸。最優(yōu)選上述序列中的氨基酸序列不發(fā)生變異。表示具有上述預(yù)想功能的氨基酸序列區(qū)域的比對情況示于圖27。在特定氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加一個或多個氨基酸的技術(shù)為公知技術(shù)。上述(Ac)多肽中，相對于序列號I所示的氨基酸序列，氨基酸的同一性例如為 60%以上，通常為80%以上，優(yōu)選為85%以上，更優(yōu)選為90%以上，為較優(yōu)選95%以上，特別優(yōu)選為98%以上、更特別優(yōu)選為99%以上。作為上述(Ac)多肽的具體例子，可以舉出由序列號2所示的氨基酸序列組成的多肽及由序列號3所示的氨基酸序列組成的多肽。序列號I所示的氨基酸序列與序列號2所示的氨基酸序列的氨基酸同一性為99. 5%，序列號I所示的氨基酸序列與序列號3所示的氨基酸序列的氨基酸同一性為98. 6% (Blast2)。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中， (Ac)多肽與序列號I所示的氨基酸序列的同一性優(yōu)選為98. 6%以上，較優(yōu)選為99. 5%以上。氨基酸序列的同一性可以通過市售的或電信線路(因特網(wǎng))的可利用分析工具進(jìn)行計算，例如使用FASTA、BLAST、PSI-BLAST, SSEARCH等軟件計算。具體而言，BLAST檢索中通常使用的主要初始條件如下所示。即，在高級BLAST 2. I中，使用blastp程序，期望值為 10,過濾器為全 OFF,矩陣為 BL0SUM62, Gap existence cost、Per residue gap cost 及 Lambda ratio分別為11、1、0. 85 (缺省值)，通過將其他各種參數(shù)也設(shè)定為缺省值進(jìn)行檢索，計算氨基酸序列的同一'I"生(identity)的值(％ )。
另外，上述(Ab)及(Ac)的多肽中，“以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的活性” 可以通過以下方式確證。S卩，將用作檢查對象的多肽加入下述組成的底物溶液中使其濃度為O. 001mg/mL，在37°C下溫育2小時后，確證溶液中是否存在二氫黃豆苷元。確認(rèn)溫育后的溶液中存在二氫黃豆苷元時，可以判定上述多肽具有“以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的活性”。底物溶液的組成
0.1 M 磚酸鉀緩沖液
1mM PMSF(苯曱基磺酰氟)
2mM 二硫蘇糖醇
5 mM 連二亞硫酸鈉 2 mM NADPH 或 NADH 40 μΜ黃豆苷元pH 7. O酶特件El多肽具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的酶活性。因此，El多肽也被稱為El酶。El酶的酶活性在連二亞硫酸鈉等還原劑或錳離子或鐵離子等金屬離子存在下被激活。El酶需要以NADPH或NADH作為輔酶，最適溫度在30°C左右，最適pH為7. O。El酶不僅能以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元，還可以進(jìn)行其逆反應(yīng)，即以二氫黃豆苷元為底物合成黃豆苷元。El多肽可以通過下述基因工程學(xué)方法進(jìn)行制備，也可以從能產(chǎn)生El多肽的微生物中分離和純化。另外，El多肽還可以以序列號1、2或3所示的氨基酸序列信息為基礎(chǔ)通過一般的化學(xué)合成法進(jìn)行制備，上述化學(xué)合成法包括通常的液相或固相肽合成法。以下對從能產(chǎn)生El多肽的微生物中分離純化El肽的方法進(jìn)行說明。首先，將能產(chǎn)生El多肽的微生物的細(xì)胞破碎，得到該微生物的粗提物。此處，細(xì)胞的破碎可以使用在通常的細(xì)胞破碎處理中使用的方法，例如使用弗式壓碎機(jī)、細(xì)胞破碎機(jī)等破碎機(jī)進(jìn)行處理， 或在低滲溶液中進(jìn)行超聲處理等。另外，可以在所得的粗提物中加入適當(dāng)?shù)木彌_液。另外， El多肽為厭氧性時，優(yōu)選在所得的粗提物中加入適當(dāng)?shù)倪€原劑來抑制El多肽的失活。對于所得粗提物，為了提高其純度，可以將其進(jìn)行純化處理，如硫酸銨沉淀、利用乙醇等有機(jī)溶劑沉淀、或等電點(diǎn)沉淀等。然后，通過對粗提物進(jìn)行離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法、疏水色譜法、各種親和色譜法、反相色譜法、羥基磷灰石柱色譜法等處理來獲得含有El多肽的級分。需要說明的是，使用上述色譜法進(jìn)行的處理，可以根據(jù)需要使用開管柱，或使用HPLC。 另外，通過上述處理得到的含有El多肽的級分的純度，可以通過電泳、特別是SDS-PAGE進(jìn)行可視的簡便地推定。另外，El多肽可以通過氨基酸序列分析法；使用MALDI-TOF MS、ESI Q-TOF MS或MALDI Q-TOF MS等質(zhì)譜儀的質(zhì)譜分析法；肽質(zhì)量指紋圖譜法等進(jìn)行鑒定。另外，此處，為了使能產(chǎn)生El多肽的微生物有效地產(chǎn)生El肽，優(yōu)選將其在含有規(guī)定量黃豆苷元的培養(yǎng)基(無特殊限定，例如含有O. 01 μ g/mL以上黃豆苷元的培養(yǎng)基)中進(jìn)行培養(yǎng)。 另外，El多肽可以作為單體存在，但只要具有合成二氫黃豆苷元的能力則也可以以二聚體或多聚物的形式存在。另外，為了提高El多肽的穩(wěn)定性等，可以根據(jù)需要添加聚乙二醇或糖鏈對El多肽進(jìn)行修飾。El多肽可以發(fā)揮催化作用，即催化以黃豆苷元作為底物轉(zhuǎn)換為二氫黃豆苷元的反應(yīng)。上述二氫黃豆苷元在下述四氫黃豆苷元合成酶(E2酶)及雌馬酚合成酶(E3酶)的作用下轉(zhuǎn)換為雌馬酚。雌馬酚被認(rèn)為是在體內(nèi)發(fā)揮多種生理作用的物質(zhì)，從這一方面考慮，一般認(rèn)為能提供雌馬酚的合成原料的El多肽是重要的。A-2.多核苷酸本發(fā)明還提供一種多核苷酸(以下有時也將該多核苷酸記為“E1多核苷酸”)，所述多核苷酸編碼具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元活性的多肽。具體而言，作為El 多核苷酸，提供下述(Ad) (Af)的多核苷酸(Ad)多核苷酸，由序列號4所示的核苷酸序列組成；(Ae)多核苷酸，編碼由序列號I所示的氨基酸序列組成的多肽；(Af)多核苷酸，與上述(Ad)或(Ae)的多核苷酸的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有以黃豆苷元為底物生成二氫黃豆苷元活性的多肽。序列號I所示的氨基酸序列相當(dāng)于序列號4所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。序列號2所示的氨基酸序列相當(dāng)于序列號5所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。序列號3所示的氨基酸序列相當(dāng)于序列號6所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。上述(Af)的多核苷酸中，“在嚴(yán)格條件下雜交”是指，兩個多核苷酸片段在標(biāo)準(zhǔn)的雜交條件下能夠相互雜交，該條件記載于Sambrook et al. , Molecular Cloning A laboratory manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA 中。更具體而言，“嚴(yán)格條件”是指在6. O X SSC中在約45°C下進(jìn)行雜交，并且使用2. O X SSC在50°C下進(jìn)行清洗。作為上述(Af)的多核苷酸，可以舉出例如序列號5所示的核苷酸序列及序列號6所不的核苷酸序列。在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸通常與作為探針使用的多核苷酸的核苷酸序列具有一定程度以上的同一性。上述同一性例如為60%以上，優(yōu)選70%以上，更優(yōu)選80%以上， 較優(yōu)選90%以上，特別優(yōu)選95%以上，更特別優(yōu)選98%以上。氨基酸序列的同一性可以通過市售的或電信線路(因特網(wǎng))的可利用的分析工具進(jìn)行計算，例如使用FASTA、BLAST、 PSI-BLAST、SSEARCH等軟件進(jìn)行計算。具體而言，BLAST檢索中通常使用的主要初始條件如下所示。即，在高級BLAST 2. I中，使用blastp程序，將各種參數(shù)設(shè)定為缺省值進(jìn)行檢索， 計算氨基酸序列同一性的值(% U序列號4所不的核苷酸序列與序列號5所不的核苷酸序列的堿基序列的同一'丨生為 99. 6%，序列號4所示的核苷酸序列與序列號6所示的核苷酸序列的堿基序列的同一性為 97. 6% (Blast2)。因此,在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，(Af)的多核苷酸與序列號4所不的核苷酸序列具有97. 6%以上的同源性,較優(yōu)選99. 6%以上。另外，上述(Af)的多核苷酸的“以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的活性”，使用與上述(Ab)或(Ac)多肽相同的方法進(jìn)行確證。El多核苷酸可以基于序列號4、5或6所示的序列信息通過化學(xué)DNA合成法制備、 獲得，也可以通過一般的基因工程學(xué)方法簡單地制備·獲得[參見Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989);續(xù)生物化學(xué)實驗講座“基因研究法 I、II、III”、 日本生化學(xué)會編(1986)等]。作為化學(xué)DNA合成法，可以舉出使用亞磷酰胺法的固相合成法。上述合成法中可以使用自動合成機(jī)。另外，作為一般的基因工程學(xué)方法，具體而言可以如下實施由表達(dá)El多核苷酸的適當(dāng)?shù)奶峁┪铮苽鋍DNA文庫，并且使用El多核苷酸特有的合適的探針或抗體從上述文庫中選出所期望的克隆[Proc. Natl. Acad. Sci. , USA.，78，6613 (1981) ；Sciencel22, 778(1983)等]。此處，對于cDNA的提供物沒有特殊限定，只要為表達(dá)El多核苷酸的生物即可。具體而言，可以舉出能產(chǎn)生雌馬酚的微生物，優(yōu)選能產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌、屬于擬桿菌屬的細(xì)菌及屬于鏈球菌屬的細(xì)菌，更優(yōu)選能產(chǎn)生雌馬酚的格氏乳球菌、卵形假桿菌及咽峽炎鏈球菌，特別優(yōu)選能產(chǎn)生雌馬酚的來源于糞便的格氏乳球菌，特別優(yōu)選能產(chǎn)生雌馬酚的來源于糞便的作為格氏乳球菌的乳球菌20-92株(FERM BP-10036號；保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心)、卵形假桿菌E-23-15株(FERM BP-6435號；保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心)、咽峽炎鏈球菌A6G-225株(FERM BP-6437號；保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番I號))。另外，從上述微生物中分離總RNA、分離mRNA和 純化、cDNA的獲得和克隆等都可以按照常規(guī)方法進(jìn)行。另外，對于從cDNA文庫中篩選出本發(fā)明的多核苷酸的方法，也沒有特殊限制，可以按照常規(guī)方法進(jìn)行。具體而言，例如對由cDNA產(chǎn)生的多肽可以采用如下方法篩選通過使用該多肽特異抗體的免疫篩選選出對應(yīng)的cDNA克隆的方法，或使用與目的核苷酸序列選擇性結(jié)合的探針的噬菌斑雜交、菌落雜交等或?qū)⑸鲜黾夹g(shù)組合的方法等。
作為此處使用的探針，一般可以舉出基于與El多核苷酸的核苷酸序列相關(guān)信息 (例如，序列號4、5或6的核苷酸序列)進(jìn)行化學(xué)合成的DNA等。另外，作為篩選用探針，也可以使用基于本發(fā)明的多核苷酸的堿基序列信息設(shè)定的有義引物及/或反義引物。獲取El多核苷酸時，可以適當(dāng)?shù)厥褂肞CR法[Sciencel30，1350 (1985)]或PCR法的變異方法例如DNA或RNA擴(kuò)增法。特別是，從文庫很難得到全長的cDNA時，優(yōu)選采用RACE 法[Rapid amplification of cDNA ends ;實驗醫(yī)學(xué)、12 (6), 35 (1994)],特別是 5’-RACE 法 [M. A. Frohman, et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA. , 8,8998 (1988)]等。上述 RACE 法及 5’ -RACE法，在獲得來源于真核生物的El多核苷酸時有用。采用上述PCR法時使用的引物可以基于El多核苷酸的序列信息進(jìn)行適當(dāng)設(shè)定，上述引物可以按照常規(guī)方法合成。需要說明的是，擴(kuò)增的DNA或RNA片段的分離和純化可以按照上述常規(guī)方法進(jìn)行，例如可以通過凝膠電泳法、雜交法等進(jìn)行。使用常規(guī)的基因工程學(xué)方法，可以由El多核苷酸容易地、大量且穩(wěn)定地制備該多核苷酸的產(chǎn)物(即上述多肽)。一直以來，關(guān)于雌馬酚的產(chǎn)生菌只發(fā)現(xiàn)有難以處理的厭氧性菌株，但是通過成功分離El多核苷酸，可以不使用現(xiàn)有雌馬酚產(chǎn)生菌，為雌馬酚的工業(yè)制備開辟了一條新道路。A-3.表汰載體
對于本發(fā)明的表達(dá)載體沒有特殊限定，只要含有El多核苷酸并且能表達(dá)El多核苷酸即可，一般可以根據(jù)與宿主細(xì)胞的關(guān)系進(jìn)行適當(dāng)選擇。作為宿主細(xì)胞，使用原核生物的細(xì)胞時，作為表達(dá)載體可以舉出例如為可以在該宿主細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒載體，所述載體通過在上述多核苷酸的上游添加啟動子及SD(核糖體結(jié)合)堿基序列來使上述多核苷酸能在上述載體中表達(dá)。具體而言，可以舉出使用1\啟動子、T7啟動子及Iac啟動子的表達(dá)質(zhì)粒。作為其他優(yōu)選的細(xì)菌表達(dá)載體，可以舉出利用 tac啟動子或trc啟動子的質(zhì)粒PKK233-2及pKK233_3等。但是不限于上述例子，也可以使用公知的各種菌株及載體。另外，作為宿主細(xì)胞，使用真核細(xì)胞時，作為表達(dá)載體，通常可以使用位于需要表達(dá)的上述多核苷酸上游的啟動子，以及具有RNA剪接位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄終止序列等的其他特殊序列，上述表達(dá)載體根據(jù)需要也可以含有復(fù)制起點(diǎn)。已知大量對插入上述多核苷酸有用的真核生物載體。例如，作為適當(dāng)?shù)恼婧松镙d體可以舉出PCD及pCMV。另夕卜，除了上述例子之外，還可以舉出PMSG及pSVL，所述pMSG及pSVL根據(jù)需要利用MMTV或 SV40晚期啟動子。但是不限于上述例子，也可以使用公知的各種真核生物及載體。A-4.重組細(xì)胞本發(fā)明提供一種重組細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)，所述重組細(xì)胞由含有上述El多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到。作為用于重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞，可以使用原核細(xì)胞及真核細(xì)胞中任一種。作為用作宿主細(xì)胞的原核細(xì)胞，可以優(yōu)選使用屬于乳球菌屬的乳酸菌等細(xì)菌性原核細(xì)胞，除此之外也可以舉出在好氧條件下能生長的細(xì)菌性原核細(xì)胞(例如大腸桿菌、鏈霉菌、枯草芽孢桿菌、鏈球菌、葡萄球菌等)。作為用作宿主細(xì)胞的真核細(xì)胞，可以舉出例如酵母、曲霉等真核微生物；果蠅S2、 秋粘蟲Sf9等昆蟲細(xì)胞；L細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、C127細(xì)胞、BALB/c3T3細(xì)胞(包含缺失二氫葉酸還原酶或胸肽激酶的突變株)、BHK21細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、Bowes黑素瘤細(xì)胞、卵母細(xì)胞等動植物細(xì)胞等。另外，對于將上述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法沒有特殊限定，可以使用常規(guī)的各種方法。例如，可以按照 Davis 等(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986)及 Sambrook 等(MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL,2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989)等多種標(biāo)準(zhǔn)實驗室手冊記載的方法，將上述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，作為具體方法可以舉出磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)位(transvection)、微量注射、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、劃痕負(fù)載 (scrape loading)、彈道導(dǎo)入(ballistic introduction)、感染等。由于上述重組細(xì)胞能產(chǎn)生作為二氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換酶的El多肽，因此可用于制備二氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換酶，另外上述重組細(xì)胞也可以以細(xì)胞的形態(tài)用于二氫黃豆苷元的制備。A-5.使用重組細(xì)胞的多肽的制備可以通過培養(yǎng)導(dǎo)入了 El多核苷酸的重組細(xì)胞，從細(xì)胞和培養(yǎng)物中回收El多肽來制備El多肽。對于培養(yǎng)，可以使用適合于宿主的培養(yǎng)基，進(jìn)行繼代培養(yǎng)或分批培養(yǎng)。以產(chǎn)生于重組細(xì)胞內(nèi)外的El多肽量為指標(biāo)，將細(xì)胞培養(yǎng)至可以得到適量的El多肽。 作為用于上述培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以根據(jù)使用的宿主細(xì)胞從慣用的各種培養(yǎng)基中進(jìn)行適當(dāng)選擇，培養(yǎng)也可以在適合于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行。另外，由此得到的El多肽，可以根據(jù)需要通過利用其物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)等的各種分離技術(shù)[參見“生物化學(xué)數(shù)據(jù)手冊II”、1175-1259頁、第I版第I次印刷、1980年6月 23 日株式會社東京化學(xué)同人發(fā)行；Biochemistry, 25 (25),8274 (1986) ；Eur. J. Biochem.， 163,313(1987)等]進(jìn)行分離、純化。具體而言，可以舉出與上述“A-1.多肽”欄中所述的 “從具有El多肽產(chǎn)生能力的微生物中分離純化El肽的方法”相同的方法。A-6.使用El多肽的二氫黃豆苷元的制備本發(fā)明提供一種使用El多肽的二氫黃豆苷元的制備方法。即，上述制備方法通過在NADPH及/或NADH存在下使El多肽作用于黃豆苷元，將黃豆苷元轉(zhuǎn)換為二氫黃豆苷元。 優(yōu)選通過在NADPH存在下使El多肽作用于黃豆苷元而將黃豆苷元轉(zhuǎn)換為二氫黃豆苷元。由于El多肽的二氫黃豆苷元合成酶活性在Mn2+及Fe2+的存在下被激活，所以優(yōu)選在Mn2+及/或Fe2+存在下使El肽作用于黃豆苷元。對于Mn2+及/或Fe2+在反應(yīng)液中的濃度沒有特殊限定，只要能激活El多肽的上述酶活性即可。Fe2+的濃度優(yōu)選為2mM以上，較優(yōu)選為2mM IOOmM,更優(yōu)選為IOmM 40mM。Mn2+的濃度優(yōu)選為O. 2 μ M，較優(yōu)選為O. 2 μ M IOOmM,更優(yōu)選為 I. O μ M 40mM。本制備方法中使用的反應(yīng)可以在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行。例如，作為緩沖液可以舉出磷酸緩沖液、碳酸緩沖液、醋酸緩沖液、Tris緩沖液、硼酸緩沖液等。另外，可以適宜地設(shè)定反應(yīng)條件，使上述反應(yīng)中的pH條件在使所期望的El多肽酶活性不滅活的范圍內(nèi)，例如優(yōu)選pH為5. O 10. O,更優(yōu)選為6. O 8. O。另外，可以根據(jù)需要在上述反應(yīng)中添加適量的PMSF、EDTA等蛋白酶抑制劑。另外， 考慮到上述多肽來源于厭氧性菌，因此可以添加適量的DTT、2ME、DET、連二亞硫酸鈉等還原劑。
本制備方法中使用的反應(yīng)在下述條件下進(jìn)行，例如在反應(yīng)開始時在溶劑中在下述濃度范圍內(nèi)加入各組分制備原料混合物，在20 45°C、優(yōu)選25 40°C、更優(yōu)選30 38°C 的溫度條件下，溫育混合物O. 5 10小時，優(yōu)選I 6小時，更優(yōu)選2 4小時上述多肽含量為O. 0001 I. O重量％，優(yōu)選O. 001 O. I重量％，更優(yōu)選O. 001 O. 01重量％ ；黃豆苷元含量為0.0001 10. O重量％，優(yōu)選O. 001 1.0重量％，更優(yōu)選 O. 001 O. I重量％ ;及 NADPH及/或NADH的含量為O. OI 5重量％，優(yōu)選O. 05 I重量％，更優(yōu)選O. I
O. 5重量％。另外，作為用于合成二氫黃豆苷元的混合原料，本發(fā)明提供一種含有(Ai)El多肽、(Aii)NADPH及/或NADH、及(Aiii)黃豆苷元的二氫黃豆苷元合成原料組合物。并且， 作為用于合成二氫黃豆苷元的混合原料，本發(fā)明提供一種含有(Ai)El多肽、(Aii)NADPH及 /或NADH、(Aiii)黃豆苷元及(Aiv)Mn2+及/或Fe2+的二氫黃豆苷元合成原料組合物。通過在上述條件下溫育上述合成原料組合物，可以將該合成原料組合物中的黃豆苷元轉(zhuǎn)換為二氫黃豆苷元。上述合成原料組合物相當(dāng)于在上述二氫黃豆苷元的制備中反應(yīng)開始時的原料混合物，該合成原料組合物中的El多肽的配合濃度、NADPH及/或NADH的配合濃度、黃豆苷元的配合濃度、及可以配合于該合成原料組合物中的其他組分等，都與上述制備方法中使用的反應(yīng)體系(反應(yīng)開始時的原料混合溶液)相同。
進(jìn)而，作為用于合成二氫黃豆苷元的試劑盒，本發(fā)明提供一種含有(Ai)El多肽、 (Aii)NADPH及/或NADH、及(Aiii)黃豆苷元的二氫黃豆苷元合成用試劑盒。作為用于合成二氫黃豆苷元的試劑盒，本發(fā)明提供一種含有(Ai)El多肽、(Aii)NADPH&/*NADH、 (Aiii)黃豆苷元及(Aiv)Mn2+及/或Fe2+的二氫黃豆苷元合成用試劑盒。為了能在上述條件下簡便地由黃豆苷元合成二氫黃豆苷元，各組分可以根據(jù)需要分別儲存在上述合成用試劑盒中。另外，上述合成用試劑盒中根據(jù)需要可以含有所需的緩沖液。并且，為了簡便地進(jìn)行二氫黃豆苷元的合成，上述合成用試劑盒可以含有必要的器具或操作手冊。A-7. 二氡黃豆苷元合成酶組合物本發(fā)明還提供一種含有El多肽的二氫黃豆苷元合成酶組合物。上述酶組合物在使用了 El多肽的二氫黃豆苷兀的制備方法中優(yōu)選用作二氫黃豆苷兀合成酶。上述酶組合物可以為粗純化狀態(tài)的El多肽，也可以為粗純化或純化的El多肽與適當(dāng)載體配合而形成的產(chǎn)物。上述酶組合物中，對于El多肽的配合比例沒有特殊限定，只要在上述二氫黃豆苷元的制備方法中該組合物能用作二氫黃豆苷元合成酶即可。具體而言，相對于上述酶組合物的總量，El多肽例如為O. 001 20. O重量％，優(yōu)選為O. 005 5. O重量％，更優(yōu)選為 O. 01 I. O重量％。上述酶組合物中，可以含有作為El多肽輔酶發(fā)揮作用的NADPH及/或NADH。上述酶組合物中配合NADPH及/或NADH時，對于該NADPH及/或NADH的配合比例沒有特殊限定，相對于上述酶組合物，例如為O. 0005 25. O重量％，優(yōu)選為O. 005 5. O重量％，更優(yōu)選為O. 01 2. 5重量％。另外在一個優(yōu)選實施方式中，上述酶組合物含有Mn2+及/或Fe2+。該酶組合物含有Mn2+及/或Fe2+的金屬離子時，對于金屬離子的配合比例沒有特殊限定，只要能激活El 多肽的二氫黃豆苷元合成酶活性即可。相對于上述組合物，F(xiàn)e2+的配合比例優(yōu)選為2mM以上，較優(yōu)選為2mM IOOmM,更優(yōu)選為IOmM 40mM。相對于上述組合物，Mn2+的配合比例優(yōu)選為O. 2 μ M以上，較優(yōu)選為O. 2 μ M IOOmM,更優(yōu)選為I. O μ M 40mM。進(jìn)而，為了提高上述多肽的穩(wěn)定性，上述酶組合物中除了含有El多肽還可以含有亞硫酸鹽、抗壞血酸、α -生育酚、半胱氨酸等抗氧化劑。另外，為了確保上述酶組合物的保存性，根據(jù)需要可以添加對羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、芐醇、2-苯乙醇、脫氫乙酸、山梨酸等防腐劑。Α-8.使用上述重組細(xì)胞的二氫黃豆苷元的制備方法本發(fā)明提供一種使用導(dǎo)入El多核苷酸的重組細(xì)胞制備二氫黃豆苷元的制備方法。即，上述制備方法中通過使上述重組細(xì)胞作用于黃豆苷元而使黃豆苷元轉(zhuǎn)換為二氫黃豆苷元。
