專利名稱：一株發(fā)酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內(nèi)生真菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株內(nèi)生真菌。
背景技術(shù)：
北五味子[Schisandra chinensis (Turcz. ) Baill.],木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí)，是既食又藥功能性保健食品。北五味子的活性成分是以五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素等為代表的木脂素類成分，該類成分具有明顯的抗癌、抗炎、鎮(zhèn)靜，抗焦慮，保護(hù)肝細(xì)胞，抗化學(xué)性肝損傷、抗菌等作用，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品行業(yè)。由于北五味子需求量上漲，森林面積逐漸減少以及盲目的采挖，使北五味子資源面臨考驗(yàn)，目前北五味子是國(guó)家三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)的瀕危藥用植物。發(fā)酵技術(shù)可以改變或增強(qiáng)食品的某些活性，保護(hù)食品中某些活性成分，節(jié)省資源，為食品、藥品活性成分的獲得提供新方法。關(guān)于北五味子發(fā)酵的相關(guān)研究目前未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株發(fā)酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內(nèi)生真菌。本發(fā)明發(fā)酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內(nèi)生真菌，它為黑曲霉(Aspergillus niger)WJl，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC No:M2012044，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日；它在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌絲初為白色，后變成黑色厚絨狀，背面無色，菌株頂部形成球狀頂囊，其上全面覆蓋一層?；鸵粚有」＃祥L(zhǎng)有成串黑褐色球狀分生孢子，孢子直徑3. 5 y m，分生孢子頭球狀，褐黑色。本發(fā)明中發(fā)酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內(nèi)生真菌，它為黑曲霉(Aspergillus niger) WJl,依據(jù)《真菌分類學(xué)》、《真菌鑒定手冊(cè)》和《半知菌屬圖解》,可見WJl菌株的菌落特征和孢子形態(tài)與曲霉菌特征極為相近。本發(fā)明中發(fā)酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內(nèi)生真菌，它為黑曲霉(Aspergillus niger) WJl,其ITS序列提交至NCBI網(wǎng)頁(yè),通過Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過MEGA5. 03軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，WJl菌株的ITS序列與曲霉屬菌黑曲霉(Aspergillus niger)菌株的相似性達(dá)到了 99%以上,結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果,確定WJl菌株為黑曲霉(Aspergillus niger)。本發(fā)明發(fā)酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內(nèi)生真菌，它為黑曲霉(Aspergillus niger) WJ1，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC No:M2012044，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。本發(fā)明采用分離自北五味子的內(nèi)生真菌WJl發(fā)酵北五味子，以北五味子中4種主要木脂素成分為指標(biāo)，比較其發(fā)酵前后此4種主要活性成分的動(dòng)態(tài)變化，旨在增強