本制備方法使用的反應(yīng)在上述重組細(xì)胞能夠存活并且能將黃豆苷元轉(zhuǎn)換為二氫黃豆苷元的條件下進(jìn)行。具體而言，通過在上述重組細(xì)胞能生長的培養(yǎng)基中加入適量的上述重組細(xì)胞及黃豆苷元進(jìn)行培養(yǎng)而進(jìn)行。本制備方法中使用的培養(yǎng)基，可以根據(jù)用作重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞的細(xì)胞種類從慣用的各種培養(yǎng)基中適當(dāng)選擇。另外，上述培養(yǎng)基中根據(jù)需要可以添加適量的PMSF、EDTA等蛋白酶抑制劑。另外， 考慮到上述多肽來源于厭氧性菌，因此可以加入適量的DTT、2ME、DET、連二亞硫酸鈉等還原齊U。另外，使用上述重組細(xì)胞時，并非必須添加NADPH及/或NADH，但是可以根據(jù)需要在培養(yǎng)基中加入NADPH及/或NADH。并且上述培養(yǎng)基中可以添加Mn2+及/或Fe2+。具體而言，本制備方法如下進(jìn)行將上述重組細(xì)胞接種在含有O. 001 I重量％黃豆苷元的培養(yǎng)基中，優(yōu)選含有O. 01 I重量％，更優(yōu)選含有O. 01 0.5重量％，在可以生長的溫度條件下培養(yǎng)6 30小時，優(yōu)選7 24小時，更優(yōu)選7 18小時。另外，作為用于合成二氫黃豆苷元的混合原料，本發(fā)明提供一種含有(Aiv)上述重組細(xì)胞及(Aiii)黃豆苷元的二氫黃豆苷元合成原料組合物。通過在上述條件下培養(yǎng)上述合成原料組合物，可以將該合成原料組合物中的黃豆苷兀轉(zhuǎn)換為二氫黃豆苷兀。上述合成原料組合物相當(dāng)于在上述二氫黃豆苷元的制備中反應(yīng)開始時的原料混合物，在該合成原料組合物中上述重組細(xì)胞及黃豆苷元的濃度、及可以配合于該合成原料組合物中的其他組分等，都與上述制備方法中采用的條件等相同。進(jìn)而，作為用于合成二氫黃豆苷元的試劑盒，本發(fā)明提供一種含有(Aiv)上述重組細(xì)胞及(Aiii)黃豆苷元的二氫黃豆苷元合成用試劑盒。另外，作為用于合成二氫黃豆苷元的試劑盒，本發(fā)明提供一種含有(Aiv)上述重組細(xì)胞、(Aiii)黃豆苷元及(Aiv)Mn2+及/ 或Fe2+的二氫黃豆苷元合成用試劑盒。為了能在上述條件下簡便地由黃豆苷元合成二氫黃豆苷元，上述重組細(xì)胞和黃豆苷元可以根據(jù)需要分別儲存在上述合成用試劑盒中。另外，上述合成用試劑盒中根據(jù)需要可以含有緩沖液或培養(yǎng)基。并且，為了簡便地進(jìn)行二氫黃豆苷元的合成，上述合成用試劑盒可以含有必要的器具或操作手冊。需要說明的是，包含于上述合成用試劑盒中的上述重組細(xì)胞可以使用公知的方法保存。保存重組細(xì)胞的技術(shù)是公知技術(shù)，可以舉出例如使用冷凍干燥機(jī)將裝有含有重組細(xì)胞的二甲基甲酰胺等溶液的安瓿抽成真空，然后在4 25°C下保存的方法等。除此之外還可以舉出液氮方法，即，將細(xì)胞懸濁于添加有10%丙三醇的保存培養(yǎng)基中，將其回收至專用安瓿中并保存在液氮灌(-150 -196°C )中。A-9.與上述多肽具有親和性的抗體
本發(fā)明還提供一種與El多肽具有親和性的抗體(IgG抗體)。單克隆抗體按照現(xiàn)有方法制備。具體而言，可以按照Harlow，H. and Lane,D.，“抗體實驗室手冊”，Cold Spring Harbor Lab,New York, 139-240頁(1988)所述的方法制備。另外，多克隆抗體也按照現(xiàn)有方法制備。具體而言，可以按照細(xì)胞工程實驗方案 (東京大學(xué)醫(yī)科學(xué)研究所制癌研究部編，1992年，155 173頁)等所述的方法制備。多克隆IgG抗體及單克隆IgG抗體都可以通過硫酸銨沉淀法及蛋白質(zhì)A色譜法等常規(guī)方法進(jìn)行純化。A-10.檢測或測定上述多肽的免疫學(xué)方法進(jìn)而，本發(fā)明提供一種使用上述抗體檢測或測定El多肽的免疫學(xué)方法。具體而言，上述免疫學(xué)方法通過使上述抗體接觸受試樣品而進(jìn)行。即，可以通過下述方法檢測或測定受試樣品中的上述多妝將上述抗體與受試樣品相接觸，由此在受試樣品中存在El多妝時使上述抗體與El多肽特異性結(jié)合，然后，檢測與El多肽相結(jié)合的上述抗體，根據(jù)需要對其進(jìn)行定量。此處，受試樣品是指用作El多肽的檢測或測定對象的樣品。由于可以預(yù)測El多肽存在于細(xì)菌性原核細(xì)胞內(nèi)，所以上述免疫學(xué)方法適合用于檢測或測定存在于細(xì)菌性原核細(xì)胞內(nèi)的El多肽。需要說明的是，檢測或測定存在于細(xì)胞內(nèi)的El多肽時，可以使用對上述細(xì)胞進(jìn)行破碎處理得到的物質(zhì)、或經(jīng)該破碎處理后進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化處理得到的物質(zhì)作為受試樣品。使用利用抗體的免疫學(xué)方法檢測或測定目標(biāo)多肽的技術(shù)是公知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)卦O(shè)定適合于免疫學(xué)方法的各種條件。例如，可以設(shè)定適當(dāng)?shù)臈l件，使用放射免疫分析法、ELISA法等。
進(jìn)而，作為用于檢測或測定El多肽的試劑盒，本發(fā)明提供一種含有上述抗體的免疫學(xué)檢測用試劑盒。上述檢測用試劑盒中根據(jù)需要可以含有El多肽作為標(biāo)準(zhǔn)品。并且，為了能在上述條件下簡便地進(jìn)行El多肽的檢測，根據(jù)需要上述檢測用試劑盒還可以含有其他所需試劑等。另外，為了簡便地進(jìn)行El多肽的檢測，上述檢測用試劑盒可以含有必要的器具或操作手冊。Α-ll.檢測或測定編碼上沭多肽的多核苷酸的方法另外，本發(fā)明提供一種檢測或測定El多核苷酸的方法。具體而言，上述方法通過使結(jié)合于El多核苷酸的探針與受試樣品相接觸而進(jìn)行。即，可以通過下述方法檢測或測定受試樣品中的El多核昔酸將上述探針與受試樣品相接觸，由此在受試樣品中存在上述El 多核苷酸時使上述探針與El多核苷酸雜交，然后，檢測上述雙鏈?zhǔn)欠裥纬桑鶕?jù)需要對其進(jìn)行定量。此處，受試樣品是指用作El多核苷酸的檢測或測定對象的樣品。由于可預(yù)測El 多核苷酸存在于細(xì)菌性原核細(xì)胞內(nèi)，所以上述免疫學(xué)方法適合用于檢測或測定存在于細(xì)菌性原核細(xì)胞內(nèi)的El多核苷酸。需要說明的是，檢測或測定存在于細(xì)胞內(nèi)的El多核苷酸時， 可以使用對上述細(xì)胞進(jìn)行破碎處理得到的物質(zhì)、或經(jīng)該破碎處理后進(jìn)行核酸的純化處理得到的物質(zhì)作為受試樣品。另外，在上述方法中使用的探針具有在嚴(yán)格條件下能與上述多核苷酸雜交的核苷酸序列。此處，嚴(yán)格條件是指，例如用于探針或引物的通常條件，具體而言，例如為上述A-2 部分所述的條件。上述探針可以基于與El多核苷酸的核苷酸序列(例如序列號4、5或6的核苷酸序列)相關(guān)的信息進(jìn)行化學(xué)合成，另外也可以為已經(jīng)獲得的El多核苷酸或其片段。另外，上述探針通常使用標(biāo)記探針，但也可以為非標(biāo)記探針。另外，將上述探針作為PCR用引物(有義引物或反義引物)使用時，其長度例如為約10 40個核苷酸左右，特別優(yōu)選為20 30 個核苷酸左右。作為使用上述探針特異性檢測上述多核苷酸的方法，可以舉出例如噬菌斑雜交、菌落雜交、DNA印跡法、RNA印跡法、PCR法等，但從靈敏度觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選使用利用上述探針作為引物的PCR法擴(kuò)增El多核苷酸或其一部分。作為PCR法，可以舉出例如RT-PCR法，也可以為在該領(lǐng)域使用的各種變形方法。 使用PCR法可以測定El多核苷酸的存在和對其進(jìn)行定量。作為上述方法可以舉出如MSSA 法的競爭定量法(Kinoshita’M.，et al.，CCA，228，83-90 (1994))，和 PCR-SSCP 法(Orita, M.，et al.，Genomics, 5，874-879 (1989))，所述PCR-SSCP法為一種利用變化遷移率隨單鏈 DNA高級結(jié)構(gòu)的變化而變化以檢測突變的 已知方法。進(jìn)而，作為用于檢測或測定El多核苷酸的試劑盒，本發(fā)明提供一種含有上述探針的El多核苷酸檢測用試劑盒。為了能在上述條件下簡便地進(jìn)行El多核苷酸的檢測，根據(jù)需要上述檢測用試劑盒還可以含有除上述探針之外所需要的試劑等。另外，上述檢測用試劑盒還可以作為用于鑒定含有El多核苷酸的細(xì)胞的試劑盒使用。另外，從可以使檢測精度高這一觀點(diǎn)考慮，作為上述檢測用試劑盒優(yōu)選舉出使用PCR進(jìn)行檢測的試劑盒。B.四氫黃豆苷元合成酶B-1.多肽作為利用二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的多肽，本發(fā)明提供下述 (Ba) (Be)的多肽(以下也將該多肽記為“E2多肽”)(Ba)多肽，由序列號7所示的氨基酸序列組成；(Bb)多肽，由在序列號7所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列組成，并且具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性；(Be)多肽，由與序列號7所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性。上述(Bb)多肽中，對于“一個或多個”的范圍沒有特殊限定，只要該多肽具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性即可，可以舉出例如I 50個，優(yōu)選I 30個， 較優(yōu)選I 15個，更優(yōu)選I 5個，較更優(yōu)選I 4個，特別優(yōu)選I 3個，更特別優(yōu)選I 或2個。作為上述(Bb)多肽的具體例子，可以舉出例如由序列號8所示的氨基酸序列組成的多肽及由序列號9所示的氨基酸序列組成的多肽。與序列號7所示的氨基酸序列相比較，序列號8所示的氨基酸序列含有2個被取代的氨基酸序列并在N末端添加了由24氨基酸組成的氨基酸序列。與序列號7所示的氨基酸序列相比較，序列號9所示的氨基酸序列含有20個被取代氨基酸并缺失I個氨基酸。序列號8所示的氨基酸序列相當(dāng)于來自卵形假桿菌E-23-15株(FERM BP-6435號)的E2酶。序列號9所示的氨基酸序列相當(dāng)于來自咽峽炎鏈球菌A6G-225株(FERM BP-6437號)的E2酶。上述(Bb)多肽中氨基酸的取代、缺失、插入或添加可以以上述A-1.部分所述的El 多肽中的取代、缺失、插入或添加為基準(zhǔn)而得到。(Bb)多肽中氨基酸的取代、缺失、插入或添力口，優(yōu)選發(fā)生在對多肽的高級結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生大的影響的區(qū)域或?qū)ψ鳛樗臍潼S豆苷元合成酶的活性中心不產(chǎn)生阻礙影響的區(qū)域。作為上述區(qū)域，可以舉出例如在序列號7、8及9所示的氨基酸序列間的低保守區(qū)域及其周邊，或N末端區(qū)域或C末端區(qū)域。具體而言，在序列號7 所示的氨基酸序列中，可以舉出第7位的纈氨酸、第8位的脯氨酸、第26位的纈氨酸、第36 位的亮氨酸、第46位的精氨酸、第94位的天冬氨酸、第101位的谷氨酸、第126位的甘氨酸、 第137位的異亮氨酸、第156位的谷氨酰胺、第157位的賴氨酸、159位的天冬氨酸、第160 位、第171位的丙氨酸、第185位的半胱氨酸、第221位的絲氨酸、第233位的丙氨酸、第241 位的纈氨酸、第258位的絲氨酸、第266位的異亮氨酸及第286位的纈氨酸、及上述氨基酸的周邊區(qū)域。上述“周邊區(qū)域”是在對四氫黃豆苷元合成酶活性不產(chǎn)生影響的范圍內(nèi)，以上述特定位置的氨基酸為基點(diǎn)，例如前后5個以內(nèi)的氨基酸，優(yōu)選前后4個以內(nèi)的氨基酸，較優(yōu)選前后3個以內(nèi)的氨基酸，更優(yōu)選前后2個以內(nèi)的氨基酸，特別優(yōu)選前后I個的氨基酸。序列號7所示的氨基酸序列中的第38位 第45位的氨基酸序列被認(rèn)為相當(dāng)于 NADPH結(jié)合域。因此，只要不阻礙NADPH結(jié)合域的功能，可以在上述序列中取代、缺失、插入或添加任意氨基酸。但優(yōu)選第38位的蘇氨酸、第39位的甘氨酸、第43位的甘氨酸及第45 位的甘氨酸不發(fā)生變異。上述序列中氨基酸的取代、缺失、插入或添加優(yōu)選4個以下的氨基酸，較優(yōu)選3個以下的氨基酸，更優(yōu)選2個以下的氨基酸，特別優(yōu)選I個氨基酸。序列號7所示的氨基酸序列中的第115位 第118位的氨基酸序列被認(rèn)為相當(dāng)于 SDR家族中的高度保守模序。上述序列中氨基酸的取代、缺失、插入或添加優(yōu)選3個以下的氨基酸，較優(yōu)選2個以下的氨基酸，更優(yōu)選I個氨基酸。最優(yōu)選上述序列中不發(fā)生氨基酸的變異。序列號7所示的氨基酸序列中的第168位的絲氨酸、第182位的組氨酸、第186位的賴氨酸被認(rèn)為與E2酶的活性中心有關(guān)。因此，只要不阻礙該酶的活性，上述3個氨基酸可以被任意其他的氨基酸取代，但優(yōu)選上述氨基酸不發(fā)生變異。序列號7所示的氨基酸序列中的第212位 217位的氨基酸序列被認(rèn)為與輔因子的結(jié)合有關(guān)。因此，只要不阻礙該功能，可以在上述序列中取代、缺失、插入或添加任意氨基酸。但優(yōu)選第212位的脯氨酸、第213位的甘氨酸及第217位的蘇氨酸不發(fā)生變異。上述序列中氨基酸的取代、缺失、插入或添加優(yōu)選3個以下的氨基酸，較優(yōu)選2個以下的氨基酸， 更優(yōu)選I個氨基酸。特別優(yōu)選上述序列中的氨基酸不發(fā)生變異。表示具有上述預(yù)想功能的氨基酸序列區(qū)域的比對示于圖28。相對于序列號7所示的氨基酸序列，上述(Be)多肽中的氨基酸的同一性例如可以為60% 以上，但通常為80%以上，優(yōu)選85%以上，更優(yōu)選90%以上，較優(yōu)選95%以上，特別優(yōu)選98 %以上，更特別優(yōu)選99 %以上。
作為上述(Be)多肽的具體例子，可以舉出由序列號8所示的氨基酸序列組成的多肽及由序列號9所示的氨基酸序列組成的多肽。序列號7所示的氨基酸序列與序列號8所示的氨基酸序列的同一性為99. 3%，序列號7所示的氨基酸序列與序列號9所示的氨基酸序列的同一'I"生為93.0% (Blast2)。因此,在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，(Be)多肽與序列號7所不的氨基酸序列的同一'I"生優(yōu)選為93. 0%以上,較優(yōu)選為99. 3%以上。另外，在上述(Bb)及(Be)的多肽中，“以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性”可以通過以下方式確證。即，將用作確證對象的多肽加入下述組成的底物溶液中使其濃度為O. 001mg/mL，在37°C下溫育2小時后，確證溶液中是否存在四氫黃豆苷元。確認(rèn)溫育后的溶液中存在四氫黃豆苷元時，判定上述多肽具有“以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性”。底物溶液的組成
0.1 M磷酸鉀緩沖液(ρΗ7·0) 1mM PMSF(苯曱基磺酰氟)
2mM 二疏蘇糖醇
5 mM連二亞硫酸鈉 2 mM NADPH
2mM NADH 40 uM 二氫黃豆菩元酶特件E2多肽具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的酶活性。因此，E2多肽也被稱為E2酶。E2酶需要以NADPH或NADH作為輔酶。E2酶的最適溫度在37°C左右，最適 pH為4.5。E2酶不僅可以以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元，還可以進(jìn)行其逆反應(yīng)， 即以四氫黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元。E2多肽與上述El多肽相同，可以使用序列號10、11或12所示的核苷酸序列信息通過基因工程技術(shù)得到。另外，還可以基于序列號7、8或9所示的氨基酸序列信息通過化學(xué)合成法制備。并且E2多肽也可以從能產(chǎn)生E2多肽的微生物中分離和純化而得到。上述方法可以按照上述A-1.部分的記述進(jìn)行。能產(chǎn)生E2多肽的微生物可以在含有所需量的二氫黃豆苷元、且含有所需量的黃豆苷元的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這種情況下，可以由能產(chǎn)生E2多肽的微生物中產(chǎn)生E2多肽。E2多肽可以以單體形式存在，但只要具有四氫黃豆苷元合成能力，也可以以二聚體或多聚物形式存在。另外，為了提高E2多肽的穩(wěn)定性等，可以根據(jù)需要添加聚乙二醇或糖鏈對E2多肽進(jìn)行修飾。E2多肽可以發(fā)揮催化作用，即催化以二氫黃豆苷元為底物轉(zhuǎn)換為四氫黃豆苷元的反應(yīng)。上述四氫黃豆苷元可以進(jìn)一步通過下述雌馬酚合成酶轉(zhuǎn)換為雌馬酚。雌馬酚被認(rèn)為是在體內(nèi)發(fā)揮各種生理作用的物質(zhì)，從此方面考慮，一般認(rèn)為能提供雌馬酚的合成原料的 E2多肽是重要的。如上所述，本發(fā)明提供一種含有上述(Ba) (Be)多肽的四氫黃豆苷元合成酶。B-2.多核苷酸本發(fā)明還提供一種多核苷酸(以下也將該多核苷酸記為“E2多核苷酸”)，所述多核苷酸編碼具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元活性的多肽。具體而言，提供下述(Bd) (Bf)的多核苷酸作為E2多核苷酸(Bd)多核苷酸，由序列號10所示的核苷酸序列組成；(Be)多核苷酸，編碼由序列號7所示的氨基酸序列組成的多肽； (Bf)多核苷酸，與上述(Bd)或(Be)的多核苷酸的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有以二氫黃豆苷元為底物生成四氫黃豆苷元活性的多肽。序列號7所示的氨基酸序列相當(dāng)于序列號10所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。序列號8所示的氨基酸序列相當(dāng)于序列號11所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。序列號9所示的氨基酸序列相當(dāng)于序列號12所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。上述(Bf)的多核苷酸中的“在嚴(yán)格條件下雜交”與上述A-2.部分所述的“在嚴(yán)格條件下雜交”的意義相同。作為(Bf)的多核苷酸的具體例子，可以舉出序列號11所示的核苷酸序列及序列號12所示的核苷酸序列。序列號10所示的核苷酸序列與序列號11所示的核苷酸序列的堿基序列的同一性為99. 7%，序列號10所示的核苷酸序列與序列號12所不的核苷酸序列的堿基序列的同一'I"生為91.0% (Blast2)。因此,在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，(Bf)的多核苷酸與序列號10所示的核苷酸序列具有91. 0%以上的同源性，較優(yōu)選具有99. 7%以上的同源性。上述(Bf)的多核苷酸中，“以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性”使用與為上述(Bb)或(Be)多肽時相同的方法進(jìn)行確證。E2多核苷酸可以基于序列號10、11或12所示的序列信息通過化學(xué)合成法或基因工程技術(shù)制備 獲得。作為具體方法，可以使用在上述A-2.部分所述的關(guān)于El多核苷酸的方法。上述方法根據(jù)需要可以進(jìn)行修正·變更。對于E2多核苷酸的cDNA的提供物沒有特殊限定，只要為表達(dá)E2多核苷酸的微生物即可。具體而言，可以舉出能產(chǎn)生雌馬酚的微生物，優(yōu)選能產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌、屬于擬桿菌屬的細(xì)菌及屬于鏈球菌屬的細(xì)菌，更優(yōu)選能產(chǎn)生雌馬酚的格氏乳球菌、卵形假桿菌、及咽峽炎鏈球菌，特別優(yōu)選能產(chǎn)生雌馬酚的來源于糞便的格氏乳球菌，特別優(yōu)選能產(chǎn)生雌馬酚的來源于糞便的作為格氏乳球菌的乳球菌20-92株(FERM BP-10036號；保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心)、卵形假桿菌E-23-15株(FERM BP-6435號； 保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心)、咽峽炎鏈球菌A6G-225株 (FERM BP-6437號；保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番I號))。使用常規(guī)的基因工程學(xué)方法，通過使E2多核苷酸表達(dá)，可以容易地、大量且穩(wěn)定地制備出該多核苷酸的產(chǎn)物(即上述多肽)。一直以來，關(guān)于雌馬酚的產(chǎn)生菌只發(fā)現(xiàn)了難以處理的厭氧性菌株，但通過成功分離E2多核苷酸，也可以不使用現(xiàn)有的雌馬酚產(chǎn)生菌，為雌馬酚的工業(yè)制備開辟了一條新道路。B-3.表汰載體對于本發(fā)明的表達(dá)載體沒有特殊限定，只要含有E2多核苷酸并且能表達(dá)E2多核苷酸即可，含有E2多核苷酸的表達(dá)載體與含有El多核苷酸的表達(dá)載體相同，一般可以根據(jù)與宿主細(xì)胞的關(guān)系進(jìn)行適當(dāng)選擇。作為具體的宿主細(xì)胞，可以使用上述A-3.部分所述的宿主細(xì)胞。B-4.重纟目細(xì)朐本發(fā)明提供一種重組細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)，所述重組細(xì)胞由上述含有E2多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到。對于用于重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞沒有特殊限定，可以為上述A-4.部分所述的宿主細(xì)胞。另外，可以按照上述A-4.部分記述的方法將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。由于上述重組細(xì)胞能產(chǎn)生作為四氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換酶的E2多肽，因此可用于制備四氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換酶，另外上述重組細(xì)胞也可以以細(xì)胞的形態(tài)用于四氫黃豆苷元的制備。B-5.使用重組細(xì)胞的多肽的制備將導(dǎo)入了 E2多核苷酸的重組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中回收E2多肽，由此來制備 E2多肽?？梢园凑丈鲜鯝-5.部分的記載進(jìn)行培養(yǎng)。B-6.使用E2多肽的四氫黃豆苷元的制備本發(fā)明提供一種使用E2多肽制備四氫黃豆苷元的制備方法。即，上述制備方法通過在NADPH及/或NADH的存在下使E2多肽作用于二氫黃豆苷元，而將二氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為四氫黃豆苷元。本制備方法中使用的反應(yīng)可以在如上述A-6.部分所述的適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行。本制備方法中使用的反應(yīng)在下述條件下進(jìn)行，例如在反應(yīng)開始時在緩沖液(反應(yīng)開始時的原料混合物)中在下述濃度范圍內(nèi)加入各組分，在上述E2多肽、二氫黃豆苷元等原料及四氫黃豆苷元等產(chǎn)物不變質(zhì)·不失活的溫度條件下，溫育O. 5 10小時，優(yōu)選I 6小時，更優(yōu)選2 4小時而進(jìn)行。上述溫度條件下對于反應(yīng)溫度沒有特殊限定，但例如設(shè)定為0°C以下時，使用在此反應(yīng)溫度下不凍結(jié)的緩沖液等。反應(yīng)溫度優(yōu)選O 45°C，更優(yōu)選 O 37°C。另外，四氫黃豆苷元存在順式及反式構(gòu)型，通過改變上述反應(yīng)溫度或時間等條件可以控制順式及反式構(gòu)型的生成。例如，將反應(yīng)溫度設(shè)定為o°c時，可以生成混合有順式及反式構(gòu)型的四氫黃豆苷元，將反應(yīng)溫度設(shè)定為37°c時，可以使反式構(gòu)型優(yōu)先生成。上述制備方法中各組分的濃度范圍如下所示。E2多肽含量為O. 0001 I. O重量％，優(yōu)選O. 001 O. I重量％，更優(yōu)選O. 001 O. 01重量％ ；二氫黃丑苷兀含量為O. 0001 10. O重量優(yōu)選O. 001 I. O重量％ ,更優(yōu)選 O. 001 O. I重量％ ;及NADPH及/或NADH含量為O. 01 5重量％，優(yōu)選O. 05 I重量％，更優(yōu)選O. I
O.5重量％。另外，作為用于合成四氫黃豆苷元的混合原料，本發(fā)明提供一種含有(Bi)E2多肽、(Bii)NADPH及/或NADH、及(Biii) 二氫黃豆苷元的四氫黃豆苷元合成原料組合物。通過在上述條件下溫育上述合成原料組合物，可以將該合成原料組合物中的二氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為四氫黃豆苷元。上述合成原料組合物相當(dāng)于在上述四氫黃豆苷元的制備中反應(yīng)開始時的原料混合物，該合成原料組合物中的E2多肽的配合濃 度、NADPH及/或NADH的配合濃度、 二氫黃豆苷元的配合濃度及可以配合于該合成原料組合物中的其他組分等，都與上述制備方法中使用的反應(yīng)體系(反應(yīng)開始時的原料混合溶液)相同。
進(jìn)而，作為用于合成四氫黃豆苷元的試劑盒，本發(fā)明提供一種含有(Bi)E2多肽、 (Bii)NADPH及/或NADH、及(Biii) 二氫黃豆苷元的四氫黃豆苷元合成用試劑盒。為了能在上述條件下簡便地由二氫黃豆苷元合成四氫黃豆苷元，各組分可以根據(jù)需要分別儲存在上述合成用試劑盒中。另外，上述合成用試劑盒中根據(jù)需要可以含有所需的緩沖液。并且，為了簡便地進(jìn)行四氫黃豆苷元的合成，上述合成用試劑盒可以含有必要的器具或操作手冊。B-7.四氫黃豆苷元合成酶組合物本發(fā)明還提供一種含有E2多肽的四氫黃豆苷元合成酶組合物。上述酶組合物在使用了 E2多肽的四氫黃豆苷兀的制備方法中優(yōu)選用作四氫黃豆苷兀合成酶。上述酶組合物可以為粗純化狀態(tài)的E2多肽，也可以為粗純化或純化的E2多肽與適當(dāng)載體配合形成的物質(zhì)。該載體為對E2多肽的活性不產(chǎn)生不良影響的物質(zhì)，配合適量進(jìn)行使用。上述酶組合物中，對于E2多肽的配合比例沒有特殊限定，只要在上述四氫黃豆苷元的制備方法中能作為四氫黃豆苷元合成酶使用即可。具體而言，相對于上述酶組合物的總量，E2多肽例如為O. 001 20. O重量％，優(yōu)選為O. 005 5. O重量％，更優(yōu)選為 O. 01
I.O重量％。上述酶組合物中，可以含有作為E2多肽輔酶發(fā)揮作用的NADPH及/或NADH。上述酶組合物配合NADPH及/或NADH時，對于該NADPH及/或NADH的配合比例沒有特殊限定， 相對于上述酶組合物，例如為O. 005 50. O重量％，優(yōu)選為O. 05 10. O重量％，更優(yōu)選為 O. I 5. O重量％。進(jìn)而，為了提高上述多肽的穩(wěn)定性及/或確保上述酶組合物的保存性，上述酶組合物除了含有E2多肽外，還可以添加如上述A-7.部分所述的各種抗氧化劑或防腐劑。B-8.使用上述重組細(xì)胞的四氫黃豆苷元的制備方法本發(fā)明提供一種四氫黃豆苷元的制備方法，該制備方法使用導(dǎo)入了 E2多核苷酸的重組細(xì)胞。即，上述制備方法中，通過使上述重組細(xì)胞作用于二氫黃豆苷元而使二氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為四氫黃豆苷元。該制備方法使用的反應(yīng)在上述重組細(xì)胞能夠存活并且能將二氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為四氫黃豆苷元的條件下進(jìn)行。具體而言，是通過在上述重組細(xì)胞能生長的培養(yǎng)基中，加入適量的上述重組細(xì)胞及二氫黃豆苷元進(jìn)行培養(yǎng)而進(jìn)行。本制備方法中使用的培養(yǎng)基可以根據(jù)用作重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞的細(xì)胞種類從慣用的各種培養(yǎng)基中進(jìn)行適當(dāng)選擇。另外，上述培養(yǎng)基中，根據(jù)需要可以添加適量的PMSF、EDTA等蛋白酶抑制劑。另夕卜，考慮到上述多肽來源于厭氧性菌，因此可以添加適量的DTT、2ME、DET、連二亞硫酸鈉等還原劑。另外，使用上述重組細(xì)胞時，并非必須添加NADPH及/或NADH，但可以根據(jù)需要在培養(yǎng)基中添加NADPH及/或NADH。具體而言，該制備方法如下進(jìn)行將上述重組細(xì)胞接種在含有O. 001 I重量％、 優(yōu)選O. 01 O. 5重量％、更優(yōu)選O. 01 O. I重量％的二氫黃丑苷兀的培養(yǎng)基中，在可以生長的溫度條件下培養(yǎng)7 30小時，優(yōu)選15 24小時，更優(yōu)選17 20小時。此處，對于可以生長的溫度條件沒有特殊限定，可以在與上述“B-6.使用E2多肽的四氫黃豆苷元的制備”相同的溫度下進(jìn)行。另外，作為用于合成四氫黃豆苷元的混合原料，本發(fā)明提供一種含有(Biv)上述重組細(xì)胞及(Biii) 二氫黃豆苷元的四氫黃豆苷元合成原料組合物。通過在上述條件下培養(yǎng)上述合成原料組合物，可以將該合成原料組合物中的二氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為四氫黃豆苷元。上述合成原料組合物相當(dāng)于在上述四氫黃豆苷元的制備中反應(yīng)開始時的原料混合物， 在該合成原料組合物中的上述重組細(xì)胞及二氫黃豆苷元的濃度，及可以配合于該合成原料組合物中的其他組分等，都與上述制備方法中采用的條件等相同。進(jìn)而，作為用于合成四氫黃豆苷元的試劑盒，本發(fā)明提供一種含有(Biv)上述重組細(xì)胞及(Biii) 二氫黃豆苷元的四氫黃豆苷元合成用試劑盒。為了能在上述條件下簡便地由二氫黃豆苷元合成四氫黃豆苷元，上述重組細(xì)胞和二氫黃豆苷元可以根據(jù)需要分別儲存在上述合成用試劑盒中。另外，根據(jù)需要上述合成用試劑盒中可以含有緩沖液或培養(yǎng)基。 并且，為了簡便地進(jìn)行四氫黃豆苷元的合成，上述合成用試劑盒可以含有必要的器具或操作手冊。需要說明的是，包含于上述合成用試劑盒中的上述重組細(xì)胞可以使用公知的方法進(jìn)行保存。作為保存重組細(xì)胞的公知技術(shù)，可以舉出例如使用冷凍干燥機(jī)將裝有含有重組細(xì)胞的二甲基甲酰胺等的溶液的安瓿抽成真空，然后在4 25°C下保存的方法等。除此之外還可以舉出液氮方法，即，將細(xì)胞懸濁于添加有10%丙三醇的保存培養(yǎng)基中，將其回收至專用安瓿中并保存在液氮灌(-150 -196°C )中。 B-9.與上述多肽具有親和性的抗體本發(fā)明還提供一種與E2多肽具有親和性的抗體(IgG抗體)。單克隆抗體及多克隆抗體可以按照現(xiàn)有的方法制備。具體而言，可以按照上述 A-9.部分所述的方法制備。B-10.檢測或測定上沭多肽的免疫學(xué)方法進(jìn)而，本發(fā)明提供一種使用上述抗體檢測或測定E2多肽的免疫學(xué)方法。具體而言，上述免疫學(xué)方法可以按照上述A-10.部分所述的方法進(jìn)行。作為用于檢測或測定E2多肽的試劑盒，本發(fā)明提供一種含有上述抗體的免疫學(xué)檢測用試劑盒。根據(jù)需要上述檢測用試劑盒可以含有E2多肽作為標(biāo)準(zhǔn)品。并且，為了能在上述條件下簡便進(jìn)行E2多肽的檢測，根據(jù)需要上述檢測用試劑盒還可以含有其他所需的試劑等。另外，為了簡便地進(jìn)行E2多肽的檢測，上述檢測用試劑盒可以含有必要的器具或操作手冊。B-11.檢測或測定編碼上沭多肽的多核苷酸的方法另外，本發(fā)明提供一種檢測或測定E2多核苷酸的方法。具體而言，上述方法通過使結(jié)合于E2多核苷酸的探針與受試樣品相接觸而進(jìn)行，可以按照上述A-11.部分所述的方法進(jìn)行。進(jìn)而，作為用于檢測或測定E2多核苷酸的試劑盒，本發(fā)明提供一種含有上述探針的E2多核苷酸檢測用試劑盒。為了能在上述條件下簡便地進(jìn)行E2多核苷酸的檢測，根據(jù)需要上述檢測用試劑盒中除上述探針之外還可以含有所需試劑等。另外，上述檢測用試劑盒還可以用作用于鑒定含有E2多核苷酸的細(xì)胞的試劑盒。另外，從可以使檢測精度高這一觀點(diǎn)考慮，作為檢測用試劑盒優(yōu)選舉出使用PCR進(jìn)行檢測的試劑盒。
C.雌馬酚合成酶C-1.多狀作為以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚的多肽，本發(fā)明提供下述(Ca) (Ce)的多肽(以下也將該多肽記為“E3多肽”)(Ca)多肽，由序列號13所示的氨基酸序列組成；(Cb)多肽，由在序列號13所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚的活性；(Ce)多肽，由與序列號13所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚的活性。上述(Cb)多肽中，對于“一個或多個”的范圍沒有特殊限定，只要該多肽具有以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚的活性即可，可以舉出例如I 200個，優(yōu)選I 150個，較優(yōu)選I 100個，較優(yōu)選I 50個，較優(yōu)選I 45個，較優(yōu)選I 40個，較優(yōu)選I 30個， 較優(yōu)選I 15個，更優(yōu)選I 5個，更較優(yōu)選I 4個，特別優(yōu)選I 3個，更特別優(yōu)選I 或2個。作為上述(Cb)多肽的具體例子，可以舉出例如由序列號14所示的氨基酸序列組成的多肽及由序列號15所示的氨基酸序列組成的多肽。與序列號13所示的氨基酸序列相比較，序列號14所示的氨基酸序列含有2個被取代的氨基酸。與序列號13所示的氨基酸序列相比較，序列號15所示的氨基酸序列含有42個被取代的氨基酸并在C末端添加I個氨基酸(谷氨酸)。序列號14所示的氨基酸序列相當(dāng)于來自于卵形假桿菌E-23-15株(FERM BP-6435號)的E3酶。序列號15所示的氨基酸序列相當(dāng)于來自咽峽炎鏈球菌A6G-225株 (FERM BP-6437 號)的 E3 酶。上述(Cb)多肽中“氨基酸的取代、缺失、插入或添加”可以以上述A-1.部分所述的 El多肽中的取代、缺失、插入或添加為基準(zhǔn)而得到。上述(Cb)多肽中氨基酸的取代、缺失、 插入或添加，優(yōu)選發(fā)生在對多肽的高級結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生大的影響的區(qū)域或?qū)τ谧鳛榇岂R酚合成酶的活性中心不產(chǎn)生影響的區(qū)域。作為上述區(qū)域可以舉出例如在序列號13、14及15所示的氨基酸序列間的低保守區(qū)域及其周邊，或N末端區(qū)域或C末端區(qū)域。具體而言，在序列號 13所示的氨基酸序列中，可以舉出第3位的谷氨酸、第28位的精氨酸、第29位的谷氨酸、第 32位的精氨酸、第61位的天冬酰胺、第80位的異亮氨酸、第92位的天冬酰胺、第112位的天冬氨酸、第119位的丙氨酸、第129位的天冬酰胺、第172位的天冬氨酸、第174位的丙氨酸、第204位的絲氨酸、第206位的谷氨酸、第223位的蘇氨酸、第230位的纈氨酸、第244位的脯氨酸、第246位的酪氨酸、第280位的蘇氨酸、第282位的精氨酸、第285位的丙氨酸、 第307位的纈氨酸、第322位的丙氨酸、第347位的谷氨酸、第359位的甘氨酸、第360位的絲氨酸、第366位的丙氨酸、第367位的亮氨酸、第368位的異亮氨酸、第372位的纈氨酸、 第373位的天冬氨酸、第374位的蘇氨酸、第377位的丙氨酸、第380位的丙氨酸、第381位的天冬氨酸、第399位的谷氨酰胺、第403位的脯氨酸、第404位的蛋氨酸、第405位的纈氨酸、第406位的谷氨酸、第407位的甘氨酸、第426位的精氨酸、第434位的纈氨酸、第436 位的丙氨酸、 第438位的酪氨酸、及第440位的丙氨酸及上述氨基酸的周邊區(qū)域。上述“周邊區(qū)域”是在對雌馬酚合成酶活性不產(chǎn)生影響的范圍內(nèi)，以上述特定位置的氨基酸為基點(diǎn)， 前后5個以內(nèi)的氨基酸，優(yōu)選前后4個的氨基酸，較優(yōu)選前后3個的氨基酸，更優(yōu)選前后2個的氨基酸，特別優(yōu)選前后I個的氨基酸。作為上述低保守區(qū)域及其周邊，優(yōu)選舉出在序列號13所示的氨基酸序列中相當(dāng)于第25位 第35位的區(qū)域、相當(dāng)于第170位 177位的區(qū)域、相當(dāng)于第201位 第208位的區(qū)域、相當(dāng)于242位 248位的區(qū)域、相當(dāng)于第276位 第289位的區(qū)域、相當(dāng)于第355位 第385位的區(qū)域、相當(dāng)于第396位 第409位的區(qū)域、 及相當(dāng)于第431位 第443位的區(qū)域。序列號13所示的氨基酸序列中的第14位 第19位的氨基酸序列被認(rèn)為相當(dāng)于 FAD結(jié)合域。因此，只要不阻礙該結(jié)合域的功能，則可以在上述序列中取代、缺失、插入或添加任意氨基酸。但優(yōu)選第14位的甘氨酸、第16位的甘氨酸及第19位的甘氨酸不發(fā)生變異。 上述序列中氨基酸被取代、缺失、插入或添加時，優(yōu)選3個以下的氨基酸、較優(yōu)選2個以下的氨基酸、更優(yōu)選I個的氨基酸發(fā)生變異，最優(yōu)選不發(fā)生變異。圖29表示序列號13、14及15所示的氨基酸序列的比對情況。相對于序列號13所示的氨基酸序列，上述(Ce)多肽中氨基酸的同一性例如可以為60%以上，但通常為80%以上，優(yōu)選85%以上，更優(yōu)選90%以上，較優(yōu)選95%以上，特別優(yōu)選98 %以上，更特別優(yōu)選99 %以上。作為上述(Ce)多肽的具體例子，可以舉出由序列號14所示的氨基酸序列組成的多肽及由序列號15所示的氨基酸序列組成的多肽。序列號13所示的氨基酸序列與序列號 14所示的氨基酸序列的同一性為99. 6%，序列號13所示的氨基酸序列與序列號15所示的氨基酸序列的同一'I"生為90.9% (Blast2)。因此,在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，(Ce)多肽與序列號14所不的氨基酸序列的同一'I"生優(yōu)選為90. 9%以上,較優(yōu)選為99. 6%以上。在上述(Cb)及(Ce)的多肽中，“以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚的活性”可以通過以下方式確證。S卩，將用作確認(rèn)對象的多肽加入下述組成的底物溶液中使其濃度為 O. 001mg/mL，在37°C下溫育2小時后，確證溶液中是否存在雌馬酚。確證溫育后溶液中存在雌馬酚時，判定上述多肽具有“以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚的活性”。底物溶液的組成
0.1 M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)
1mM PMSF(苯曱基磺酰氟)
2mM 二疏蘇糖醇 5mM連二亞琉酸納
40 uM四氫黃豆苷元酶特件E3多肽具有以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚的酶活性。因此，E3多肽也被稱為 E3酶。E3的最適溫度在23 37 °C左右，最適pH為4. 5。E3酶不僅可以以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚，還可以進(jìn)行其逆反應(yīng)，即以雌馬酚為底物合成四氫黃豆苷元。E3多肽與El多肽或E2多肽相同,可以基于序列號16、17或18所不的核苷酸序列信息通過基 因工程技術(shù)進(jìn)行制備。另外，也可以基于序列號13、14、或15所示的氨基酸序列信息通過化學(xué)合成法制備。并且，E3多肽也可以通過從能產(chǎn)生E3多肽的微生物中分離和純化而得到。上述方法可以按照上述A-1.部分的記述而進(jìn)行。能產(chǎn)生E3多肽的微生物可以在含有所需量的四氫黃豆苷兀的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這種情況下，可以由能產(chǎn)生E3多肽的微生物產(chǎn)生E3多肽。另外，E3多肽可以以單體形式存在，但只要具有雌馬酚合成能力，也可以以二聚體或多聚物的形式存在。另外，為了提高E3多肽的穩(wěn)定性等，可以根據(jù)需要添加聚乙二醇或糖鏈對E3多肽進(jìn)行修飾。E3多肽可以發(fā)揮催化作用，即催化以四氫黃豆苷元為底物轉(zhuǎn)換為雌馬酚的反應(yīng)。 一般認(rèn)為雌馬酚是在體內(nèi)發(fā)揮多種生理作用的物質(zhì)，從此方面考慮通常認(rèn)為能提供雌馬酚的E3多肽是重要的。如上所述，本發(fā)明提供一種含有上述(Ca) (Ce)多肽的雌馬酚合成酶。C-2.多核苷酸本發(fā)明還提供一種多核苷酸(以下也將該多核苷酸記為“E3多核苷酸”)，所述多核苷酸編碼具有以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚活性的多肽。具體而言，提供下述 (Cd) (Cf)的多核苷酸作為E3多核苷酸 (Cd)多核苷酸，由序列號16所示的核苷酸序列組成；(Ce)多核苷酸，編碼由序列號13所示的氨基酸序列組成的多肽；(Cf)多核苷酸，與上述(Cd)或(Ce)的多核苷酸的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有以四氫黃豆苷元為底物生成雌馬酚活性的多肽。序列號13所示的氨基酸序列相當(dāng)于序列號16所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。序列號14所示的氨基酸序列相當(dāng)于序列號17所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。 序列號15所示的氨基酸序列相當(dāng)于序列號18所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。上述(Cf)的多核苷酸中的“在嚴(yán)格條件下雜交”與上述A-2.部分所述的“在嚴(yán)格條件下雜交”意義相同。作為(Cf)的多核苷酸的具體例子，可以舉出序列號17所示的核苷酸序列及序列號18所示的核苷酸序列。序列號16所示的核苷酸序列與序列號17所示的核苷酸序列的堿基序列的同一性為99. 8%，序列號16所示的核苷酸序列與序列號18所示的核苷酸序列的同一'I"生為85. 2%。因此,在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，(Cf)的多核苷酸與序列號16所示的核苷酸序列具有85. 2%以上的同源性，較優(yōu)選具有99. 8%以上的同源性。另外，上述(Cf)的多核苷酸中，“以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚的活性”使用與上述(Cb)或(Ce)多肽相同的方法進(jìn)行確證。E3多核苷酸可以基于序列號16、17、或18所示的序列信息通過化學(xué)DNA合成法或基因工程技術(shù)制備·獲得。作為具體方法，可以使用在上述A-2.部分所述的方法。對于E3多核苷酸的cDNA的來源沒有特殊限定，只要為表達(dá)E3多核苷酸的微生物即可。具體而言，可以舉出能產(chǎn)生雌馬酚的微生物，優(yōu)選能產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌、屬于擬桿菌屬的細(xì)菌及屬于鏈球菌屬的細(xì)菌，更優(yōu)選能產(chǎn)生雌馬酚的格氏乳球菌、卵形假桿菌、及咽峽炎鏈球菌，特別優(yōu)選能產(chǎn)生雌馬酚的來源于糞便的格氏乳球菌，特別優(yōu)選能產(chǎn)生雌馬酚的來源于糞便的作為格氏乳球菌的乳球菌20-92株(FERM BP-10036號；保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心)、卵形假桿菌E-23-15株(FERM BP-6435號； 保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心)、咽峽炎鏈球菌A6G-225株(FERM BP-6437號；保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番I號))。使用常規(guī)的基因工程學(xué)方法，使E3多核苷酸表達(dá)，由此可以容易地、大量且穩(wěn)定地制備出該多核苷酸的產(chǎn)物(即上述多肽)。一直以來，關(guān)于雌馬酚的產(chǎn)生菌只發(fā)現(xiàn)了難以處理的厭氧性菌株，但通過成功分離E3多核苷酸，也可以不使用現(xiàn)有的雌馬酚產(chǎn)生菌，為雌馬酚的工業(yè)制備開辟了一條新道路。C-3.表汰載體對于本發(fā)明的表達(dá)載體沒有特殊限定，只要含有E3多核苷酸并且能表達(dá)該E3多核苷酸即可，含有E3多核苷酸的表達(dá)載體與含有El多核苷酸的表達(dá)載體相同,一般可以根據(jù)與宿主細(xì)胞的關(guān)系進(jìn)行適當(dāng)選擇。作為具體的宿主細(xì)胞，可以使用上述A-3.部分所述的宿主細(xì)胞。C-4.重纟目細(xì)朐本發(fā)明提供一種重組細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)，所述重組細(xì)胞由上述含有E3多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到。對于用于重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞沒有特殊限定，可以為上述A-4.部分所述的宿主細(xì)胞。另外，可以按照上述A-4.部分所述的方法將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。 由于上述重組細(xì)胞能產(chǎn)生作為雌馬酚轉(zhuǎn)換酶的E3多肽，因此可用于制備雌馬酚轉(zhuǎn)換酶，另外上述重組細(xì)胞也可以以細(xì)胞的形態(tài)用于雌馬酚的制備。C-5.使用重組細(xì)胞的多肽的制備將導(dǎo)入了 E3多核苷酸的重組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中回收E3多肽，由此制備E3 多肽。可以按照上述A-5.部分的記述進(jìn)行培養(yǎng)。C-6.使用E3多肽的雌馬酚的制備本發(fā)明提供一種使用E3多肽制備雌馬酚的制備方法。即，使用上述制備方法，通過使E3多肽作用于四氫黃豆苷元，而將四氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為雌馬酚。該制備方法中使用的反應(yīng)可以在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行。具體而言，可以使用上述 A-6.部分所述的緩沖液。該制備方法中使用的反應(yīng)如下進(jìn)行例如在反應(yīng)開始時在緩沖液(反應(yīng)開始時的原料混合物)中在下述的濃度范圍內(nèi)加入各組分，在上述E3多肽、四氫黃豆苷元等原料及雌馬酚等的產(chǎn)物不變質(zhì) 不失活的溫度條件下，溫育O. 5 10小時，優(yōu)選I 6小時，更優(yōu)選2 4小時。只要為上述溫度條件即可，對于反應(yīng)溫度沒有特殊限定，但例如設(shè)定為(TC以下時，使用在此反應(yīng)溫度下不凍結(jié)的緩沖液等。反應(yīng)溫度優(yōu)選O 45°C，更優(yōu)選O 37°C。上述E3多肽含量為0.0001 I. O重量％，優(yōu)選O. 001 O. I重量％，更優(yōu)選 O. 001 O. 01 重量 ％ ；四氫黃豆苷元含量為O. 0001 10. O重量％,優(yōu)選O. 001 I. O重量更優(yōu)選 O. 001 O. I 重量％。另外，作為用于合成雌馬酚的混合原料，本發(fā)明提供一種含有(Ci)E3多肽及 (Cii)四氫黃豆苷元的雌馬酚合成原料組合物。通過在上述條件下溫育上述合成原料組合物，可以將該合成原料組合物中的四氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為雌馬酚。上述合成原料組合物相當(dāng)于在上述雌馬酚的制備中反應(yīng)開始時的原料混合物，在該合成原料組合物中的E3多肽的配合濃度、四氫黃豆苷元的配合濃度、及可以配合于該合成原料組合物中的其他組分等，都與上述制備方法中使用的反應(yīng)體系(反應(yīng)開始時的原料混合溶液)相同。進(jìn)而，作為用于合成雌馬酚的試劑盒，本發(fā)明提供一種含有(Ci)E3多肽及(Cii) 四氫黃豆苷元的雌馬酚合成用試劑盒。為了能在上述條件下簡便地由四氫黃豆苷元合成雌馬酚，各組分可以根據(jù)需要分別儲存在上述合成用試劑盒中。另外，根據(jù)需要上述合成用試劑盒中可以含有所需的緩沖液。并且，為了簡便地進(jìn)行雌馬酚的合成，上述合成用試劑盒可以含有必要的器具或操作手冊。C-7.雌馬酚合成酶纟目合物本發(fā)明還提供一種含有E3多肽的雌馬酚合成酶組合物。上述酶組合物在使用了 E3多肽的雌馬酚的制備方法中優(yōu)選用作雌馬酚合成酶。上述酶組合物可以為粗純化狀態(tài)的E3多肽，也可以為粗純化或純化的E3多肽與適當(dāng)載體配合形成的物質(zhì)。該載體為對E3多肽的活性不產(chǎn)生不良影響的物質(zhì)，適量配合進(jìn)行使用。上述酶組合物中，對于E3多肽的配合比例沒有特殊限定，只要在上述雌馬酚的制備方法中能作為雌馬酚合成酶使用即可。具體而言，相對于上述酶組合物的總量，E3多肽例如為O. 001 20. O重量％，優(yōu)選為O. 005 5. O重量％，更優(yōu)選為O. 01 I. O重量％ 。進(jìn)而，為了提高上述多肽的穩(wěn)定性及/或確保上述酶組合物的保存性，上述酶組合物除了含有E3多肽之外，還可以添加如上述A-7.部分所述的各種抗氧化劑或防腐劑。C-8.使用上述重組細(xì)胞的雌馬酚的制備方法本發(fā)明提供一種雌馬酚的制備方法，該制備方法使用導(dǎo)入了 E3多核苷酸的重組細(xì)胞。即，使用上述制備方法，通過使上述重組細(xì)胞作用于四氫黃豆苷元而使四氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為雌馬酚。本制備方法使用的反應(yīng)在上述重組細(xì)胞能夠存活并且能將四氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為雌馬酚的條件下進(jìn)行。具體而言，是在上述重組細(xì)胞能生長的培養(yǎng)基中，加入適量的上述重組細(xì)胞及四氫黃豆苷元進(jìn)行培養(yǎng)而進(jìn)行。本制備方法中使用的培養(yǎng)基，可以根據(jù)作為重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞使用的細(xì)胞種類從慣用的各種培養(yǎng)基中進(jìn)行適當(dāng)選擇。另外，上述培養(yǎng)基中，根據(jù)需要可以添加適量的PMSF、EDTA等蛋白酶抑制劑。另夕卜，考慮到上述多肽來源于厭氧性菌，因此可以添加適量的DTT、2ME、DET、連二亞硫酸鈉等還原劑。另外，使用上述重組細(xì)胞時，并非必須加入NADPH及/或NADH，但可以根據(jù)需要在培養(yǎng)基中添加NADPH及/或NADH。具體而言，本制備方法如下進(jìn)行將上述重組細(xì)胞接種在含有O. 001 I重量％、 優(yōu)選O. 01 O. 5重量％、更優(yōu)選O. 01 O. I重量％的四氫黃丑苷兀的培養(yǎng)基中，在可以生長的溫度條件下培養(yǎng)7 30小時，優(yōu)選15 24小時，更優(yōu)選17 20小時。此處，對于可以生長的溫度條件沒有特殊限定，可以在與上述C-6.部分所述的溫度相同的溫度下進(jìn)行。另外，作為用于合成雌馬酚的混合原料，本發(fā)明提供一種含有(Ciii)上述重組細(xì)胞及(Cii)四氫黃豆苷元的雌馬酚合成原料組合物。通過在上述條件下培養(yǎng)上述合成原料組合物，可以將該合成原料組合物中的四氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為雌馬酚。上述合成原料組合物相當(dāng)于在上述雌馬酚的制備中反應(yīng)開始時的原料混合物，在該合成原料組合物中的上述重組細(xì)胞及四氫黃豆苷元的濃度，及可以配合于該合成原料組合物中的其他組分等，都與上述制備方法中采用的條件等相同。進(jìn)而，作為用于合成雌馬酚的試劑盒，本發(fā)明提供一種含有(Ciii)上述重組細(xì)胞及(Cii)四氫黃豆苷元的雌馬酚合成用試劑盒。為了能在上述條件下簡便地由四氫黃豆苷元合成雌馬酚，上述重組細(xì)胞和四氫黃豆苷元可以根據(jù)需要分別儲存在上述合成用試劑盒中。另外，根據(jù)需要上述合成用試劑盒中可以含有緩沖液或培養(yǎng)基。并且，為了簡便地進(jìn)行雌馬酚的合成，上述合成用試劑盒可以含有必要的器具或操作手冊。需要說明的是，包含于上述合成用試劑盒中的上述重組細(xì)胞可以使用公知的方法進(jìn)行保存。作為保存重組細(xì)胞的公知技術(shù)，可以舉出例如使用冷凍干燥機(jī)將裝有含有重組細(xì)胞的二甲基甲酰胺等溶液的安瓿抽成真空，然后在4 25°C下保存的方法等。除此之外還可以舉出液氮方法，即，將細(xì)胞懸濁于添加有10%丙三醇的保存培養(yǎng)基中，將其回收至專用安瓿中并保存在液氮灌(-150 -196°C )中。C-9.與上述多肽具有親和性的抗體本發(fā)明還提供一種與E3多肽具有親和性的抗體(IgG抗體)。 單克隆抗體及多克隆抗體可以按照現(xiàn)有的方法制備。具體而言，可以按照上述 A-9.部分所述的方法制備。C-10.檢測或測定上述多肽的免疫學(xué)方法進(jìn)而，本發(fā)明提供一種使用上述抗體檢測或測定E3多肽的免疫學(xué)方法。具體而言，上述免疫學(xué)方法可以按照上述A-10.部分所述的方法進(jìn)行。作為用于檢測或測定E3多肽的試劑盒，本發(fā)明提供一種含有上述抗體的免疫學(xué)檢測用試劑盒。根據(jù)需要上述檢測用試劑盒中可以含有E3多肽作為標(biāo)準(zhǔn)品。并且，為了能在上述條件下簡便地進(jìn)行E3多肽的檢測，根據(jù)需要上述檢測用試劑盒還可以含有所需的試劑等。另外，為了簡便地進(jìn)行E3多肽的檢測，上述檢測用試劑盒可以含有必要的器具或操作手冊。C-II.檢測或測定編碼上沭多肽的多核苷酸的方法另外，本發(fā)明提供一種檢測或測定E3多核苷酸的方法。具體而言，上述方法通過使結(jié)合于E3多核苷酸的探針與受試樣品相接觸而進(jìn)行，可以按照上述A-11.部分所述的方法進(jìn)行。進(jìn)而，作為用于檢測或測定E3多核苷酸的試劑盒，本發(fā)明提供一種含有上述探針的E3多核苷酸檢測用試劑盒。為了能在上述條件下簡便地進(jìn)行E3多核苷酸的檢測，根據(jù)需要上述檢測用試劑盒除含有上述探針外還可以含有所需的試劑等。另外，上述檢測用試劑盒還可以作為用于鑒定含有E3多核苷酸的細(xì)胞的試劑盒。另外，從可以使檢測精度高這一觀點(diǎn)考慮，作為上述檢測用試劑盒優(yōu)選舉出使用PCR進(jìn)行檢測的試劑盒。D.使用El E3酶的雌馬酚或其中間體的制備方法D-I-1.包括第I步驟及第2步驟的四氫黃豆苷元的制備方法本發(fā)明提供一種包括以下第I步驟及第2步驟的四氫黃豆苷元的制備方法(以下也將該制備方法記為“第I制備方法”)。其中，所述第I步驟由黃豆苷元生成二氫黃豆苷元，所述第2步驟由二氫黃豆苷元生成四氫黃豆苷元。(第I步驟)通過使由下述(Aa) (Ac)中任一種多肽組成的酶、及NADPH及/或NADH作用于黃豆苷元，生成二氫黃豆苷元的步驟；(Aa)多肽，由序列號I所示的氨基酸序列組成；(Ab)多肽，由在序列號I所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的活性；(Ac)多肽，由與序列號I所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的活性。(第2步驟)通過使由下述(Ba) (Be)中任一種多肽(以下也將該多肽記為“E2 多肽”)組成的酶、及NADPH及/或NADH作用于二氫黃豆苷元，生成四氫黃豆苷元的步驟；(Ba)多肽，由序列號7所示的氨基酸序列組成；(Bb)多肽，由在序列號7所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性； (Be)多肽，由與序列號7所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性。使用本發(fā)明的第I制備方法可以由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元，由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元。第I步驟第I步驟中，在NADPH及/或NADH的存在下使由El多肽組成的酶作用于黃豆苷元，由此將黃豆苷元轉(zhuǎn)換為二氫黃豆苷元。第I步驟中采用的反應(yīng)如下實施在上述含有由 El多肽組成的酶、黃豆苷元及NADPH及/或NADH溶液中，在使上述由El多肽組成的酶、黃豆苷元等原料及二氫黃豆苷元等產(chǎn)物不變質(zhì) 不滅活的溫度條件及時間下溫育而進(jìn)行。具體而言，可以在上述A-6.部分所述的條件下進(jìn)行。上述第I步驟和下述第2步驟在相同條件下進(jìn)行時，從第I及第2步驟兩個步驟都能有效地進(jìn)行這一觀點(diǎn)考慮，使用的反應(yīng)如下實施配制原料混合物使在反應(yīng)開始時的反應(yīng)體系(反應(yīng)開始時的原料混合物)中各組分滿足下述濃度范圍，并在15 45°C、優(yōu)選 25 40°C、更優(yōu)選30 38°C的溫度條件下，溫育O. 5 10小時、優(yōu)選I 6小時、更優(yōu)選 2 4小時由El多肽組成的酶的含量為O. 0001 I. O重量％，優(yōu)選O. 001 O. I重量％，更優(yōu)選O. 001 O. 01重量％ ；黃豆苷元的含量為0.0001 10. O重量％，優(yōu)選O. 001 1.0重量％，更優(yōu)選 O. 001 O. I重量％ ;及NADPH/或NADH的含量為O. 01 5重量％，優(yōu)選O. 05 I重量％，更優(yōu)選O. I
O. 5重量％。對第I步驟中作為底物使用的黃豆苷元的來源沒有特殊限定。例如可以使用市售的黃豆苷元，也可以使用通過適宜方法生成或合成的黃豆苷元。另外，作為第I步驟中用于生成二氫黃豆苷元的混合原料，例如可以使用含有 (Ai)由El多肽組成的酶、(Aii) NADPH及/或NADH及(Aiii)黃豆苷元的二氫黃豆苷元合成原料組合物。通過在上述條件下溫育上述合成原料組合物，可以使該合成原料組合物中的黃豆苷元轉(zhuǎn)換為二氫黃豆苷元。上述合成原料組合物在上述A-6.及A-7.部分已詳細(xì)說明。第2步驟第2步驟中，在NADPH及/或NADH的存在下使由E2多肽組成的酶作用于二氫黃豆苷元，由此將二氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為四氫黃豆苷元。第2步驟中使用的反應(yīng)例如可以如下實施在上述含有由E2多肽組成的酶、二氫黃豆苷元及NADPH及/或NADH的溶液中在使上述由E2多肽組成的酶、二氫黃豆苷元等原料及四氫黃豆苷元等產(chǎn)物不變質(zhì)·不滅活的溫度條件及時間下溫育而進(jìn)行。具體而言，可以在上述B-6.部分所述的條件下進(jìn)行。四氫黃豆苷元存在順式及反式構(gòu)型，通過改變上述反應(yīng)溫度或時間等條件可以控制順式及反式構(gòu)型的形成。例如，將反應(yīng)溫度設(shè)定為o°c時，可以生成混合有順式及反式構(gòu)型的四氫黃豆苷元，將反應(yīng)溫度設(shè)定為37°c時，可以使反式構(gòu)型優(yōu)先生成。另外，上述第I步驟和第2步驟在相同條件下進(jìn)行時，從第I及第2步驟兩個步驟都能有效地進(jìn)行這一觀點(diǎn)考慮，所采用的反應(yīng)可以如下實施在與上述“第I步驟”項中所述的第I步驟和第2步驟在相同條件下進(jìn)行時的條件下溫育兩者而進(jìn)行。在這種情況下， 由E2多肽組成的酶、二氫黃豆苷元、及NADPH及/或NADH的濃度可以如下設(shè)定
由E2多肽組成的酶的含量為O. 0001 I. O重量％，優(yōu)選O. 001 O. I重量％，更優(yōu)選O. 001 O. 01重量％ ；二氫黃丑苷兀的含量為O. 0001 10. O重量％,優(yōu)選O. 001 I. O重量％,更優(yōu)選 O. 001 O. I重量％ ;及NADPH及/或NADH的含量為O. 01 5重量％，優(yōu)選O. 05 I重量％，更優(yōu)選O. I
O. 5重量％。但是，在由El多肽組成的酶及由E2多肽組成的酶共存的條件下進(jìn)行第I步驟和第2步驟時，從有效進(jìn)行使用由El多肽組成的酶生成二氫黃豆苷元的反應(yīng)這一觀點(diǎn)考慮， 需要加入NADPH。上述條件下，NADPH的濃度基于上述“第I步驟”項中所述的與第I步驟和第2步驟在相同條件下進(jìn)行時的條件而確定。并且，將與NADPH同時使用的NADH的濃度設(shè)定為O. 01 5重量％，優(yōu)選O. 05 I重量％，更優(yōu)選O. I O. 5重量％。第2步驟中，對于作為底物使用的二氫黃豆苷元的來源也沒有限定。例如，可以將第I步驟中由黃豆苷元生成的二氫黃豆苷元作為第2步驟中的底物使用。上述情況下，二氫黃豆苷元可以以第I步驟中生成的含有二氫黃豆苷元的溶液形式使用，也可以以粗純化形式或純化的形式使用。另外，例如可以使用市售的二氫黃豆苷元，也可以使用通過適宜方法合成的二氫黃豆苷元。另外，作為第2步驟中用于合成四氫黃豆苷元的混合原料，可以使用含有(Bi)由 E2多肽組成的酶、(Bii)NADPH及/或NADH及(Biii) 二氫黃豆苷元的四氫黃豆苷元合成原料組合物。通過在上述條件下溫育上述合成原料組合物，可以將該合成原料組合物中的二氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為四氫黃豆苷元。上述合成原料組合物在上述B-6.及B-7.部分已詳細(xì)說明。第2步驟中，作為其底物優(yōu)選使用在第I步驟中由黃豆苷元生成的二氫黃豆苷元，也可以將市售的二氫黃豆苷元、上述合成原料組合物及上述酶組合物等與上述第I步驟中生成的二氫黃豆苷元混合使用。Ej多狀及E2多狀本發(fā)明的第I制備方法中，使用上述A-1.中所述的由El多肽組成的酶及上述 B-1.所述的由E2多肽組成的酶。D-I-2.通過第I制備方法制備的含有四氫黃豆苷元的產(chǎn)物本發(fā)明提供一種由包括第I步驟及第2步驟的四氫黃豆苷元的制備方法(第I制備方法)制備的、含有四氫黃豆苷元的產(chǎn)物。如上所述，使用本發(fā)明的第I制備方法可以由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元，并由
二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元。因此，通過本發(fā)明的第I制備方法制備的含有四氫黃豆苷元的產(chǎn)物中，不僅含有四氫黃豆苷元，還可能含有二氫黃豆苷元和/或黃豆苷元。另外，本發(fā)明的產(chǎn)物可以以由第I制備方法得到的溶液的形式使用，也可以以通過從該溶液中粗純化或純化得 到的四氫黃豆苷元等的產(chǎn)物的形式使用。本發(fā)明的產(chǎn)物可以在食品、飲料、化妝用品、藥品等中配合使用，也可以作為底物使用。D-I-3.包括第2步驟及第3步驟的雌馬酚的制備方法本發(fā)明提供一種包括以下第2步驟及第3步驟的雌馬酚的制備方法(以下也將該制備方法記為“第2制備方法”)。其中，所述第2步驟由二氫黃豆苷元生成四氫黃豆苷元， 所述第3步驟由四氫黃豆苷元生成雌馬酚。通過使由下述(Ba) (Be)中任一種多肽(以下也將該多肽記為“E2多肽”)組成的酶、及NADPH及/或NADH作用于二氫黃豆苷元，生成四氫黃豆苷元的步驟；(Ba)多肽，由序列號7所示的氨基酸序列組成；(Bb)多肽，由在序列號7所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性；(Be)多肽，由與序列號7所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元的活性。(第3步驟)通過使由下述(Ca) (Ce)中任一種多肽(以下也將該多肽記為“E3 多肽”)組成的酶作用于四氫黃豆苷元，制備雌馬酚的步驟；(Ca)多肽，由序列號13所示的氨基酸序列組成；(Cb)多肽，由在序列號13所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚的活性；(Ce)多肽，由與序列號13所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚的活性。使用本發(fā)明的第2制備方法，可以由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元，由四氫黃豆苷元制備雌馬酚。第2步驟本發(fā)明的第2制備方法中的第2步驟與上述第I制備方法中的第2步驟相同。
需要說明的是，第2步驟和下述第3步驟在相同條件下進(jìn)行時，從第2及第3步驟兩個步驟都能有效地進(jìn)行這一觀點(diǎn)考慮，所使用的反應(yīng)可以如下實施配制原料混合物使在反應(yīng)開始時的反應(yīng)體系(反應(yīng)開始時的原料混合物)中各組分滿足下述濃度范圍，并在 15 45°C、優(yōu)選25 40°C、更優(yōu)選30 38°C的溫度條件下，溫育O. 5 10小時、優(yōu)選I 6小時、更優(yōu)選2 4小時而進(jìn)行由E2多肽組成的酶的含量為O. 0001 I. O重量％，優(yōu)選O. 001 O. I重量％，更優(yōu)選O. 001 O. 01重量％ ；二氫黃丑苷兀的含量為O. 0001 10. O重量％,優(yōu)選O. 001 I. O重量％,更優(yōu)選 O. 001 O. I重量％ ;及NADPH及/或NADH的含量為O. 01 5重量％，優(yōu)選O. 05 I重量％，更優(yōu)選O. I O. 5重量％。第3步驟第3步驟中，通過將由E3多肽組成的酶作用于四氫黃豆苷元，使四氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為雌馬酚。第3步驟使用的反應(yīng)如下實施在含有上述由E3多肽組成的酶、四氫黃豆苷元的溶液中在使上述由E3 多肽組成的酶、四氫黃豆苷元等原料及雌馬酚等產(chǎn)物不變質(zhì) 不滅活的溫度條件及時間下溫育而進(jìn)行。具體而言，可以在上述A-6.部分所述的條件進(jìn)行該反應(yīng)。上述第2步驟和第3步驟在相同條件下進(jìn)行時，從第2及第3步驟兩個步驟都能有效地進(jìn)行這一觀點(diǎn)考慮，所使用的反應(yīng)可以如下實施在上述“第2步驟”項中所述的在與第2步驟和第3步驟在相同條件下進(jìn)行時的條件下溫育兩者而進(jìn)行。上述情況下，由E3 多肽組成酶、四氫黃豆苷元、及NADPH及/或NADH的濃度可以如下設(shè)定由E3多肽組成的酶的含量為O. 0001 I. O重量％，優(yōu)選O. 001 O. I重量％，更優(yōu)選O. 001 O. 01重量％ ；四氫黃豆苷元的含量為O. 0001 10. O重量％,優(yōu)選O. 001 I. O重量更優(yōu)選 O. 001 O. I重量％ ;及NADPH及/或NADH的含量為O. 01 5重量％，優(yōu)選O. 05 I重量％，更優(yōu)選O. I
O. 5重量％。第3步驟中，對于作為底物使用的四氫黃豆苷元的來源也沒有限制。例如，可以使用第2步驟中由二氫黃豆苷元生成的四氫黃豆苷元作為第3步驟中的底物。上述情況下，該四氫黃豆苷元可以以第2步驟中生成的含有四氫黃豆苷元的溶液形式使用，也可以以粗純化形式或純化的形式使用。另外，例如可以使用市售的四氫黃豆苷元，也可以使用通過適宜方法合成的四氫黃豆苷元。另外，作為第3步驟中用于合成雌馬酚的混合原料，可以使用含有(Ci)由E3多肽組成的酶及(Cii)四氫黃豆苷元的雌馬酚合成原料組合物。通過在上述條件下溫育上述合成原料組合物，可以使該合成原料組合物中的四氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為雌馬酚。上述合成原料組合物在上述C-6.及C-7.部分已詳細(xì)說明。第3步驟中，作為其底物優(yōu)選使用第2步驟中由二氫黃豆苷元生成的四氫黃豆苷元，也可以將市售的四氫黃豆苷元、上述合成原料組合物及上述酶組合物等與上述第2步驟中生成的四氫黃豆苷元混合使用。E2多狀及E3多狀本發(fā)明的第2制備方法中，使用上述B-1.部分所述的由E2多肽組成的酶及上述 C-1.部分所述的由E3多肽組成的酶。D-I-4.通過第2制備方法制備的含有雌馬酚的產(chǎn)物本發(fā)明提供一種含有雌馬酚的產(chǎn)物，由包括第2步驟及第3步驟的雌馬酚的制備方法(第2制備方法)制備得到。如上所述，使用本發(fā)明的第2制備方法可以由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元， 由四氫黃豆苷元制備雌馬酚。因此，通過本發(fā)明的第2制備方法制備的含有雌馬酚的產(chǎn)物中，不僅含有雌馬酚， 還可能含有四氫黃豆苷元和/或二氫黃豆苷元。另外，本發(fā)明的產(chǎn)物可以以由第2制備方法得到的溶液的形式使用，也可以以通過從該溶液中粗純化或純化得到的雌馬酚等的產(chǎn)物的形式使用。
本發(fā)明的產(chǎn)物可以在食品、飲料、化妝用品、藥品等中配合使用，也可以作為底物使用。D-I-5.包括第I步驟 第3步驟的、雌馬酚的制備方法本發(fā)明提供一種包括上述第I步驟、第2步驟及第3步驟的雌馬酚的制備方法(以下也將該制備方法記為“第3制備方法”)。使用本發(fā)明的第3制備方法可以由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元，由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元，由四氫黃豆苷元制備雌馬酚。第I步驟在本發(fā)明的第3制備方法所包含的第I步驟中，在NADPH及/或NADH的存在下使由El多肽組成的酶作用于黃豆苷元，由此將黃豆苷元轉(zhuǎn)換為二氫黃豆苷元。本發(fā)明的第3 制備方法中的第I步驟與上述第I步驟相同。需要說明的是，第I步驟及第2步驟在相同條件下進(jìn)行時，第I步驟及第3步驟在相同條件下進(jìn)行時，或第I步驟 第3步驟在相同條件下進(jìn)行時，從有效進(jìn)行上述各步驟這一觀點(diǎn)考慮，使用的反應(yīng)可以在上述“第I步驟”項中所述的第I步驟和第2步驟在相同條件下進(jìn)行時的條件·各濃度下通過溫育進(jìn)行。第2步驟在本發(fā)明的第3制備方法所包含的第2步驟中，在NADPH及/或NADH的存在下使由E2多肽組成的酶作用于二氫黃豆苷元，由此將二氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為四氫黃豆苷元。第2 步驟與上述第2步驟相同。需要說明的是，第I步驟及第2步驟在相同條件下進(jìn)行時，或第I步驟 第3步驟在相同條件下進(jìn)行時，從有效進(jìn)行上述各步驟這一觀點(diǎn)考慮，所使用的反應(yīng)可以如下實施 在上述“第2步驟”項中所述的、第I步驟和第2步驟在相同條件下進(jìn)行時的條件·各濃度下進(jìn)行溫育。另外，在由El多肽組成的酶及由E2多肽組成的酶共存的條件下進(jìn)行第I步驟和第2步驟時，或在由El多肽組成的酶、由E2多肽組成的酶及由E3多肽組成的酶共存的條件下進(jìn)行第I步驟 第3步驟時，反應(yīng)可以如下實施在上述“第2步驟”項等所述的由El 多肽組成的酶及由E2多肽組成的酶共存條件下進(jìn)行的條件·各濃度下進(jìn)行溫育。另外，第2步驟及第3步驟在相同條件下進(jìn)行時，從有效進(jìn)行各步驟這一觀點(diǎn)考慮，所使用的反應(yīng)可以如下實施在上述“第2步驟”所述的第2步驟和第3步驟等在相同條件下進(jìn)行時的條件·濃度下進(jìn)行溫育。第3步驟在本發(fā)明的第3制備方法所包含的第3步驟中，將由E3多肽組成的酶作用于四氫黃豆苷元，由此將四氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為雌馬酚。第3步驟與上述第3步驟相同。需要說明的是，第I步驟及第3步驟在相同條件下進(jìn)行時，或第I步驟 第3步驟在相同條件下進(jìn)行時，從有效進(jìn)行上述各步驟這一觀點(diǎn)考慮，使用的反應(yīng)可以如下實施 在上述“第I步驟”項中所述的、第I步驟和第2步驟在相同條件下進(jìn)行時的條件下進(jìn)行溫育。上述情況下，由E3多肽組成的酶、四氫黃豆苷元及NADPH及/或NADH的濃度可以如下設(shè)定
由E3多肽組成的酶的含量為O. 0001 I. O重量％，優(yōu)選O. 001 O. I重量％，更優(yōu)選O. 001 O. 01重量％ ；四氫黃豆苷元的含量為O. 0001 10. O重量％,優(yōu)選O. 001 I. O重量更優(yōu)選 O. 001 O. I重量％ ;及NADPH及/或NADH的含量為O. 01 5重量％，優(yōu)選O. 05 I重量％，更優(yōu)選O. I
O. 5重量％。但是，在由El多肽組成的酶及由E3多肽組成的酶共存的條件下進(jìn)行第I步驟及第3步驟時，或在由El多肽組成的酶、由E2多肽組成的酶及由E3多肽組成的酶共存的條件下進(jìn)行第I步驟 第3步驟時，如上所述，從有效進(jìn)行使用由El多肽組成的酶生成二氫黃豆苷元的反應(yīng)這一觀點(diǎn)考慮，需要加入NADPH。上述情況下，基于上述“第I步驟”項中所述的、第I步驟和第2步驟在相同條件下進(jìn)行時的條件，確定NADPH的濃度。并且，基于上述“第2步驟”項中所述的在由El多肽組成的酶及由E2多肽組成的酶共存的條件下進(jìn)行時的條件、及上述“第2步驟”項中所述的第2步驟及第3步驟等在相同條件下進(jìn)行時的條件，確定與NADPH同時使用的NADH的濃度。El E3 多肽本發(fā)明的第3制備方法使用上述由El多肽組成的酶、由E2多肽組成的酶及由E3 多肽組成酶。El E3多肽與上述相同。D-I-6.通過第3制備方法制備的含有雌馬酚的產(chǎn)物本發(fā)明提供一種含有雌馬酚的產(chǎn)物，由包括第I步驟 第3步驟的雌馬酚的制備方法(第3制備方法)制備得到。如上所述，使用本發(fā)明的第3制備方法，可以由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元，由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元，由四氫黃豆苷元制備雌馬酚。因此，通過本發(fā)明的第3制備方法制備的含有雌馬酚的產(chǎn)物中，不僅含有雌馬酚， 還可能含有四氫黃豆苷元、二氫黃豆苷元和/或黃豆苷元。另外，本發(fā)明的產(chǎn)物可以以由第3制備方法得到的溶液的形式使用，也可以以通過從該溶液中粗純化或純化得到的雌馬酚等產(chǎn)物的形式使用。
本發(fā)明的產(chǎn)物可以在食品、飲料、化妝用品、藥品等中配合使用，也可以作為底物使用。D-I-7.包括第4步驟 第6步驟中至少兩個步驟的二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚的制備方法本發(fā)明提供一種包括以下第4步驟、第5步驟及第6步驟中至少兩個步驟的二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚的制備方法(以下也將該制備方法記為“第4制備方法”)。其中，所述第4步驟由黃豆苷元生成二氫黃豆苷元，所述第5步驟由二氫黃豆苷元生成四氫黃豆苷元，所述第6步驟由四氫黃豆苷元生成雌馬酚。(第4步驟)通過使含有(Ad) (Af)中任一種多核苷酸(以下也將該多核苷酸記為“E1多核苷酸”)的重組細(xì)胞作用于黃豆苷元，生成二氫黃豆苷元的步驟，(Ad)多核苷酸，由序列號4所示的核苷酸序列組成；(Ae)多核苷酸，編碼由序列號I所示的氨基酸序列組成的多肽； (Af)多核苷酸，與上述(Ad)或(Ae)的多核苷酸的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有以黃豆苷元為底物生成二氫黃豆苷元活性的多肽。(第5步驟)通過使含有(Bd) (Bf)中任一種多核苷酸(以下也將該多核苷酸記為“E2多核苷酸”)的重組細(xì)胞作用于二氫黃豆苷元，生成四氫黃豆苷元的步驟，(Bd)多核苷酸，由序列號10所示的核苷酸序列組成；(Be)多核苷酸，編碼由序列號7所示的氨基酸序列組成的多肽；(Bf)多核苷酸，與上述(Bd)或(Be)的多核苷酸的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有以二氫黃豆苷元為底物生成四氫黃豆苷元活性的多肽。(第6步驟)通過使含有(Cd) (Ce)中任一種多核苷酸(以下也將該多核苷酸記為“E3多核苷酸”)的重組細(xì)胞作用于四氫黃豆苷元，生成雌馬酚的步驟，(Cd)多核苷酸，由序列號16所示的核苷酸序列組成；(Ce)多核苷酸，編碼由序列號13所示的氨基酸序列組成的多肽；(Cf)多核苷酸，與上述(Cd)或(Ce)的多核苷酸的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有以四氫黃豆苷元為底物生成雌馬酚的多肽。使用本發(fā)明的第4制備方法，根據(jù)第4 6步驟的各種組合，可以制備二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酹。本發(fā)明的第4制備方法如上所述包括第4步驟、第5步驟及第6步驟中的至少兩個步驟。例如，本發(fā)明的第4制備方法包括第4步驟及第5步驟的兩個步驟而不包括第6 步驟時，使用本發(fā)明的第4制備方法可以由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元，由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元。另外，例如本發(fā)明的第4制備方法包括第5步驟及第6步驟的兩個步驟而不包含第4步驟時，使用本發(fā)明的第4制備方法可以由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元，由四氫黃豆苷元制備雌馬酚。本發(fā)明的第4制備方法包括第4 6步驟的三個步驟時，使用本發(fā)明的第4制備方法，可以由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元，由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元，由四氫黃豆苷元制備雌馬酚。
本發(fā)明的第4制備方法中使用的重組細(xì)胞，每個細(xì)胞內(nèi)可以含有選自(Ad) (Af)、(Bd) (Bf)及(Cd) (Cf)中的I種多核苷酸，也可以含有選自該組中的2種以上的多核苷酸。例如，一個細(xì)胞含有選自(Ad) (Af)中的I種多核苷酸和選自(Bd) (Bf)中的I種多核苷酸共2種多核苷酸時，可以使用上述重組細(xì)胞進(jìn)行第4步驟及第5步驟，也就是說可以使用一種重組細(xì)胞進(jìn)行第4步驟及第5步驟。另外，例如一個細(xì)胞含有選自(Ad) (Af)中的I種多核苷酸和選自(Bd) (Bf) 中的I種多核苷酸和選自(Cd) (Cf)中的I種多核苷酸共3種多核苷酸時,可以使用上述重組細(xì)胞進(jìn)行第4步驟 第6步驟，也就是說可以使用一種重組細(xì)胞進(jìn)行第4步驟 第 6步驟。另外，本發(fā)明的第4制備方法中，例如可以通過使用如上所述的含有選自(Ad) (Af)中的I種多核苷酸和選自(Bd) (Bf)中的I種多核苷酸共2種多核苷酸的重組細(xì)胞和含有選自(Cd) (Cf)中的I種多核苷酸的重組細(xì)胞，進(jìn)行第4步驟 第6步驟。同樣，例如本發(fā)明的第4制備方法中，也可以通過使用含有選自(Ad) (Af)中的 I種多核苷酸和選自(Cd) (Cf)中的I種多核苷酸共2種多核苷酸的重組細(xì)胞和含有選自(Bd) (Bf)中的I種多核苷酸的重組細(xì)胞，進(jìn)行第4步驟 第6步驟。第4步驟第4步驟中，通過使含有上述A-2.部分所述的El多核苷酸的重組細(xì)胞作用于黃豆苷元，將黃豆苷元轉(zhuǎn)換為二氫黃豆苷元。第4步驟中使用的反應(yīng)可以在與上述第I步驟相同的條件下進(jìn)行。具體而言，該制備方法如下進(jìn)行將上述重組細(xì)胞接種在含有O. 001 I重量％、優(yōu)選O. 01 I重量％、 更優(yōu)選O. 01 O. 5重量％的黃豆苷元的培養(yǎng)基中，在可以生長的溫度條件下溫育6 30 小時，優(yōu)選7 24小時，更優(yōu)選7 18小時。此處，對于可以生長的溫度條件沒有特殊限定，可以在與上述“第I步驟”項中的溫度相同的溫度下進(jìn)行。第4步驟中使用的重組細(xì)胞對于第4步驟中使用的重組細(xì)胞沒有限制，只要含有El多核苷酸并能表達(dá)El多核苷酸即可。具體而言，可以使用上述A-4.部分所述的重組細(xì)胞。使用含有El多核苷酸的重組細(xì)胞制備由El多肽組成的酶將導(dǎo)入了 El多核苷酸的重組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從細(xì)胞及/或培養(yǎng)物中回收El多肽， 由此制備由El多肽組成的酶。具體而言，可以通過按照上述A-5.部分所述的條件培養(yǎng)該重組細(xì)胞來制備El多肽。第5步驟第5步驟中，通過使含有上述B-2.部分所述的E2多核苷酸的重組細(xì)胞作用于二氫黃豆苷元，將二氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為四氫黃豆苷元。第5步驟中使用的反應(yīng)可以在與上述第2步驟相同的條件下進(jìn)行。具體而言，該制備方法如下 進(jìn)行將上述重組細(xì)胞接種在含有O. 001 I重量％、優(yōu)選O. 01 O. 5重量％、 更優(yōu)選O. 01 O. I重量％的二氫黃豆苷元的培養(yǎng)基中，在可以生長的溫度條件下溫育7 30小時，優(yōu)選15 24小時，更優(yōu)選17 20小時。此處，對于可以生長的溫度條件沒有特殊限定，可以在與上述“第2步驟”項中的溫度相同的溫度下進(jìn)行。
第5步驟中使用的重組細(xì)胞對于第5步驟中使用的重組細(xì)胞沒有限制，只要含有上述B-2.部分所述的E2多核苷酸并能表達(dá)E2多核苷酸即可。具體而言，可以使用上述B-4.部分所述的重組細(xì)胞。使用含有E2多核苷酸的重組細(xì)胞制備由E2多肽組成的酶將導(dǎo)入了 E2多核苷酸的重組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從細(xì)胞及/或培養(yǎng)物中回收E2多肽，由此制備由E2多肽組成的酶。另外，導(dǎo)入了 E2多核苷酸的重組細(xì)胞的培養(yǎng)、用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基、及E2多肽的分離·純化可以按照與上述“使用含有El多核苷酸的重組細(xì)胞制備由El多肽組成的酶”中相同的方式和條件進(jìn)行。第6步驟第6步驟中，通過使含有上述C-2.部分所述的E3多核苷酸的重組細(xì)胞作用于四氫黃豆苷元，將四氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為雌馬酚。

第6步驟中使用的反應(yīng)可以在與上述第3步驟相同的條件下進(jìn)行。例如，可如下進(jìn)行將上述重組細(xì)胞接種在含有O. 001 I重量％、優(yōu)選O. OI O. 5重量％、更優(yōu)選O. OI O. I重量％的四氫黃豆苷元的培養(yǎng)基中，在可以生長的溫度條件下溫育7 30小時，優(yōu)選 15 24小時，更優(yōu)選17 20小時。此處，對于可以生長的溫度條件沒有特殊限定，可以在與上述“第3步驟”項中的溫度相同的溫度下進(jìn)行。對于第6步驟中作為底物使用的四氫黃豆苷元的來源沒有限制。例如，可以將第5步驟中由二氫黃豆苷元生成的四氫黃豆苷元作為第6步驟中的底物使用。上述情況下，該四氫黃豆苷元可以以第5步驟生成的含有四氫黃豆苷元的溶液的形式使用，也可以以粗純化或純化的形式使用。另外，例如可以使用市售的四氫黃豆苷元，也可以使用通過適宜的方法合成的四
氫黃豆苷兀。另外，例如可以使用具有含有E3多核苷酸的重組細(xì)胞及四氫黃豆苷元的雌馬酚合成原料組合物作為第6步驟中用于合成雌馬酚的混合原料。通過在上述條件下培養(yǎng)上述合成原料組合物，可以使該合成原料組合物中的四氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為雌馬酚。上述合成原料組合物中上述重組細(xì)胞及四氫黃豆苷元的濃度，及可在上述合成原料組合物中配合的其他組分等或反應(yīng)條件與上述相同。優(yōu)選將第5步驟中由二氫黃豆苷元生成的四氫黃豆苷元作為第6步驟中的底物使用，也可以將市售的四氫黃豆苷元或上述合成原料組合物等與第5步驟中生成的四氫黃豆苷元混合使用。第6步驟中使用的重組細(xì)胞對于第6步驟中使用的重組細(xì)胞沒有限制，只要含有上述C-2.部分所述的E3多核苷酸并能表達(dá)E3多核苷酸即可。具體而言，可以使用上述C-4.部分所述的重組細(xì)胞。使用含有E3多核苷酸的重組細(xì)胞制備由E3多肽組成的酶將導(dǎo)入了 E3多核苷酸的重組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從細(xì)胞及/或培養(yǎng)物中回收E3多肽， 由此制備由E3多肽組成的酶。另外，導(dǎo)入了 E3多核苷酸的重組細(xì)胞的培養(yǎng)、用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基、及E3多肽的分離·純化可以按照與上述“使用含有El多核苷酸的重組細(xì)胞制備由El多肽組成的酶”中相同的方式和條件進(jìn)行。
El E3多核昔酸本發(fā)明的第4制備方法中，使用El E3多核苷酸中的至少I種多核苷酸。上述多核苷酸已分別在上述A-2.、B-2.及C-2.部分進(jìn)行了說明。D-I-8.通過第4制備方法制備的含有二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚的產(chǎn)物本發(fā)明提供一種通過第4制備方法制備的含有二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/ 或雌馬酚的產(chǎn)物。如上所述，使用本發(fā)明的第4制備方法，根據(jù)第4 6步驟的各種組合，可以制備
二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚。因此，由本發(fā)明的第4制備方法制備的產(chǎn)物中含有二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚。另外，本發(fā)明的產(chǎn)物可以以通過第4制備方法得到的溶液形式使用，也可以為從該溶液中粗純化或純化的二氫黃豆苷元產(chǎn)物、四氫黃豆苷元產(chǎn)物及/或雌馬酚產(chǎn)物的形式使用。 本發(fā)明的產(chǎn)物可以在食品、飲料、化妝用品、藥品等中配合使用，也可以作為底物使用。D-II-1.具有第I反應(yīng)槽 第3反應(yīng)槽中至少一種反應(yīng)槽的二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚的制備裝置本發(fā)明提供一種具有以下第I反應(yīng)槽 第3反應(yīng)槽中至少一種反應(yīng)槽的二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚的制備裝置(以下也記為“第I制備裝置”)。(第I反應(yīng)槽)該反應(yīng)槽內(nèi)具有反應(yīng)裝置,所述反應(yīng)裝置中固定有由(Aa) (Ac) 中任一種多肽(即El多肽)組成的酶(以下也將該工具記為“反應(yīng)裝置1”)，該反應(yīng)槽用于使用上述多肽由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元，其中，上述反應(yīng)裝置被配置在能夠與反應(yīng)槽內(nèi)的黃豆苷元接觸的位置；(第2反應(yīng)槽)該反應(yīng)槽內(nèi)具有反應(yīng)裝置,所述反應(yīng)裝置中固定有由(Ba) (Be) 中任一種多肽(即E2多肽)組成的酶(以下也將該工具記為“反應(yīng)裝置2”)，該反應(yīng)槽用于使用上述多肽由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元，其中，上述反應(yīng)裝置被配置在能夠與反應(yīng)槽內(nèi)的二氫黃豆苷元接觸的位置；(第3反應(yīng)槽)該反應(yīng)槽內(nèi)具有反應(yīng)裝置，所述反應(yīng)裝置中固定有由(Ca) (Ce) 中任一種多肽(即E3多肽)組成的酶(以下也將該工具記為“反應(yīng)裝置3”)，該反應(yīng)槽用于使用上述多肽由四氫黃豆苷元制備雌馬酚，其中，上述反應(yīng)裝置被配置在能夠與反應(yīng)槽內(nèi)的四氫黃豆苷元接觸的位置；使用本發(fā)明的第I制備裝置，根據(jù)第I反應(yīng)槽 第3反應(yīng)槽的各種組合，可以制備二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚。本發(fā)明的第I制備裝置具有第I反應(yīng)槽、第2反應(yīng)槽及第3反應(yīng)槽中的至少一個反應(yīng)槽。例如，本發(fā)明的第I制備裝置含有第I反應(yīng)槽而不具有第2反應(yīng)槽及第3反應(yīng)槽時，通過使用本發(fā)明的第I制備裝置可以由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元。例如，本發(fā)明的第I制備裝置具有第2反應(yīng)槽而不具有第I反應(yīng)槽及第3反應(yīng)槽時，通過使用本發(fā)明的第I制備裝置可以由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元。例如，本發(fā)明的第I制備裝置具有第3反應(yīng)槽而不具有第I反應(yīng)槽及第2反應(yīng)槽時，通過使用本發(fā)明的第I制備裝置可以由四氫黃豆苷元制備雌馬酚。另外,例如本發(fā)明的第I制備裝置具有第I反應(yīng)槽及第2反應(yīng)槽兩個反應(yīng)槽而不具有第3反應(yīng)槽時，通過使用本發(fā)明的第I制備裝置可以由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元，由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元。另外,例如本發(fā)明的第I制備裝置具有第2反應(yīng)槽及第3反應(yīng)槽兩個反應(yīng)槽而不具有第I反應(yīng)槽時，通過使用本發(fā)明的第I制備裝置可以由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元，由四氫黃豆苷元制備雌馬酚。另外，例如本發(fā)明的第I制備裝置具有第I反應(yīng)槽 第3反應(yīng)槽三個反應(yīng)槽時，通過使用本發(fā)明的第I制備裝置，可以由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元，由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元，由四氫黃豆苷元制備雌馬酚。另外，本發(fā)明的第I制備裝置中，反應(yīng)裝置I 3中的至少兩個裝置可以共同存在于一個反應(yīng)槽內(nèi)。例如，反應(yīng)裝置I及2共同存在于一個反應(yīng)槽內(nèi)時，分別在第I反應(yīng)槽及第2反應(yīng)槽進(jìn)行的各反應(yīng)可以 在一個反應(yīng)槽內(nèi)進(jìn)行。另外，例如反應(yīng)裝置I 3共同存在于一個反應(yīng)槽內(nèi)時，分別在第I反應(yīng)槽 第3反應(yīng)槽發(fā)生的各反應(yīng)可以在一個反應(yīng)槽內(nèi)進(jìn)行。對于上述反應(yīng)裝置在反應(yīng)槽內(nèi)的配置方式?jīng)]有限定，只要在反應(yīng)槽內(nèi)能發(fā)揮所期望的效果即可。另外，本發(fā)明的第I制備裝置中，上述制備裝置具有反應(yīng)裝置I 3中的至少兩個裝置并具有不同的多個反應(yīng)槽時，上述反應(yīng)槽通過供給裝置連接。例如，本發(fā)明的第I制備裝置具有第I反應(yīng)槽及第2反應(yīng)槽而不具有第3反應(yīng)槽， 且第I反應(yīng)槽及第2反應(yīng)槽彼此獨(dú)立，第I反應(yīng)槽內(nèi)配置反應(yīng)裝置1，第2反應(yīng)槽內(nèi)配置反應(yīng)裝置2時，為了將第I反應(yīng)槽中生成的含有二氫黃豆苷元的產(chǎn)物供給至第2反應(yīng)槽內(nèi)，將上述第I反應(yīng)槽及第2反應(yīng)槽通過供給裝置相連接。另外，例如本發(fā)明的第I制備裝置具有存在于一個反應(yīng)槽的反應(yīng)裝置I及2，及存在于另一個反應(yīng)槽內(nèi)的反應(yīng)裝置3時，為了將在配置有反應(yīng)裝置I及2的反應(yīng)槽內(nèi)生成的產(chǎn)物供給至配置有反應(yīng)裝置3的反應(yīng)槽內(nèi)，將配置有反應(yīng)裝置I及2的反應(yīng)槽和配置有反應(yīng)裝置3的反應(yīng)槽通過供給裝置相連接。此處，產(chǎn)物可以為所得的溶液的形式存在，也可以為通過粗純化或純化溶液得到的二氫黃豆苷元等產(chǎn)物形式存在。反應(yīng)槽對于本發(fā)明的第I制備裝置中使用的第I反應(yīng)槽 第3反應(yīng)槽的形狀、大小、材料等沒有限定，只要每個反應(yīng)槽含有一個上述反應(yīng)裝置，并且適于制備二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚即可。反應(yīng)裝置對于本發(fā)明的第I制備裝置中使用的反應(yīng)裝置I 3沒有限定，只要每個反應(yīng)裝置都含有被固定的由上述多肽組成的酶，并且適于應(yīng)用制備二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚即可。
被固定于各反應(yīng)裝置中的由各多肽組成的酶可以為粗純化狀態(tài)或純化狀態(tài)。由多肽組成的酶可以通過現(xiàn)有技術(shù)固定在反應(yīng)裝置上。例如，由多肽組成的酶被固定于載體上時，對于該載體沒有限定，只要不妨礙由各多肽組成的酶具有的所期望活性的表達(dá)即可。例如，上述載體可以為具有下述官能團(tuán)的載體，所述官能團(tuán)能與由上述多肽組成的酶通過共價鍵連接，例如氨基、羧基、羥基等，另外， 可以為能通過連接體與由上述多肽組成的酶相連接的載體等。對于載體的形狀也沒有限定。上述載體、官能團(tuán)、連接體等可以根據(jù)將由多肽組成的酶固定于載體的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行適當(dāng)選擇。另外，由多肽組成的酶可以通過現(xiàn)有技術(shù)固定在載體上。供給裝置對于本發(fā)明的第I制備裝置中使用的供給裝置沒有限定，只要通過該供給裝置能使本發(fā)明的第I制備裝置中使用的不同反應(yīng)槽相連接，并能在本發(fā)明的第I制備裝置中制備二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚即可。上述供給裝置可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行適宜選擇。El E3 多狀本發(fā)明的第I制備裝置中使用的El E3多肽與上述El E3多肽相同。 在第I反應(yīng)槽中二氫黃豆苷元的制備在第I反應(yīng)槽中，通過使固定于反應(yīng)裝置I上的由El多肽組成的酶在NADPH及/ 或NADH的存在下作用于黃豆苷元，使黃豆苷元轉(zhuǎn)換為二氫黃豆苷元。由El多肽組成的酶可以與NADPH及/或NADH —同被固定于反應(yīng)裝置上，所述NADPH及/或NADH作為由El多肽組成的酶的輔酶而發(fā)揮作用。第I反應(yīng)槽中的反應(yīng)可以按照上述“第I步驟”所述的方法進(jìn)行。在第2反應(yīng)槽中四氫黃豆苷元的制備在第2反應(yīng)槽中，通過使固定于反應(yīng)裝置2上的由E2多肽組成的酶在NADPH及/ 或NADH的存在下作用于二氫黃豆苷元，使二氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為四氫黃豆苷元。由E2多肽組成的酶可以與NADPH及/或NADH —同被固定于反應(yīng)裝置上，所述NADPH及/或NADH作為由E2多肽組成的酶的輔酶而發(fā)揮作用。第2反應(yīng)槽中的反應(yīng)可以按照上述“第2步驟” 所述的方法進(jìn)行。在第3反應(yīng)槽中雌馬酚的制備在第3反應(yīng)槽中，可以通過使固定于反應(yīng)裝置3上的由E3多肽組成的酶作用于四氫黃豆苷元，使四氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為雌馬酚。第3反應(yīng)槽中的反應(yīng)可以按照上述“第3步驟”所述的方法進(jìn)行。D-II-2.具有第4反應(yīng)槽 第6反應(yīng)槽中的至少一種反應(yīng)槽的二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚的制備裝置本發(fā)明提供一種具有以下第4反應(yīng)槽 第6反應(yīng)槽中的至少一種反應(yīng)槽的二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚的制備裝置(以下也記為“第2制備裝置”)。(第4反應(yīng)槽)該反應(yīng)槽內(nèi)具有反應(yīng)裝置,所述反應(yīng)裝置中固定有含有(Ad) (Af)中任一種多核苷酸(即El多核苷酸)的重組細(xì)胞的反應(yīng)裝置(“以下也將其記為反應(yīng)裝置4”)，該反應(yīng)槽用于使用上述反應(yīng)裝置由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元，其中，上述反應(yīng)裝置被配置在能夠與反應(yīng)槽內(nèi)的黃豆苷元接觸的位置；
(第5反應(yīng)槽)該反應(yīng)槽內(nèi)具有反應(yīng)裝置，所述反應(yīng)裝置中固定有含有(Bd) (Bf)中任一種多核苷酸(即E2多核苷酸)的重組細(xì)胞的反應(yīng)裝置(“以下也將其記為反應(yīng)裝置5”)，該反應(yīng)槽用于使用上述反應(yīng)裝置由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元，其中，上述反應(yīng)裝置被配置在能夠與反應(yīng)槽內(nèi)的二氫黃豆苷元接觸的位置；(第6反應(yīng)槽)該反應(yīng)槽內(nèi)具有反應(yīng)裝置，所述反應(yīng)裝置中固定有含有(Cd) (Cf)中任一種多核苷酸(即E3多核苷酸)的重組細(xì)胞(“以下也將其記為反應(yīng)裝置6”)， 該反應(yīng)槽用于使用上述反應(yīng)裝置由四氫黃豆苷元制備雌馬酚，其中，上述反應(yīng)裝置被配置在能夠與反應(yīng)槽內(nèi)的四氫黃豆苷元接觸的位置；使用本發(fā)明的第2制備裝置，根據(jù)第4反應(yīng)槽 第6反應(yīng)槽的各種組合，可以制備二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚。本發(fā)明的第2制備裝置具有第4反應(yīng)槽、第5反應(yīng)槽及第6反應(yīng)槽中的至少一個反應(yīng)槽。例如,本發(fā)明的第2制備裝置具有第4反應(yīng)槽而不具有第5反應(yīng)槽及第6反應(yīng)槽時，通過使用本發(fā)明的第2制備裝置可以由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元。例如,本發(fā)明的第2制備裝置具有第5反應(yīng)槽而不具有第4反應(yīng)槽及第6反應(yīng)槽時，通過使用本發(fā)明的第2制備裝置可以由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元。 例如,本發(fā)明的第2制備裝置具有第6反應(yīng)槽而不具有第4反應(yīng)槽及第5反應(yīng)槽時，通過使用本發(fā)明的第2制備裝置可以由四氫黃豆苷元制備雌馬酚。另外,例如本發(fā)明的第2制備裝置具有第4反應(yīng)槽及第5反應(yīng)槽兩個反應(yīng)槽而不具有第6反應(yīng)槽時，通過使用本發(fā)明的第2制備裝置可以由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元，由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元。另外,例如本發(fā)明的第2制備裝置具有第5反應(yīng)槽及第6反應(yīng)槽兩個反應(yīng)槽而不具有第4反應(yīng)槽時，通過使用本發(fā)明的第2制備裝置可以由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元，由四氫黃豆苷元制備雌馬酚。另外，例如本發(fā)明的第2制備裝置具有第4反應(yīng)槽 第6反應(yīng)槽三個反應(yīng)槽時，通過使用本發(fā)明的第2制備裝置可以由黃豆苷元制備二氫黃豆苷元，由二氫黃豆苷元制備四氫黃豆苷元，由四氫黃豆苷元制備雌馬酚。另外，本發(fā)明的第2制備裝置中，反應(yīng)裝置4 6中的至少兩個可以共同存在于一個反應(yīng)槽。例如，反應(yīng)裝置4及5共同存在于一個反應(yīng)槽內(nèi)時，在第4反應(yīng)槽及第5反應(yīng)槽中進(jìn)行的各反應(yīng)可以在一個反應(yīng)槽內(nèi)進(jìn)行。另外，例如反應(yīng)裝置4 6共同存在于一個反應(yīng)槽時，在上述第4反應(yīng)槽 第6反應(yīng)槽中進(jìn)行的各反應(yīng)可以在一個反應(yīng)槽內(nèi)進(jìn)行。對于上述反應(yīng)裝置在反應(yīng)槽內(nèi)的配置方式?jīng)]有限定，只要在反應(yīng)槽內(nèi)能發(fā)揮所期望的效果即可。另外，本發(fā)明的第2制備裝置中，上述制備裝置具有反應(yīng)裝置4 6中的至少兩個裝置并具有不同的多個反應(yīng)槽時，上述不同的反應(yīng)槽通過供給裝置連接。例如,本發(fā)明的第2制備裝置具有第4反應(yīng)槽及第5反應(yīng)槽而不具有第6反應(yīng)槽， 且第4反應(yīng)槽及第5反應(yīng)槽彼此獨(dú)立,第4反應(yīng)槽內(nèi)配置反應(yīng)裝置4,第5反應(yīng)槽內(nèi)配置反應(yīng)裝置5時，為了將第4反應(yīng)槽中生成的含有二氫黃豆苷元的產(chǎn)物供給至第5反應(yīng)槽內(nèi)，將上述第4反應(yīng)槽及第5反應(yīng)槽通過供給裝置相連接。另外,例如本發(fā)明的第2制備裝置具有存在于一個反應(yīng)槽的反應(yīng)裝置4及5，及存在于另一個反應(yīng)槽內(nèi)的反應(yīng)裝置6時,為了將在配置有反應(yīng)裝置4及5的反應(yīng)槽內(nèi)生成的產(chǎn)物供給至配置有反應(yīng)裝置6的反應(yīng)槽內(nèi)，將配置有反應(yīng)裝置4及5的反應(yīng)槽和配置有反應(yīng)裝置6的反應(yīng)槽通過供給裝置相連接。此處，產(chǎn)物可以為所得的溶液的形式存在，也可以為通過粗純化或純化溶液得到二氫黃豆苷元等產(chǎn)物形式存在。反應(yīng)槽對于本發(fā)明的第2制備裝置中使用的第4反應(yīng)槽 第6反應(yīng)槽的形狀、大小、材料等沒有限定，只要每個反應(yīng)槽具有一個上述反應(yīng)裝置，并且適于制備二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚即可。反應(yīng)裝置對于本發(fā)明的第2制備裝置中使用的反應(yīng)裝置4 6沒有限定，只要每個反應(yīng)裝置都具有被固定的重組細(xì)胞，并且適于制備二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚即可。 對于重組細(xì)胞在反應(yīng)裝置上的固定沒有限制，只要不妨礙各重組細(xì)胞具有的所期望活性的表達(dá)即可，可以按照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行實施。另外，重組細(xì)胞在反應(yīng)裝置上處于能培養(yǎng)或者被培養(yǎng)的狀態(tài)。此處適用的重組細(xì)胞的培養(yǎng)條件，可以根據(jù)上述“第4步驟”、“第5步驟”及“第6步驟”等的記載分別進(jìn)行設(shè)定。供給裝置對于本發(fā)明的第2制備裝置中使用的供給裝置沒有限定，只要通過該供給裝置能使本發(fā)明的第2制備裝置中使用的不同反應(yīng)槽相連接，并能在本發(fā)明的第2制備裝置中制備二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚即可。上述供給裝置可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行適宜選擇。重組細(xì)胞本發(fā)明的第2制備裝置中使用的重組細(xì)胞與上述“第4步驟中使用的重組細(xì)胞”、 “第5步驟中使用的重組細(xì)胞”及“第6步驟中使用的重組細(xì)胞”等所述的重組細(xì)胞相同。El E3多核苷酸本發(fā)明的第2制備裝置中使用的El E3多核苷酸與上述的El E3多核苷酸相同。在第4反應(yīng)槽中二氫黃豆苷元的制備在第4反應(yīng)槽中，使用固定于反應(yīng)裝置4上的含有El多核苷酸的重組細(xì)胞，將黃豆苷元轉(zhuǎn)換為二氫黃豆苷元。第4反應(yīng)槽中的反應(yīng)可以按照上述“第4步驟”等所述的方法進(jìn)行。在第5反應(yīng)槽中四氫黃豆苷元的制備在第5反應(yīng)槽中，使用固定于反應(yīng)裝置5上的含有E2多核苷酸的重組細(xì)胞，將二氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為四氫黃豆苷元。第5反應(yīng)槽中的反應(yīng)可以按照上述“第5步驟”等所述的方法進(jìn)行。在第6反應(yīng)槽中雌馬酚的制備
在第6反應(yīng)槽中，使用固定于反應(yīng)裝置6上的含有E3多核苷酸的重組細(xì)胞，將四氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換為雌馬酚。第6反應(yīng)槽中的反應(yīng)可以按照上述“第6步驟”等所述的方法進(jìn)行。D-II-3.具有第I反應(yīng)槽 第3反應(yīng)槽中的至少一個反應(yīng)槽及第4反應(yīng)槽 第6 反應(yīng)槽中的至少一個反應(yīng)槽的二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚的制備裝置本發(fā)明提供一種具有上述第I反應(yīng)槽 第3反應(yīng)槽中的至少一個反應(yīng)槽及第4反應(yīng)槽 第6反應(yīng)槽中的至少一個反應(yīng)槽的二氫黃豆苷兀、四氫黃豆苷兀及/或雌馬酹的制備裝置(以下也記為“第3制備裝置”)。第3制備裝置中的各反應(yīng)槽、各反應(yīng)裝置的組合與上述第I及第2制備裝置相同。 另外，第3制備裝置中使用的反應(yīng)槽、反應(yīng)裝置、多核苷酸、重組細(xì)胞及各反應(yīng)槽中的反應(yīng)也與上述第I及第2制備裝置相同。實施例實施例A 參考例Al將乳球菌20-92株(FERM BP-10036號)接種于含有黃豆苷元的擴(kuò)增用液體培養(yǎng)基中(含有 ο μ g/mL黃豆苷兀的改良GAM肉湯培養(yǎng)基(日水制藥株式會社))，在厭氧條件下(使用BBL Gas Pack systems),在37°C下適當(dāng)培養(yǎng)7 18小時。培養(yǎng)后，通過離心分離收集細(xì)胞，并冷凍保存，在以下實施例中使用。實施例A I在細(xì)胞破碎物的離心上清液中二氫黃豆苷元生物合成活性存在的確證、及NADPH依存件的確證將保存的冷凍細(xì)胞(67mL，2瓶)解凍后，在8000rpm，4°C下離心分離10分鐘，沉淀物用于以下試驗。將沉淀物懸濁于含有ImMPMSF(和光純藥工業(yè)株式會社)、2mM DTT(和光純藥工業(yè)株式會社)及5mM連二亞硫酸鈉(和光純藥工業(yè)株式會社)的2mL O. IM磷酸鉀溶液中。將懸池液移入事先裝有O. Imm氧化錯/娃珠(BioSpecProducts, Inc.)的兩支2ml螺旋蓋試管(Assist Corporation)中，使用 FastPrep (注冊商標(biāo))FP100A (Thermo ELECTRON CORPORATION)破碎細(xì)胞(6500rpm，10秒，冰冷，8次)，得到細(xì)胞破碎液。將所得到的細(xì)胞破碎液在4°C下以約10，OOOrpm離心10分鐘得到離心上清液，用含有ImM PMSF、2mM DTT及 5mM連二亞硫酸鈉的0. IM磷酸鉀溶液將離心上清液稀釋至4. 5mL，將其作為酶源。調(diào)制下述組成的酶反應(yīng)液，在37°C下溫育2小時。溫育后，將3mL乙酸乙酯加入所得的酶反應(yīng)產(chǎn)物中進(jìn)行提取處理，干燥后，使用HPLC進(jìn)行分析。使用黃豆苷元(Funakoshi Corporation)、雌馬釀(Funakoshi Corporation)、二氫黃豆苷兀(Toronto Research Chemicals Inc.)的混合溶液(各2 μ g/mL)作為HPLC分析的標(biāo)準(zhǔn)溶液。酶反應(yīng)液組成細(xì)胞破碎液(酶源)250 μ
滅菌水、NADH(100 mM)或 NADPH(100 mM)5 μ
黃豆苷元(I mg/ml)10 μ
0.1Μ磷酸鉀緩沖液(pH7.0)/l mM DTT/5mM連二亞硫酸鈉735 μ
總計ΙΟΟΟμΙ結(jié)果如圖I所示。上述結(jié)果確證了細(xì)胞破碎物的離心上清液中存在二氫黃豆苷元生物合成活性。另外還確證了由黃豆苷元向二氫黃豆苷元的轉(zhuǎn)換反應(yīng)依存于輔酶NADPH。實施例Α2 二氫黃豆苷元合成酶的純化將乳球菌20-92株細(xì)胞在改良GAM肉湯培養(yǎng)基(日水制藥株式會社)中培養(yǎng)18小時，每培養(yǎng)瓶中67ml，將9瓶上述乳球菌20-92株細(xì)胞離心后，使其懸濁于含有2mM DTT (I, 4-二硫蘇糖醇；Merck)、5mM連二亞硫酸鈉(和光純藥工業(yè)株式會社)及蛋白酶抑制劑 (complete proteinase inhibitor cocktail EDTA-free ；Roche Diagnostics)的 0.1M憐酸鉀緩沖液(pH 7)中。將懸池液移入事先裝有0. Imm氧化錯/娃珠(BioSpec Products, Inc.)的三支2ml螺旋蓋試管(Assist Corporation)中，使用FastPrep (注冊商標(biāo))FP 100A (Thermo ELECTRON CORPORATION)破碎細(xì)胞(6500rpm，20 秒，4 次)，離心破碎液得到上清液。另外，將乳球菌20-92株細(xì)胞在相同液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時，每培養(yǎng)瓶中200ml， 將8瓶上述乳球菌20-92株細(xì)胞離心后得到8瓶上清液。使用含有ImM PMSF (苯甲基磺酰氟；Sigma Aldrich)、2mM DTT及5mM連二亞硫酸鈉的0. IM磷酸鉀緩沖液(pH 7)(以下記為“Buffer A”)進(jìn)行純化。將所得的細(xì)胞破碎上清液與含有等量2M硫酸銨的Buffer A混合,并將其加入用Butyl Sepharose 4Fast Flow(每瓶約有凝膠0. 3ml ；GE HEALTHCARE)填充的、用含有IM硫酸銨的Buffer A平衡的microbio spin columns (11 個；Bio-Red Laboratories, Inc.)中。用含有 IM硫酸銨的 Buffer A清洗后，再用0. 75ml含有0. 5M硫酸銨的Buffer A沖洗2次，先后加入0. 75ml和0. 5ml Buffer A洗脫具有二氫黃豆苷元合成活性的級分。將上述加入0.75ml Buffer A得到的洗脫液記為洗脫液I，上述加入0. 5ml Buffer A得到的洗脫液記為洗脫液II。在O. 75ml洗脫液I和O. 5ml洗脫液II中分別加入O. 3ml和O. 2ml的含有3. 4M 硫酸銨的Buffer A后，混合上述兩種洗脫液，將其用于使用TSKgel Ether_5PW柱(東曹株式會社)并使用含有IM硫酸銨的洗脫液進(jìn)行平衡的HPLC。將0. 5ml混合液注入柱中2 9次后,使用含有IM硫酸銨的洗脫液(洗脫液B)在0. lml/min的流速下進(jìn)行清洗 ，然后，使用程序改變洗脫液B和洗脫液A的混合比率為了使硫酸銨(洗脫液A)的濃度在15分鐘內(nèi)線性下降至0M。在0. 6M 0. 35M硫酸銨的洗脫級分中可見酶活性，得到約3. 5ml的總洗脫液。HPLC的條件如下所示。測定280nm處蛋白質(zhì)的吸收。柱TSKgeIEther-5Pff流速供給樣品時為0. 05 0. lml/min,洗脫時為0. lml/min洗脫液A :0. IM磷酸鉀緩沖液(pH 7) /2mM DTT/2. 5mM連二亞硫酸鈉/I % 2-丙醇洗脫液B :含有IM硫酸銨的洗脫液A使用Buffer A稀釋可見酶活性的洗脫級分的洗脫液,將其用于使用Buffer A平衡的用 2，，5，ADP Sepharose 4B (每瓶約有凝膠 O. 3ml ；GE HEALTHCARE)填充的 micro bio spin columns。使用 Buffer A清洗柱后，先后用 0. 7ml 和 0. 6ml 含有 20mM NADPH 的 pH 7. 5 的Buffer A組成液洗脫具有二氫黃豆苷元合成活性的級分。將所得洗脫液用于使用以pH 7. 5的洗脫液C平衡的Mono Q柱(GE HEALTHCARE) 的HPLC。以O(shè). lml/min的流速將洗脫液C送至柱內(nèi)，清洗后使用程序改變洗脫液C和洗脫液D的混合比率為了使NaCl的濃度在32. 5分鐘內(nèi)線性變?yōu)镺. 65M。HPLC的條件如下所示。 測定280nm處蛋白質(zhì)的吸收。柱MonoQ PC I. 6/5洗脫液C :0. IM磷酸鉀緩沖液(pH 7. 5) /3mM DTT/2. 5mM連二亞硫酸鈉/I % 2-丙
醇洗脫液D :含有IM NaCl的洗脫液C在O. 4 0. 46M NaCl級分(級分No. 28 30)中可見酶活性。所得到的MOno Q HPLC的結(jié)果和酶活性示于圖2。另外，圖3表示在還原條件下級分No. 27 31的SDS-PAGE結(jié)果。結(jié)果顯示具有二氫黃豆苷元合成活性的級分在還原條件下存在70kDa的條帶。實施例A3 N末端氨基酸序列的確定將30 μ 10. I %三氟乙酸(TFA)加入使用Mono Q HPLC得到的具有二氫黃豆苷元合成活性的70 μ I的級分No. 29中，使總體積為100 μ I。使用10 μ I甲醇潤濕ProSorb柱體(Biosystems Japan)的PVDF膜，然后加入上述混合液。使用ProSorb過濾器(Biosystems Japan)吸水后，使膜干燥,使用膜用打孔器 (Biosystems Japan)對膜進(jìn)行剪切。用20%甲醇清洗上述膜5次,使其干燥。使用蛋白質(zhì)序列分析儀(Biosystems, Procise 494cLC)對上述膜進(jìn)行N末端氨基酸序列分析,得到如下所示的含有22個殘基的連續(xù)氨基酸序列。Met Lys Asn Lys Phe Tyr Pro Lys Thr Phe Glu Arg Gly Tyr He GlyAsn Leu Glu Val Glu Asn (序列號 19)實施例A4內(nèi)部氨基酸序列的確定使用消化酶將具有二氫黃豆苷元合成活性的酶蛋白質(zhì)片段化，使其成為肽。通過分析肽的N末端氨基酸序列而獲得內(nèi)部氨基酸序列的信息。(I)樣品的制備將乳球菌20-92株細(xì)胞在改良GAM肉湯培養(yǎng)基(日水制藥株式會社)中培養(yǎng)18小時，每培養(yǎng)瓶中200ml，將3瓶上述乳球菌20-92株細(xì)胞離心后，使其懸濁于含有2mM DTT (I, 4-二硫蘇糖醇；Merck)、5mM連二亞硫酸鈉(和光純藥工業(yè)株式會社)及蛋白酶抑制劑 (complete proteinase inhibitor cocktail EDTA-free ；Roche Diagnostics)的 0.1M憐酸鉀緩沖液(pH 7)中。將懸池液移入事先裝有O. Imm氧化錯/娃珠(BioSpec Products, Inc.)的三支2ml螺旋蓋試管(AssistCorporation)中，使用FastPrep (注冊商標(biāo))FP IOOA (Thermo ELECTRON CORPORATION)破碎細(xì)胞(6500rpm，20 秒，4 次)，離心破碎液得到上清液。以后的操作中使用含有ImM PMSF (苯甲基磺酰氟；Sigma Aldrich),2mM DTT及 5mM連 二亞硫酸鈉的O. IM磷酸鉀緩沖液(pH 7)(以下記為“Buffer A”)。將所得的細(xì)胞破碎上清液與含有等量2M硫酸銨的Buffer A混合,并將其加入用Butyl Sepharose 4Fast Flow (每瓶約有凝膠0.3ml ;GE HEALTHCARE)填充的、用含有IM硫酸銨的Buffer A平衡的 micro bio spin columns (3 個；Bio-Red Laboratories, Inc.)中。用含有 IM 硫酸銨的Buffer A清洗后，再用O. 75ml含有O. 5M硫酸銨的Buffer A沖洗2次，先后兩次加入
O.75ml的Buffer A以洗脫具有二氫黃豆苷元合成活性的級分。使用Buffer A 平衡以 2’ 5’ADP Sepharose 4B 充填的一個 micro bio spin columns，加入I. 5ml之前洗脫的溶液。用O. 75ml的Buffer A清洗5次后，先后用O. 75ml 和O. 45ml含有20mM NADPH的Buffer A洗脫?；旌舷疵撘?，使用微量離心濃縮管(NAN0SEP IOK OMEGA, Pall Life Sciences)脫鹽濃縮至 5μ I。將濃縮液與含有2-巰基乙醇的2倍濃度的SDS-PAGE用樣品緩沖液混合，在90°C 下加熱處理7分鐘后，按照Laemmuli法進(jìn)行SDS-PAGE。電泳凝膠板使用SuperSep HG 10-20% (和光純藥工業(yè)株式會社)。使用Colloidal Blue(Invitrogen)染色，用Milli-Q 水脫色后，切除約70kDa處的電泳條帶。從無蛋白質(zhì)電泳的區(qū)域切除相同分子量位置及大小的凝膠片作為對照，之后以同樣的方式處理。需要說明的是，使用同樣操作處理另一組細(xì)胞，并且在SDS-PAGE后將上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染至PVDF膜上，然后使用相同位置的條帶進(jìn)行N末端氨基酸序列分析以確證與Mono Q HPLC級分No. 29序列的一致性。
(2)還原酰胺甲基化與酶消化將切除的凝膠片切成碎片，使用50%乙腈水溶液脫色后用乙腈脫水，使用離心濃縮機(jī)(SpeedVac A160、Savant)干燥。加入含有55mMDTT的IOOmM碳酸氫氨水溶液,在56°C 下還原I小時。除去DTT溶液，加入含有IOOmM碘乙酰胺的IOOmM碳酸氫氨水溶液，在避光條件下，室溫下輕微震搖30分鐘進(jìn)行酰胺甲基化處理。除去反應(yīng)試劑后，依次使用50%乙腈水溶液、乙腈、IOOmM碳酸氫氨水溶液及乙腈進(jìn)行清洗，使用離心濃縮機(jī)干燥凝膠。加入含有2 μ g無色桿菌蛋白酶I (和光純藥工業(yè)株式會社)和0. 02% Tween 20的20mM Tris鹽酸緩沖液(pH 9)，在37°C下消化7小時。將離心上清液移至其他管中，在凝膠中加入60% 乙腈-0. I % TFA水溶液并在30°C下加熱20分鐘，然后進(jìn)行3次boItex操作，每次10分鐘， 以獲得肽片段。使用Ultrafree-MC(0. 22 μ m、Amicon)過濾收集的上清液,然后離心濃縮。(3)肽作圖使用反相HPLC，分離酶消化后的肽。柱μRPC C2/C18SC2. 1/10 (GE Healthcare Bio Science)流速0.lml/min洗脫液E :0. 05% TFA洗脫液F :90% 乙腈/0.04% TFA
O分鐘5 %F 3分鐘5 %F洗脫程序43分鐘65 %F
48 分鐘 100 %F 68 分鐘 100%F級分30μ I
檢測波長215nm需要說明的是，例如上述“O分鐘5% F”表示洗脫O小時時使用含有95%洗脫液 E和5%洗脫液F的洗脫液。(4)內(nèi)部氨基酸序列分析通過與對照的色譜圖相比較，挑選出具有二氫黃豆苷元合成活性的來源于酶蛋白質(zhì)的肽峰，使用蛋白質(zhì)序列分析儀(Applied Biosystems,Procise 492HT)進(jìn)行N末端氨基酸序列分析。使用反相HPLC進(jìn)行分離開始后，從20. 6分鐘開始洗脫，洗脫峰的氨基酸序列 (以下記為P^tidel)如下所示。PheAspGluProValTyrProGlnAlaGlu (序列號 20)從22. I分鐘開始洗脫，洗脫峰的氨基酸序列(以下記為P印tide2)如下所示。AlaSerArgMetValMetAspAlaValHisGluGlyTyrIIeAlaGly (序列號 21)
從26. 6分鐘開始洗脫的洗脫峰為被非特異性切斷的肽，如下所示，上述肽為將上述酶蛋白質(zhì)N末端第13個殘基的甘氨酸作為N末端的肽(以下氨基酸序列記為Peptide3)。GlyTyrIleGlyAsnLeuGluValGluAsnArgAlalIeArgMetProMet (序列號 22)圖4表示在實施例A4中肽作圖的結(jié)果及與各峰相對應(yīng)的肽的氨基酸序列。峰I (20. 6 分鐘)峰2 (22. I 分鐘)峰3 (26. 6 分鐘)實施例A 5 二氫黃豆苷元合成酶其因從純化多肽的N末端及部分氨基酸序列的擴(kuò)遒基于上述實施例A3及A4中得到的N末端及部分氨基酸序列設(shè)計并制備兼并引物(degenerative-primer),以乳球菌20-92株的基因組DNA為模板，通過進(jìn)行兼并 PCR(degenerative-PCR)嘗試進(jìn)行編碼二氫黃豆苷元合成酶的基因的擴(kuò)增。(I)對來自于乳球菌20-92株的基因組DNA的純化將使用40mL改良GAM肉湯培養(yǎng)基(日水制藥株式會社)厭氧培養(yǎng)的乳球菌20_92 株在4°C下以5000rpm離心10分鐘，傾析除去培養(yǎng)基，收集細(xì)菌細(xì)胞。立即使收集的細(xì)胞懸濁于 QIAGEN GenomicDNA Buffer Set(Qiagen)的 IlmLBl 溶液(含有 2OO μ g/mL RNase) 中，然后加入300 μ L溶菌酶溶液(100mg/mL)和500 μ L QIAGEN蛋白酶K溶液(Qiagen)，在 37°C下培養(yǎng)16小時。然后，加入4mLB2溶液，多次倒置混合后，在50°C下培養(yǎng)3小時。然后，在4°C下以5000rpm離心10分鐘，將其上清液注入使用QBT溶液平衡的 QIAGEN Genomic-tip 500/G(Qiagen)柱中，使基因組DNA吸附于柱上。用30mL的QC溶液清洗2次柱后，使用15mLQF從柱上洗脫基因組DNA，加入10. 5mL異丙醇鹽析DNA。將析出的線狀基因組DNA加入1.5mL容量微管中，用75 %乙醇清洗，風(fēng)干后，用250 μ LTE溶液 (0. 4μ g/μ L)溶解。測定通過上述操作得到的基因組DNA溶液的濃度后，用TE溶液調(diào)制至 40ng/ μ L，作為PCR的模板使用。(2)兼并引物的設(shè)計、制備在兼并引物的設(shè)計中為了減少簡并數(shù)，5’端的序列基于格氏乳球菌的密碼子使用信息(Codon Usage Database http://www. kazusa. or. jp/codon/),米用在各氨基酸中表達(dá)頻度最高的密碼子。3’端通過使用混合堿基以避免發(fā)生與二氫黃豆苷元合成酶基因的錯配?；趯嵤├鼳3中確定的N 末端序列MKNKFYPKTFERGYIGNLEVEN，設(shè)計并制備以下兼并引物，將其用于兼并PCR。El-N-terminal-31 TGAAGAATAANTTNTAYCCNAARACNTTYGA (序列號 23)(序列號23中，在第11及14位的“N”表示肌苷，第20及26位的“N”表示腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。)El-N-terminal-37 TGAAGAATAANTTNTAYCCNAARACNTTYGARRGNGG (序列號 24)
(序列號24中，第11、14、20及26位的“N”表示肌苷，第35位的“N”表示腺嘌呤、 鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。)El-N-terminal-F32 ATGAAGAATAAGTTTTAYCCNAARACNTTYGA (序列號 25)(序列號25中，第21及27位的“N”表示腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。)另外，基于實施例A4中確定的內(nèi)部序列肽2 ASRMVMDAVHEGYIAG設(shè)計并制備以下兼并引物，將其用于兼并PCR。El-internal-RPl CCTGCAATATAACCTTCATGTACNGCRTCCATNACCAT (序列號洸)(序列號26中，第24及33位的“N”表示腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。)需要說明的是，本實施例中作為引物使用的寡核苷酸寡DNA全部由 Sigma-Aldrich Japan 制備。(3)利用兼并PCR的二氫黃豆苷元合成酶基因的擴(kuò)增使用上述兼并引物，嘗試通過兼并PCR擴(kuò)增二氫黃豆苷元合成酶基因。用于兼并PCR的兼并引物的組合如下所示。[I]El-N-terminal-31和 El-internal-RPl[2]El-N-terminal-37 和 El-internal-RPl[3]El-N-terminal-F32 和 El-internal-RPl利用兼并PCR的二氫黃豆苷元合成酶基因的擴(kuò)增使用Ex-Taq DNA聚合酶(Takara Bio Inc.)，擴(kuò)增程序為950C 2min, (95°C 45sec, 38°C -54°C 30sec, 72°C 2min) X 50 個周期，72°C 3min?？紤]到與兼并引物的基因組DNA的錯配，退火通過5個階段進(jìn)行，即從38°C開始在每個階段增加4°C直到54°C為止。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將1/10量的IOXDye加入PCR產(chǎn)物中，使用0.8% 的瓊脂糖凝膠對6 μ L產(chǎn)物進(jìn)行電泳。在本實施例中的瓊脂糖電泳中，使用溴化乙錠進(jìn)行染色，使用 λ /StyI (Nippongene Co. Ltd. )、IOObp ladder (Toyobo Co. Ltd.)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。兼并PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果示于圖5。結(jié)果確證了本實施例內(nèi)(3)中所示的[3]兼并引物的組合(El-N-terminal-F32和El-internal-RP I)在任何退火溫度下都擴(kuò)增了約
I.9kb的DNA片段。其中擴(kuò)增最多的退火溫度為54°C。⑷擴(kuò)增的DNA片段的堿基序列的確定
將擴(kuò)增的約I. 9kb的DNA片段(退火溫度為54°C )從瓊脂糖凝膠上切除，使用凝膠回收試劑盒(Gel-Extraction kit) (Qiagen)進(jìn)行純化。將純化的DNA片段插入pT7_Blue 克隆載體(Novagen)中，確定堿基序列。使用DNA 序列拼接軟件(DNA sequence assemble software) SEQUENCHER(Gene Codeslnc, USA)對所得的DNA堿基序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示DNA片段包含與實施例A4確定的肽I及3的氨基酸序列相對應(yīng)的堿基序列。實施例A6 二氫黃豆苷元合成酶基因的全堿基序列的確定為了確定實施例A5中得到的I. 9kb 二氫黃豆苷元合成酶基因的5’端及3’端的序列由此來確定全堿基序列，以乳球菌20-92株的基因組DNA文庫為模板進(jìn)行cDNA末端序列的快速擴(kuò)增(5’、3’ -RACE (cDNA末端的快速擴(kuò)增)。(I)基因組DNA文庫的制備使用限制酶(BamHI，EcoRI，HindIII，KpnI，PstI，SacI，Sail,Sau3AI, XhoI)(均為Takara Bio Inc.的產(chǎn)品)將實施例A5中純化的乳球菌20_92株的基因組DNA在37°C 下消化16小時，由此將其片段化，用苯酚 氯仿處理后，使用乙醇沉淀 進(jìn)行純化。通過使用 TaKaRa連接試劑盒var. 2. I (Takara Bio Inc.)將純化的基因組DNA片段與pUC19克隆載體連接，以制備基因組DNA文庫，其中所述pUC19克隆載體事先已被相對應(yīng)的限制酶切斷， 并被奸喊性憐酸酶(Shrimp AlkalinePhosphatase) (Takara Bio Inc.)處理進(jìn)行了脫憐酸化。(2)cDNA 末端序列的怏諫擴(kuò)增(5’ -RACE.3 -RACE)使用滅菌水將基因組DNA文庫(連接反應(yīng)液)稀釋20倍，使用其中IyL作為模板，嘗試通過使cDNA末端序列快速擴(kuò)增(5，-RACE、3’ -RACE)來擴(kuò)增二氫黃豆苷元合成酶基因的5’端及3’端的序列。(2-1)使用引物5’ -RACE,3, -RACE中分別使用的引物組合如下所示。(2-1-1) 5’ -RACEFirst-PCR =El-RACE-N-Pl 和 pUC19_FP_l、El-RACE-N-Pl 和 pUC19_RP_lNested-PCR :E1-RACE-N_P2 和 pUC19_FP_2、E1-RACE-N-P2 和 pUC19_RP_2(2-1-2)3’ -RACEFirst-PCR :E1-RACE-RP2_1 和 pUC 19-FP-l、E1-RACE-RP2-1 和 pUC19_RP_lNested-PCR :E1-RACE-RP2_2 和 pUC 19-FP-2、E1-RACE-RP2-2 和 pUC19_RP_2(2-1-3)使用引物的序列5’ -RACE,3, -RACE中分別使用的引物序列如下所示。載體側(cè)引物pUC 19-FP-l ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG (序列號 27)pUC19-RP-l AGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGC (序列號 28)pUC19-FP-2 ATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGG (序列號 29)
pUC19-RP-2 CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG (序列號 30)二氫黃豆苷元合成酶基因側(cè)弓I物El-RACE-N-Pl ATGCGGATCGCTCGGTTCTCGACCTCTAGGTTAC (序列號 31)E1-RACE-RP2-1 ATCGAGGAGAAGTGCGAGGACGTCAGGGTCATC (序列號 32)E1-RACE-N-P2 TTCTCGACCTCTAGGTTACCGATGTAGCCGC (序列號 33)E1-RACE-RP2-2 ACGTCAGGGTCATCGGCATCGGCGACTGCAAG (序列號 34)需要說明的是,本實施例中作為引物使用的寡DNA全部由Sigma-Aldrich Japan 制備。(2-2)使用5’ -RACE及3’ -RACE的二氫黃豆苷元合成酶基因5’端及3’端序列的在5’-RACE、3’-RACE 上使用 Ex-Taq DNA 聚合酶(Takara Bio Inc.)，使用相同的擴(kuò)增程序進(jìn)行First-PCR及Nested-PCR 95 0C 2min, (95 °C 45sec，60 °C 30sec，72 °C lmin) X 30 個周期，72 °C 3min。 First-PCR中，使用按照上述調(diào)制方法制備的基因組DNA稀釋液I μ L (40ng)作為模板， Nested-PCR 中使用 O. 5 μ LFirst-PCR 的產(chǎn)物。Nested-PCR反應(yīng)結(jié)束后，將1/10量的10 X day加入PCR產(chǎn)物中，使用O. 8%的瓊脂糖凝膠對5 μ L混合物進(jìn)行電泳，在5’-RACE觀察到約I. 2kb (SacI)和約I. Okb (Sau3AI) 的DNA片段的擴(kuò)增，在3’-RACE觀察到約O. 6kb (SacI)和O. 3kb (KpnI)的DNA片段的擴(kuò)增。在本實施例中的瓊脂糖電泳中，使用溴化乙錠(Nippongene Co. Ltd.)進(jìn)行染色， 使用 λ /StyI (Nippongene Co. Ltd. ) > IOObp ladder (Toyobo Co. Ltd.)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。將擴(kuò)增的DNA片段從瓊脂糖凝膠上切除，使用凝膠回收試劑盒(Qiagen)進(jìn)行純化。通過在擴(kuò)增中所使引物的直接序列，確定純化DNA片段的堿基序列。結(jié)果顯示，二氫黃豆苷元合成酶基因的序列出現(xiàn)在5’ -RACE的上述約I. 2kb (SacI)和約I. Okb (Sau3AI)的 DNA片段中以及3’ -RACE的約0. 6kb (SacI)的DNA片段中。(3) 二氫黃豆苷元合成酶基因全堿基序列的確定使用DNA序列拼接軟件SEQUENCHER (Gene Codeslnc, USA)對DNA堿基序列進(jìn)行拼接分析，所述DNA堿基序列由實施例A5中所示的兼并PCR及本實施例⑵中的cDNA末端序列的快速擴(kuò)增得到。結(jié)果，確定了在二氫黃豆苷元合成酶基因附近的3548bp的基因組結(jié)構(gòu)，表明二氫黃豆苷元合成酶基因是由1935個核苷酸和由644個氨基酸組成的多肽。將由堿基序列確定的全氨基酸序列和由氨基酸序列明確的部分氨基酸序列相核對，結(jié)果表明，所有由氨基酸序列明確的部分氨基酸序列都?xì)w屬于由堿基序列確定的全氨基酸序列。(4)編碼區(qū)域的堿基序列的確證
在本實施例的(3)中得到的序列中，觀察到克隆之間存在較多堿基不一致的部位，這是在使用PCR擴(kuò)增時由DNA聚合酶堿基參入錯誤引起的。因此，使用First strand cDNA作為模板，通過使用PCR擴(kuò)增含有二氫黃豆苷元合成酶基因編碼區(qū)域的區(qū)域 (2368bp),所述 PCR 使用了 作為 High-FidelityDNA-聚合酶的 Easy-A(R) -High-Fidelity PCR 克隆酶(Stratagene)。使用的擴(kuò)增引物如下所示。El-conf-NP TGCCGGTGCAATGGCTGACATCATGTTCAACCTG (序列號 35)El-conf-CP TCCTCCATCGTTCCTCCAATCAGTAAGACACGCG (序列號 36)使用凝膠回收試劑盒(Qiagen)對得到的DNA片段進(jìn)行純化，并使用直接序列進(jìn)行序列的確證、最終確定。實施例A7通過在擴(kuò)增培養(yǎng)液中添加黃豆苷元進(jìn)行二氫黃豆苷元合成酶基因的表達(dá)誘導(dǎo)如實施例Al所述，在乳球菌20-92株的擴(kuò)增用培養(yǎng)液中加入作為底物的黃豆苷元時，所培養(yǎng)細(xì)胞具有二氫黃豆苷元合成活性。由此推測通過在擴(kuò)增培養(yǎng)液中加入黃豆苷元可誘導(dǎo)二氫黃豆苷元合成酶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而誘導(dǎo)翻譯成蛋白質(zhì)。因此以上述假設(shè)為基礎(chǔ)進(jìn)行下述實驗。制備分別在添加有黃豆苷元的培養(yǎng)基及未添加黃豆苷元的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來源于乳球菌20-92株細(xì)胞的cDNA，通過進(jìn)行RT-PCR研究擴(kuò)增培養(yǎng)液中黃豆苷元的添加是否誘導(dǎo)了二氫黃豆苷元合成酶基因的表達(dá)。(I)對來自于乳球菌20-92株的全RNA的提取、純化對來自于乳球菌20-92株的全RNA的提取、純化按照以下方法進(jìn)行。在37 °C下，將在4 °C下密封保存的乳球菌20-92株在含有10mg/L黃豆苷元 (Funakoshi Co.，Ltd.)或不含黃豆苷元的改良GAM肉湯培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)8小時，然后將25mL培養(yǎng)液移入50mL容量的管中，在4°C下以3500rpm離心10分鐘，傾析除去培養(yǎng)基， 收集細(xì)胞。立即用液氮對所收集的細(xì)胞進(jìn)行冷凍，然后按照說明書使用ImL TRIzoI溶液 (Invitrogen)對全RNA進(jìn)行提取、純化。純化的全RNA通過進(jìn)行DNase I (Invitrogen)處理除去混入的基因組DNA,并將其用于first-strand cDNA的合成。(2)來白全 RNA 的 first-strandcDNA 合成由2 μ g經(jīng)過DNaseI處理的全RNA,通過使用用于RT-PCR(Invitrogen)的 SuperScript (注冊商標(biāo))First-Strand合成系統(tǒng)合成first-strand cDNA(逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)。按照說明書，使用附帶的RandomHexamer mix作為用于DNA合成的延伸引物,進(jìn)行 first-strand cDNA的合成。另外，為了確證用于合成first-strand cDNA的已被DNase I 處理的全RNA沒有混入基因組DNA，也同時進(jìn)行未進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)。使用最終的反應(yīng)液作為RT-PCR的模板。上述配制的最終反應(yīng)液為以下4種。I.全RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所述全RNA來自由添加有黃豆苷元的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞(DZN(+)RT(+))
2.全RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所述全RNA來自由未添加黃豆苷元的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞(DZN(-)RT(+))3.全RNA的無逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所述全RNA來自由添加有黃豆苷元的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞(DZN(+)RT(-))4.全RNA的無逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所述全RNA來自由未添加黃豆苷元的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞(DZN(-)RT(-))(3)使用RT-PCR的二氫黃豆苷元合成酶基因表達(dá)的確證通過以本實施例的(2)中所示的4種最終反應(yīng)物為模板進(jìn)行RT-PCR來擴(kuò)增二氫黃豆苷元合成酶基因，比較彼此之間的表達(dá)量。作為對照，使用16S-核糖體RNA序列作為對照基因同時進(jìn)行另一個RT-PCR。RT-PCR的擴(kuò)增條件及用于各自基因擴(kuò)增的引物序列如下所示。 RT-PCR 中使用 Ex-Taq DNA 聚合酶(Takara Bio Inc.)，擴(kuò)增程序為950C 2min, (95°C 30sec,56°C 20sec,72°C 30sec) X 30 個周期，72°C 2min。使用 I μ L本實施例的⑵中的最終反應(yīng)液作為模板。用于本實施例的RT-PCR的引物序列及擴(kuò)增的DNA片段的尺寸如下所示。二氫黃丑苷兀合成酶239bpEl-FP CTACATCGGTAACCTAGAGGTCG(序列號 37)El-RP CCGTGCTGCTTGATGGTCTTTGC (序列號 38)16S-核糖體 RNA 序列326bpGar-I6S-Ribo-FP TGCGTAGATATATGGAGGAAC(序列號 39)Gar-I6S-Ribo-RP CTTATCTCTAAGGATAGCACG(序列號如)需要說明的是，用于16S-核糖體RNA序列擴(kuò)增的引物是基于美國生物工學(xué)信息中心(National Center of Biotechnology Information http://www. ncbi. nlm. nih. gov/) 提供的堿基序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)內(nèi)的格氏乳球菌菌株FLG1216S核糖體RNA基因、部分序列(Accesion No. AF352163-66)的序列進(jìn)行制備的。將1/10量的10 X day加入到PCR產(chǎn)物中，使用1.5%的瓊脂糖凝膠對5 μ L混合物進(jìn)行電泳，觀察到每個基因均擴(kuò)增。在本實施例的瓊脂糖電泳中，使用溴化乙錠(Nippongene Co. Ltd.)進(jìn)行染色,使用 λ /StyI (Nippongene Co. Ltd. )、IOObp ladder (Toyobo Co. Ltd.)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。結(jié)果示于圖6。由使用RT-PCR的二氫黃豆苷元合成酶基因的擴(kuò)增結(jié)果可知，上述基因的有效表達(dá)僅在全RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中被觀察到，所述全RNA來自由添加有黃豆苷元的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞。作為對照可以觀察到擴(kuò)增的16S-核糖體RNA序列以同等水平表達(dá)，與培養(yǎng)基中是否添加黃豆苷元無關(guān)。另外，由于逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中二氫黃豆苷元合成酶基因及16S-核糖體RNA序列兩者均未擴(kuò)增，因此確證了用于合成first-strand cDNA的已被DNase I處理的全RNA中沒有混入基因組DNA。以上結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中黃豆苷元的添加誘導(dǎo)了二氫黃豆苷兀合成酶基因的mRNA的表達(dá)。實施例AS使用大腸桿菌的重組El多肽的表汰及其二氡黃豆苷元合成活件的確證使用pET系統(tǒng)表達(dá)El多肽,并確證其二氫黃豆苷兀合成活性,所述pET系統(tǒng)為使用大腸桿菌的重組蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。(I)El多肽表達(dá)載體的制備為了制備El多肽表達(dá)載體(pET21-El-His)，通過PCR擴(kuò)增El核苷酸可讀框區(qū)域的 DNA?；趯嵤├鼳6確定的El核苷酸序列制備下述擴(kuò)增引物。exp. Elpet F Nde AGCTCATATGAAGAACAAGTTCTATCCGAA(序列號41)exp. Elpet His AATCGAATTCCTACAGGTTGCAGCCAGCGATGT (序列號42)為了插入到pET21a(Novagen)中，上述擴(kuò)增引物exp.Elpet F Nde、exp. Elpet His被設(shè)計為分別包含限制酶NdeI切割位點(diǎn)和EcoRI切割位點(diǎn)序列。使用含有下述組成的25 μ L反應(yīng)液進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述反應(yīng)液組成為上述引物各5pmol ；dNTP各5nmol ;實施例A5中純化的乳球菌20-92株的基因組DNA 40ng ；KOD-pIus DNA 聚合酶用 IOX 緩沖液(Toyobo Co. , Ltd.) 2. 5 μ L ；K0D-Plus DNA 聚合酶O. 3U (ToyoboCo.，Ltd.)。擴(kuò)增程序為95 °C 3 分鐘，(94 V 30 秒，60 V 30 秒，68 V 2 分鐘)父30個周期，68で 7 分鐘。PCR 設(shè)備GeneAmpPCR System9700 (Applied Biosystems)。使用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應(yīng)液的一部分，結(jié)果，檢測出所預(yù)測的尺寸的條帶。使用QIAGEN PCR純化試劑盒(Qiagen)回收全部PCR產(chǎn)物。將回收的DNA片段用限制酶NdeI及EcoRI切斷后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。然后，切除包含目標(biāo)條帶的部分，用Qiagen凝膠提取試劑盒(Qiagen)進(jìn)行純化、回收。使用DNA連接試劑盒ver. 2. I (Takara BioInc.)將所得的DNA片段與用NdeI及EcoRI消化的pET21a在16°C下連接一夜，然后使用連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株(Takara BioInc.)。在37°C下，將轉(zhuǎn)化體在含有氨芐青霉素(50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基瓊脂(GIBCO)板上培養(yǎng)一夜，得到菌落。將所得的單菌落在3mL含有氨節(jié)青霉素(50yg/mL)的LB培養(yǎng)基(GIBCO)中培養(yǎng)一夜后，使用質(zhì)粒自動提取機(jī)PI-100 (KURABO)提取質(zhì)粒DNA。使用染料終止法對插入了質(zhì)粒的DNA堿基序列進(jìn)行測序，確證了 El核苷酸如期望那樣被成功插入，從而得到了 pET21-El-His。使用DNA測序儀ABI3700 (AppliedBiosystems)對本實施例中的DNA序列進(jìn)行測定。(2)在大腸桿菌內(nèi)重組體的制備和重組El多肽的表汰及確證使用表達(dá)重組El多肽的質(zhì)粒pET21-El-His和pET21a(陰性對照)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)株(Novagen)。在37°C下，將轉(zhuǎn)化體在含有氨芐青霉素(50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基瓊脂板上培養(yǎng)一夜，得到單菌落。在37°C下，將上述每個大腸桿菌BL21 (DE3)轉(zhuǎn)化體在3mL含有50 μ g/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜。然后向O. 5mL上述培養(yǎng)液中加入50mL含有相同濃度氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)3小時(直到OD在630nm變?yōu)榧sO. 4)，加入IPTG (異丙基-p-硫代半乳糖卩比喃糖苷；Wako Pure Chemical Industries)使最終濃度為ImM,在37°C培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)結(jié)束后，通過使用Avanti HP25 (beckman coulter)離心分離(6000rpm 4°C 15分鐘)細(xì)胞以收集細(xì)胞。之后的操作在冰上進(jìn)行。將離心上清液(培養(yǎng)基)除去，使細(xì)胞懸濁于ImL O. IM磷酸鉀緩沖液(ρΗ7· O ；KPB-PDH)中，所述磷酸鉀緩沖液(ρΗ7· O ；KPB-PDH)中含有ImM PMSF、2mM DTT、5mM連ニ亞硫酸鈉，將懸濁液移入2ml輔助管(AssistCorporation)中，所述輔助管中事先裝有O. 7mL氧化錯/娃珠(BioSpec Products, Inc.)及 400 μ L KPB-PDH,使用 FastPr印(R) (Thermo ELECTRON CORPORATION)，將 6500rpm 處理20秒-冰冷3分鐘這一周期重復(fù)兩次對細(xì)胞進(jìn)行破碎，得到細(xì)胞破碎液。使用SDS-聚丙烯酰胺-凝膠電泳(SDS-PAGE)對大腸桿菌內(nèi)的重組El多肽的表達(dá)進(jìn)行確證。在IOyL上述細(xì)胞破碎液中加入2. 5yL的5X樣品緩沖液(125mMTris-HCl(pH6. 5)/25%丙三醇/5% SDS/5% 2-巰基こ醇/BPB 0. 5%)，在98で下加熱變性5分鐘后，冰冷懸濁液，使用SDS-PAGE對上述5 μ L懸濁液進(jìn)行電泳。使用市售的凝膠板(SuperS印 5-20% (和光純藥エ業(yè)株式會社))進(jìn)行SDS-PAGE，用Quick CBB (和光純藥エ業(yè)株式會社)進(jìn)行染色。使用 Prestained XL-Ladder Broad range (Apro Science)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。 SDS-PAGE的結(jié)果示于圖7。結(jié)果確證了在來自pET21_El-His轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞破碎液中存在分子量約為70kDa的重組El多肽。(3)由重組體得到的El多肽的ニ氫黃豆苷元合成活性的確證以本實施例的(2)中得到的細(xì)胞破碎液作為酶源測定由黃豆苷元向ニ氫黃豆苷元轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)換活性，在表達(dá)的重組El多肽中確證其活性。本實施例中按照以下方法對由黃豆苷元向ニ氫黃豆苷元的轉(zhuǎn)換活性進(jìn)行測定。制備下述組成的酶反應(yīng)液，在37°C下溫育2小吋。酶反應(yīng)液組成
細(xì)胞破碎液(酶源) 100 μ NADH(IOOmM) 20 μ NADPH(IOOmM) 20 μ 黃豆苷元(2 mg / ml) 5 μ KPB - PDH_855 μ
總計1000 μ 溫育后，在所得的酶反應(yīng)液中加入3mLこ酸こ酯進(jìn)行提取處理，干燥后，用流動相(洗脫液)溶解。使用HPLC分析溶解產(chǎn)物來測定酶反應(yīng)液中黃豆苷元及ニ氫黃豆苷元的含量。HPLC分析的結(jié)果示于圖8。結(jié)果觀察到在來自由表達(dá)重組El多肽的質(zhì)粒pET21-El-His的轉(zhuǎn)化體的菌破碎液中，加入酶反應(yīng)液中的黃豆苷元(底物)轉(zhuǎn)換為ニ氫黃豆苷元，而在作為陰性対照的pET21a轉(zhuǎn)化體中在酶反應(yīng)液中未檢測出ニ氫黃豆苷元。以上結(jié)果表明，重組El多肽具有由黃豆苷元合成ニ氫黃豆苷元的活性。(實施例B)
參考例BI順式-四氫黃豆苷元及反式-四氫黃豆苷元的合成按照以下流程制備順式-四氫黃豆苷元及反式-四氫黃豆苷元。需要說明的是，以下關(guān)于化合物的表示均使用下述簡稱?；衔颕 (黃豆苷元)4’，7- ニ羥基異黃酮化合物2 :4’，7- ニこ?；慄S酮化合物3 :4’，7- ニこ酰基異黃烷-4-酮化合物4 :順式-4’，7- ニこ?；慄S烷-4-酚
化合物5 :反式-4 ’，7- ニこ?；慄S烷-4-酚 化合物6 :順式-四氫黃豆苷元化合物7 :反式-四氫黃豆苷元
a^cool
黃豆れ⑴0Η2°AC3°AC
NaBH4 __ AcOy^yOΑ Ο^^γΟ.
MeOH, CH2CI2+
OH ^OAcβΗ し^OAc
*5
ac0V^V0'!NaOMeΗΟ^γΟ
'ΜΘΟΗ uTooh
46
I
57化合物2的合成將O. 76mL(8. Ommol)醋酸酐加入含有500mg(l. 97mmol)黃豆苷元(化合物I)的吡啶(5mL)溶液中，在60°C下攪拌兩小時。在反應(yīng)液中加入少量甲醇后，加入3N鹽酸中。用水稀釋后過濾析出的固體，水洗。將所得固體在室溫下風(fēng)干得到609mg (I. 80mmol,91%收率)白色粉末狀的化合物2。化合物S=1HnmrOSOmHz, CDCl3) δ (ppm) 2. 33 (3H, s)，2· 37 (3H，s)，
7.13-7. 22 (3Η, m)，7. 32 (1Η, d, J = 2. 3Hz)，7. 54-7. 63 (2Η, m) ,8. 01 (1Η, s)，8. 33 (1Η, d, J=8. 8Ηζ).化合物3的合成在氫氣氛下室溫攪拌甲醇(6mL)_こ酸こ酯(6mL)懸池液2小時,所述懸池液中含有400mg(l. 18mmol)化合物2及150mg 10 %披鈀碳(含水物，約50wt % )。使用硅藻
土過濾反應(yīng)液，用こ酸こ酯清洗殘渣。使用硅膠柱色譜法(硅膠ニ氯甲烷/こ酸こ酷=100/0-19/1)對由濃縮濾液所得的殘渣進(jìn)行純化，得到312mg(0.917mmol，78%收率)白色粉末狀的化合物3。化合物3 =1H NMR(250MHz, CDCl3) δ (ppm) 2. 29 (3H, s) ,2. 32 (3H, s)，
3.93-4. 04 (1H, m)，4. 60-4. 75 (2H, m)，6. 76-6. 84 (2H, m)，7. 04-7. 13 (2H, m)，7. 27-7. 35 (2H,m)，7. 93-8. 01(1H, m).化合物4及化合物5的合成在(TC下，在含有IOOmg (O. 294mmol)化合物3的甲醇(ImL)-ニ氯甲烷(ImL)溶液中加入llmg(0· 29mmol)硼氫化鈉，在(TC下攪拌30分鐘。依次將2mL IN鹽酸、50mL水加入反應(yīng)液中，用こ酸こ酯進(jìn)行提取。依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水對有機(jī)層進(jìn)行清洗，用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥。使用硅膠柱色譜法(硅膠ニ氯甲烷/こ酸こ酷=19/1-3/1)對蒸懼除去溶劑得到的殘洛進(jìn)行純化。使用中壓柱層析法(Yamazen,Ultra Pack SI-40B 正己燒/こ酸こ酷=3/2)對所得的非對映體混合物進(jìn)行純化,得到44mg(O. 13mmol,44%收 率)無色針狀化合物4及26mg(75mmol，26%收率)無色針狀化合物5?；衔? =1H NMR (250MHz，CDCl3) δ (ppm) :1. 80 (1H, d, J = 4. OHz)，2· 30 (3H,s)，2. 31 (3H, s)，3. 32 (1H, td, J = 3. 5,11. 5Ηζ)，4· 32 (1H, ddd, J=L 3,3. 5,10. 5Hz)，
4.59 (1H, dd, J = 10. 5，11. 5Hz) ,4. 76-4. 83 (1H, m) ,6. 64-6. 73 (2H, m)，7. 06-7. 14 (2H, m)，
7.27-7. 35 (3H, m).化合物5 =1H NMR (250MHz, CDCl3) δ (ppm) :2. 02 (1H, d, J = 5. 5Hz)，2. 29 (3H, s)，2. 30 (3H, s) ,3. 11-3. 24 (1H, m) ,4. 26 (1H, dd, J = 9. 0，11. 3Hz) ,4. 37 (1H, dd, J = 3. 8，11. 3Hz) ,4. 92 (1H, dd, J = 5. 5,7. 8Hz) ,6. 62 (1H, d, J = 2. 3Hz) ,6. 72 (1H, dd, J = 2. 3,
8.5Hz)，7. 04-7. 12 (2H, m)，7. 21-7. 30 (2H, m)，7. 47 (1H, d, J = 8. 5Hz) ·化合物6的合成在含有116mg(0. 339mmol)化合物4的甲醇(4mL)溶液中加入55mg(I. Ommol)甲醇鈉，在室溫下攪拌2小吋。在反應(yīng)液中加入離子交換樹脂(DOWEX 50X8W，銨形式)中和后，濾去樹脂。用甲醇清洗由濃縮濾液所得的固體，得到62mg (O. 24mmol，71 %收率)白色粉末狀的化合物6?；衔? =1H NMR(250MHz, DMS0_d6) δ (ppm) :3. 03 (1H, td, J = 3· 3，12. OHz)，4. 00-4. 15 (1H, m)，4. 31-4. 51 (2H, m, including 4. 39，dd, J= 10. 3,12. 0Hz)，4. 96 (1H, d, J=5. 8Hz)，6. 18 (1H, d, J = 2. 3Hz)，6. 32 (1H, dd, J = 2. 3,8. 3Hz)，6. 69 (2H, d, J = 8. 5Hz)，7. 00 (1H, d, J = 8. 3Hz)，7. 09 (2H, d, J = 8. 5Hz)，9. 19 (1H, br s) ,9. 31 (1H, br s) ·化合物7的合成在含有84mg(0. 25mmol)化合物5的甲醇(2mL)懸池液中加入0. 73mL(0. 73mmol)的IN氫氧化鈉，在室溫下攪拌2. 5小時。在反應(yīng)液中加入飽和氯化銨水溶液，使用こ酸こ酯進(jìn)行提取。依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水清洗有機(jī)層，用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥。蒸餾除去溶劑，得到64mg(0. 25mmol，定量收率)白色粉末狀的化合物7?；衔? ,H NMR (250MHz, DMS0_d6) δ (ppm) :2. 82-2. 96 (1H, m)，4· 04-4. 22 (2H,m)，4. 60 (1H, t, J = 7. OHz)，5. 18 (1H, d, J = 7. OHz)，6. 14 (1H, d, J = 2. 3Hz)，6. 34 (1H, dd,J = 2. 3,8. 5Hz)，6. 67 (2H, d, J = 8. 5Hz)，7. 04 (2H, d, J = 8. 5Hz)，7. 16 (1H, d, J = 8. 5Hz)，
9.21 (1H, s) ,9. 28 (1H, s).
參考例B2將乳球菌20-92株(FERM BP-10036號)接種于含有黃豆苷元的擴(kuò)增用液體培養(yǎng)基中，在厭氧條件下，在37°C下培養(yǎng)7 24小吋。培養(yǎng)后，通過離心分離收集細(xì)胞并冷凍保存，在以下實施例中使用。實施例B I四氫黃豆苷元生成的確證通過進(jìn)行以下試驗確證四氫黃豆苷元為雌馬酚生物合成的中間代謝物。(I)菌破碎物的調(diào)制將在_80°C保存的乳球菌20-92株細(xì)胞快速解凍后，通過穿刺術(shù)使細(xì)胞懸濁，使用VC-960 (Taitec株式會社(制))在4°C下以8，OOOrpm離心分離5分鐘，除去上清液后，カロ入O. IM磷酸鉀緩沖液/ImM PMSF(苯甲基磺酰氟)/2mM DTT(ニ硫蘇糖醇)/5mM連ニ亞硫酸鈉(pH7.0)得到細(xì)胞懸濁液。然后，將細(xì)胞懸濁液移入2ml管中，所述2ml管中事先裝有氧化,告/娃珠(約O. 8mL,O. lmm, lib ；ffakenyaku Co. ,Ltd.)，再在管中加入O. IM磷酸鉀緩沖液/ImM PMSF/2mMDTT/5mM連ニ亞硫酸鈉(pH7. O)使管幾乎裝滿。然后，蓋上管蓋并將其保存在冰中，使用 FastPrep (R) (Thermo ELECTRON CORPORATION)，6500rpm X 20 秒離心-冰冷，將該操作重復(fù)4次，對細(xì)胞進(jìn)行破碎，所得的菌破碎物在酶反應(yīng)中作為酶源使用。(2)酶反應(yīng)調(diào)制ImL下述組成的酶反應(yīng)液，所述酶反應(yīng)液中含有0. Iml上述(I)菌破碎物，在37°C下溫育2小吋。溫育后，將3mLこ酸こ酯加入所得酶反應(yīng)產(chǎn)物中進(jìn)行提取處理，之后干燥，使用HPLC進(jìn)行分析。酶反應(yīng)液組成0. IM 磷酸鉀緩沖液 /ImM PMSF/2mM DTT/5mM 連ニ亞硫酸鈉(ρΗ7· 0) 2mM NADPH2mM NADH10 μ g/mL ニ氫黃豆苷元或四氫黃豆苷元(3)通過酶反應(yīng)由ニ氫黃豆苷元生成四氫黃豆苷元以ニ氫黃豆苷元為底物，以菌破碎物為酶源得到的酶反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果示于圖9。另外，上述參考例I中合成的四氫黃豆苷元的HPLC分析也一井示于圖9。結(jié)果顯示，以ニ氫黃豆苷元為底物以菌破碎物為酶源得到的酶反應(yīng)產(chǎn)物中存在中間體，所述中間體具有與反式-四氫黃豆苷元的保留時間相一致的保留時間，表明生成反式-四氫黃豆苷元。(4)通過酶反應(yīng)由四氡黃豆苷元牛成雌馬酪以順式-四氫黃豆苷元或反式-四氫黃豆苷元為底物，以菌破碎物為酶源得到的酶反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果示于

圖10。由圖10可知由上述兩種化合物均能生成雌馬酚，四氫黃豆苷元在雌馬酚生物合成過程中可以作為底物，與四氫黃豆苷元為順式還是反式無關(guān)。實施例B2細(xì)胞破碎物的離心上清液中的四氫黃豆苷元生物合成活性存在的確證、及NADH或NADPH依存件的確證將保存的冷凍細(xì)胞解凍后，在5000XG，4°C下離心分離15分鐘，將沉淀物用于以下試驗。將沉淀物(濕重量2. 7g)懸濁于IOmL 0. IM磷酸鉀溶液中，所述磷酸鉀溶液中含有ImM PMSF及5mM連ニ亞硫酸鈉。在37°C下預(yù)熱5分鐘后，每克沉淀物(濕重量)加入IOOmg溶菌酶，在37°C下反應(yīng)I. 5小吋。然后，在所得的反應(yīng)液中加入等量的O. IM磷酸ニ鉀溶液后，再加入3ml氧化鋯/硅珠，用旋渦混合器劇烈攪拌，再用超音波儀(Branson超聲波破碎儀200)破碎細(xì)胞(5min處理，2min休息的周期重復(fù)3次)。將所得的細(xì)胞破碎液在約10，000XG下離心15分鐘得到離心上清液，將其用作酶源。調(diào)制下述組成的酶反應(yīng)液，在37°C下溫育2小吋。溫育后，將5mLこ酸こ酯加入所得的酶反應(yīng)產(chǎn)物中進(jìn)行提取處理，之后干燥，使用HPLC進(jìn)行分析。_反應(yīng)液組成
細(xì)胞破碎液離心上清液(酶源)250 μ NADH(100 mM)或 NADPH(100 mM)20 μ
ニ氫黃豆苷元(I mg / ml)10 μ
0.1Μ磷酸鉀緩沖液(ρΗ7·0)/1 mM DTT/5mM連ニ亞硫酸鈉_720 ul _
總計ΙΟΟΟμΙ結(jié)果示于圖11。根據(jù)上述結(jié)果可以確證在細(xì)胞破碎物的離心上清液中存在四氫黃豆苷元生物合成活性。另外還確證了由ニ氫黃豆苷元向四氫黃豆苷元的轉(zhuǎn)換依存于輔酶NADH，更強(qiáng)烈依存于NADPH。實施例Β3四氫黃豆苷元合成_的純化將乳球菌20-92株細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)20小吋，每培養(yǎng)瓶中含有67ml擴(kuò)增用液體培養(yǎng)基，所述液體培養(yǎng)基中含有黃豆苷兀，將10瓶上述細(xì)胞離心后,使其懸池于0. 02M磷酸鉀緩沖液(pH 7 ;以下記為“Buffer A”)中，所述磷酸鉀緩沖液含有ImM PMSF(苯甲基磺酰氟)及 4mM DTT (ニ硫蘇糖醇)。使用 French press (SLM INSTRUMENTS INC)破碎細(xì)胞(1800psi,6次)，離心破碎液得到上清液。另外，將乳球菌20-92株細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)18小吋，每培養(yǎng)瓶中含有200ml液體培養(yǎng)基，將5瓶上述細(xì)胞同樣被French press細(xì)胞破碎后，離心得到上清液。將38ml前離心上清液與47ml后離心上清液混合，將上述82ml混合液用于預(yù)先被Buffer A平衡的紅色瓊脂糖凝膠(約7ml)。然后,用150mlBufTer A清洗紅色瓊脂糖凝膠，再用含有IOmM NADPH的Buffer A進(jìn)行洗脫(20ml/級分)。將各級分作為酶源，在與實施例B2所示的酶反應(yīng)條件(使用NADPH作為輔酶)相同的條件下測定四氫黃豆苷元生物合成活性，得到活性級分No. I 5。使用Amicon Ultra Centrifugal UFC801024(MW Cut :10，000)對具有四氫黃豆苷元生物合成活性的級分No. I 5進(jìn)行超濾濃縮，得到約2. Iml的濃縮液。將濃縮液分成3份，分別與等量的含有3M硫酸銨的Buffer A混合后，將其用于使用TSKgel Phenyl-5Pff (東曹株式會社)的HPLC。HPLC的條件如下所示。測定280nm處蛋白質(zhì)的吸收。柱TSKgelPhenyl-5Pff流速lml/min級分2ml/2min/級分洗脫液A :0. 02M磷酸鉀緩沖液(pH 7)/ImM DTT/2. 5mM連ニ亞硫酸鈉/0. 5 %isoProH 洗脫液B :含有IM硫酸銨的洗脫液A
時間(min)(洗脫液B)/(洗脫液A+洗脫液B)
OI洗脫程序 5I
25O
45O上述HPLC結(jié)果表明，具有四氫黃豆苷兀合成活性的級分存在于第15號以后 (No. 15級分以后，保留時間30分鐘以后)的廣范圍內(nèi)，混合HPLC的No. 19 22級分，進(jìn)行超濾濃縮[Amicon Ultra Centrifugal UFC801024 (MW Cut 10, 000) ] 在以下條件下將所得的約130 μ I濃縮液中的100 μ I用于使用TSKgel G2000SWXL (東曹株式會社)的凝膠過濾 HPLC。柱TSKgeIG2000SWXL流速0.6ml/min級分1.2ml/2min/ 級分洗脫液0. 05M磷酸鉀緩沖液(pH 7)/ImM DTT/2. 5mM連ニ亞硫酸鈉/I %isoProH/Ο. 3M NaCl凝膠過濾HPLC的結(jié)果示于圖12。另タ卜，圖13表示在還原條件下各級分的SDS-PAGE結(jié)果。上述結(jié)果表明，作為具有四氫黃豆苷元合成活性的主級分的No. 7級分在還原條件下存在28kDa及32kDa的條帶。實施例B4四氫黃豆苷元合成_氨基酸序列的分析將上述實施例3中得到具有四氫黃豆苷元合成活性的級分(No. 7級分)作為樣品進(jìn)行MS分析。具體而言，使用SDS-PAGE對樣品進(jìn)行分離，切除條帶。在凝膠內(nèi)對被切除的條帶進(jìn)行還原烷化，并在凝膠內(nèi)使用胰蛋白酶進(jìn)行消化。然后，回收·純化胰蛋白酶消化肽，用LC-MS進(jìn)行分析。使用作為MS分析支援軟件的PEAKS (Infocom株式會社)對使用LC-MS分析獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭測序，從而計算 推定肽的氨基酸序列。詳細(xì)方法等如下所
/Jn ο(I)實驗原料本實驗使用的試劑及儀器如下SuperS印HG 10/20 % (和光純藥エ業(yè)株式會社)、Flamingo凝膠染色試劑盒(Bio-Rad)、TCEP(三(2-羧こ基)膦)(Pierce)、分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物(株式會社AproScience)、DTT(Calbiochem)、碘こ酰胺(和光純藥エ業(yè)株式會社)、こ腈(KantoKagaku)、胰蛋白酶(Promega)、TFA(Pierce)、碳酸氫銨(Sigma)、氨水(Merck株式會社)、甲酸(Kanto Kagaku)、Empore Cation-SRDisk (Sumitomo 3M 株式會社)、MonoCap 濃縮柱(GL Science 株式會社)、MonoCap for Nano Flow O. 1X1 50mm (GL Science株式會社)、FortisTip (AMR株式會社)、真空離心濃縮儀(SAVANT)、HTS-PAL自動進(jìn)樣器(CTC-Analytics)> Chorus220(CTC-Analytics)> Q STAR Pulsari (Applied Biosystems)>PEAKS 軟件(Infocom株式會社)。(2) SDS-聚丙烯釀胺凝膠電泳
將I μ I IOOmM TCEP加入20 μ I上述實施例Β3中得到的具有四氫黃豆苷元合成活性的級分(No. 7級分)中，在70°C下還原處理10分鐘后，將全部樣品用于SuperS印HG，并按照常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE。電泳后使用Flamingo凝膠染色試劑盒(Bio-Rad)進(jìn)行染色(參見圖14)。然后將染色后出現(xiàn)的條帶LGl及LG2分別切下Imm2左右。使用IOOmM碳酸氫銨溶液清洗被切下的凝膠后，用こ腈進(jìn)行脫水，使用Speed Vac Concentrator干燥固化。(3)凝膠內(nèi)胰蛋白_的消化將DTT溶液(溶解于IOOmM碳酸氫銨中，濃度為I. 54mg/ml)加入干燥的凝膠片上并在55°C下溫育45分鐘，進(jìn)行還原處理。除去DTT溶液后加入碘こ酰胺溶液(溶解于IOOmM碳酸氫銨中，濃度為10. lmg/ml)，并在室溫遮光條件下溫育30分鐘。除去溶液后，依次用50%こ腈溶液、100%こ腈溶液、IOOmM碳酸氫銨溶液、100%こ腈溶液清洗凝膠片，用真空離心濃縮儀干燥固化。在干燥凝膠片上加入少量的胰蛋白酶溶液(溶解于50mM碳酸氫銨中， 濃度為12. 5 μ g/ml)，在冰上浸潰45分鐘。浸潰后除去多余的胰蛋白酶溶液，加入50mM碳酸氫銨溶液直至凝膠片被浸潰，然后在37°C下反應(yīng)16小吋。(4)使用質(zhì)譜進(jìn)行氨基酸序列的分析回收胰蛋白酶消化肽，使用在移液管尖端填充有Empore Cation-SR Disk的簡易柱進(jìn)行預(yù)處理純化。用O. l%TFA/90%こ腈溶液清洗回收胰蛋白酶消化肽。在簡易柱中，首先使用O. 1% TFA/2%こ腈溶液對樣品進(jìn)行平衡，樣品吸著后，使用O. 1% TFA/90%こ腈溶液對柱進(jìn)行清洗，然后用5%氨/30%こ腈溶液對樣品進(jìn)行洗脫，洗脫后使用真空離心濃縮儀對消化肽進(jìn)行干燥濃縮。將TFA加入消化肽溶液中使其pH被調(diào)節(jié)至3左右，并且將樣品放置在自動進(jìn)樣器HTS-PAL中。將放置于HTS-PAL中的樣品裝載在位于LC-MS用進(jìn)樣閥的樣品濃縮柱中并在柱中進(jìn)行清洗。使用nanoHPLC-ChorUS220將濃縮柱的樣品在分析柱中進(jìn)行分離，并在位于分析柱中的FortisTip中離子化,然后使用QSTAR Pulsar i進(jìn)行分祈。LC-MS的分析條件如下所示。LC部分Chorus220 :A溶劑0. I %甲酸/2%こ腈；B溶劑0· I %甲酸/90%こ腈；流速=300nl/min ;梯度5% A-65% B/20min ；MS部分NanoESI正離子模式，信息依賴性獲取模式(Information dependentacquisition mode) (m/z = 400 1400,大于 25counts, Charge state = 2 4) ;4 次實驗/I 周期實驗 I (T0F-MS, m/z = 400 1400,累積時間(Accumulation time) = lsec),實驗 2 4 (Positive Product Ion, m/z = 100 1400,累積時間=2sec)將由LC-MS得到的條帶LG1、LG2(參見圖14)的數(shù)據(jù)使用PEAKS 軟件進(jìn)行從頭測序分析，以推定消化肽的氨基酸序列。實施例B5 ニ氡黃豆苷元合成(El)酶基因的周邊基因組DNA序列的分析(I) Inverse-PCR用基因組DNA文庫的擊!I備使用如下所不的限制酶(BamHI,EcoRI, HindIII, KpnI, PstI, SacI, Sail, Sau3AI,XhoI)(均來自Takara Bio)通過在37°C下消化16小時將實施例A5中純化的乳球菌20-92株(FERM BP-10036號)基因組DNA進(jìn)行片段化，用酚·氯仿處理后，使用こ醇沉淀進(jìn)行純化。通過使用TaKaRa連接試劑盒var. 2. I (Takara Bio Inc.)使純化的基因組DNA片段自我連接，使用滅菌水將各連接溶液稀釋10倍，制備Inverse-PCR用基因組DNA文庫。[1005](2) Inverse-PCR以I μ L(相當(dāng)于40ng)上述⑴所述的Inverse-PCR用基因組DNA文庫作為模板，使用Inverse-PCR嘗試擴(kuò)增El多核苷酸周邊上游及下游區(qū)域的基因組DNA。將用PstI、XhoI處理的片段作為Inverse-PCR擴(kuò)增上游端區(qū)域的模板DNA，將用HindIII、PstI、SacI、XhoI處理的片段作為Inverse-PCR擴(kuò)增下游端區(qū)域的模板DNA。在Inverse-PCR中使用TaKaRa LA Taq (Takara Bio Inc.)。使用包含下述組成的20 μ L反應(yīng)液進(jìn)行First-PCR :IXPCR Buffer (無Mg2+);引物各 O. 5nM ;dNTP，各 O. 5mM ；MgCl22. 5mM ；TaKaRa LA Taq 0. 2U ；并使用luL(40ng)基因組DNA文庫稀釋液作為模板，按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增98°C lmin,(95°C 10sec，62°C 10sec，68°C IOmin)父35個周期，68で 15min。然后使用 O. 5 μ L First-PCR產(chǎn)物為模板，并使用包含下述成分的30 μ L反應(yīng)液進(jìn)行Nested-PCR :I XPCR Buffer (無Mg2+)，引物各 O. 5nM, dNTP 各 O. 5mM, MgCl22. 5mM, TaKaRa LA Taq O. 3U,擴(kuò)增程序如下980C lmin, (95°C IOsec, 62°C 10sec,68°C IOmin) X 30 個周期 68で 15min。(2-1)使用引物用于Inverse-PCR的引物組合如下所示。(2-1-1)卜.游端First-PCR :RACE-N-P3-1 和 El-Bub-N-P INested-PCR :RACE-N-P3_2 和 El_Bub-N_P2(2-1-2)下游端First-PCR :RACE-C-P3-1 和 El-Bub-C-P INested-PCR :RACE-C-P3_2 和 El_Bub-C_P2(2-2)使用引物的序列分別用于上游端及下游端的Inverse-PCR的引物序列如下所示。上游端的擴(kuò)增引物序列RACE-N-P3-1 ATGGAGATAGTGCCGCTGGCAAGGCAACGGCAC (序列號43)RACE-N-P3-2 TCAACGAAGACTCGATTTGAGCGAGAGGCGAGG (序列號44)El-Bub-N-P I ACGGTGGAACCGGCATCGTGTTCATGGACAAC(序列號45)El-Bub-N-P2 GCGTGACCCAGTTCCACCATGTCGGACTGTC(序列號46) 下游端的擴(kuò)增引物序列RACE-C-P3-1 GACATCCCGTTCGAGCGCAGGATCACCCATGAG(序列號47)RACE-C-P3-2 AGGATCACCCATGAGCGCATCGCTATCATGGAC(序列號48)El-Bub-C-P I CATCGCTCTTGCAGTCGTTGTCCAGGAAGTCC(序列號49)El-Bub-C-P2 [1034]TTGTCCAGGAAGTCCATCGCGTACACGACGGAG (序列號50)需要說明的是，本實施例中作為擴(kuò)增引物使用的寡DNA全部由Sigma-AldrichJapan合成。(3)由Inverse-PCR擴(kuò)增的ニ氫黃豆苷元合成酶基因周邊基因組DNA片段的純化及堿基序歹I」的確足將10 X day加入本實施例⑵中得到的Nested-PCR產(chǎn)物中，使其量相當(dāng)于Nested-PCR產(chǎn)物的1/10，使用O. 8%的瓊脂糖凝膠對5 μ L產(chǎn)物進(jìn)行電泳。結(jié)果確證了在上游端區(qū)域內(nèi)O. 5kb (PstI),3. 5kb (XhoI)DNA片段擴(kuò)增，在下游端區(qū)域內(nèi)Ikb (HindIII)、Ikb (SacI)、2· 5kb (XhoI)DNA片段擴(kuò)增。本實施例中瓊脂糖電泳使用溴化こ錠(NippongeneCo. Ltd.)進(jìn)行染色，使用 λ /StyI (Nippongene Co. Ltd. ) > IOObpladder (Toyobo Co. Ltd.)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。將擴(kuò)增的DNA片段從瓊脂糖凝膠上切除，使用QIAGEN凝膠回收試劑盒(Qiagen)進(jìn)行純化。通過直接序列法及步移法對純化DNA片段的堿基序列進(jìn)行確定，所述直接序列法及步移法使用在擴(kuò)增中使用的引物。 (4)基因組序列的分析及ORF(開放閱讀框)的預(yù)測使用序列拼接軟件SEQUENCHER(Gene Codes Inc, USA)對本實施例(3)中所得的DNA序列進(jìn)行拼接分析，并且預(yù)測0RF。其結(jié)果確定了包含El酶基因的周邊基因組區(qū)域的6685bp序列。由分析結(jié)果得到的包含ニ氫黃豆苷元合成酶基因周邊基因組結(jié)構(gòu)的簡圖示于圖15。通過預(yù)測0RF，發(fā)現(xiàn)在El酶基因上游存在三個ORF(其中ー個的N末端未鑒定)，下游存在ー個0RF。將ニ氫黃豆苷元合成酶上游ー側(cè)的ORF記為HP^tream(US) 1、US2、US3，下游一側(cè)的 ORF 記為 Uown^tream(DS) I。實施例B6通過LC-MS分析對消化肽序列與基因組序列的核對將上述實施例B4中得到的推定的氨基酸序列與上述實施例B5中確定的ニ氫黃豆苷元合成(El)酶基因的周邊基因組DNA序列數(shù)據(jù)進(jìn)行核對。結(jié)果，主要由LG2得到的若干序列與由0RF-US2核苷酸序列推定的多肽的序列一致。以上結(jié)果暗示0RF-US2多肽可能為四氫黃豆苷兀合成酶。與0RF-US2多肽一致的消化肽的序列如下所不。另外，圖16-1、16-2、16-3表示使用LC-MS獲得的數(shù)據(jù)。表I
權(quán)利要求
1.一種多肽，所述多肽具有以黃豆苷元為底物合成ニ氫黃豆苷元的活性。
2.如權(quán)利要求I所述的多肽，所述多肽以NADPH或NADH作為輔酶顯示所述活性。
3.如權(quán)利要求I或2所述的多肽，所述多肽的最適溫度在30°C左右。
4.如權(quán)利要求I 3中任一項所述的多肽，所述多肽的最適pH為7.O。
5.如權(quán)利要求I 4中任一項所述的多肽，所述多肽通過SDS-PAGE測定的分子量約為70kDa。
6.如權(quán)利要求I 5中任一項所述的多肽，所述多肽為來自擬桿菌、鏈球菌、或乳球菌的多肽。
7.如權(quán)利要求I 6中任一項所述的多肽,所述多肽為下述(Aa) (Ac)中的任ー種， (Aa)多肽，由序列號I所示的氨基酸序列組成； (Ab)多肽，由在序列號I所示的氨基酸序列中，取代、缺失、插入及/或添加選自下述位置的I 15個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以黃豆苷元為底物合成ニ氫黃豆苷元的活性， 所述位置為第45位的亮氨酸、第80位的天冬酰胺、第167位的纈氨酸、第231位的天冬氨酸、第233位的異亮氨酸、第435位的精氨酸、第459位的天冬氨酸、第462位的纈氨酸、第528位的精氨酸、第540位的絲氨酸、及第639位的異亮氨酸、及它們的前后3個的氨基酸的位置； (Ac)多肽，由與序列號I所示的氨基酸序列具有98%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以黃豆苷元為底物合成ニ氫黃豆苷元的活性。
8.如權(quán)利要求I 7中任一項所述的多肽，所述多肽為由序列號I所示的氨基酸序列組成的多肽、由序列號2所示的氨基酸序列組成的多肽或由序列號3所示的氨基酸序列組成的多肽。
9.一種ニ氫黃豆苷兀的制備方法,所述制備方法包括使權(quán)利要求I 8中任一項所述的多肽、以及NADPH及/或NADH作用于黃豆苷元的步驟。
10.ー種多核苷酸，所述多核苷酸編碼權(quán)利要求I 8中任一項所述的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的多核苷酸，所述多核苷酸為下述(Ad) (Af)中的任ー種多核苷酸 (Ad)多核苷酸，由序列號4所示的核苷酸序列組成； (Ae)多核苷酸，編碼由序列號I所示的氨基酸序列組成的多肽； (Af)多核苷酸，與上述(Ad)多核苷酸具有97. 6%以上的同一性，并且編碼具有以黃豆苷元為底物生成ニ氫黃豆苷元活性的多肽。
12.如權(quán)利要求10或11所述的多核苷酸，所述多核苷酸為由序列號4所示的核苷酸序列組成的多核苷酸、由序列號5所不的核苷酸序列組成的多核苷酸、或由序列號6所不的核苷酸序列組成的多核苷酸。
13.—種表達(dá)載體,所述表達(dá)載體含有權(quán)利要求10 12中任一項所述的多核苷酸。
14.ー種重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞是由權(quán)利要求13所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到的。
15.一種多肽的制備方法，所述制備方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞，得到具有以黃豆苷元為底物生成ニ氫黃豆苷元活性的多肽的步驟。
16.—種ニ氫黃豆苷兀的制備方法,所述制備方法包括使權(quán)利要求14所述的細(xì)胞作用于黃豆苷元的步驟。
17.ー種抗體，所述抗體與權(quán)利要求I 8中任一項所述的多肽具有親和性。
18.—種ニ氫黃豆苷元合成用試劑盒，所述試劑盒含有權(quán)利要求14所述的細(xì)胞、及黃豆苷元。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種與二氫黃豆苷元合成有關(guān)的酶、編碼上述酶的基因、及使用上述酶和基因制備二氫黃豆苷元的方法。本發(fā)明提供二氫黃豆苷元合成酶、四氫黃豆苷元合成酶及雌馬酚合成酶和編碼上述酶的基因。并且，本發(fā)明提供一種使用上述酶合成二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚的方法。
文檔編號C12N1/19GK102703395SQ20121012650
公開日2012年10月3日 申請日期2008年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月27日
發(fā)明者保田世津子, 宮澤憲浩, 島田良和, 林隆史, 阿比留康弘, 高橋真行 申請人:大塚制藥株式會社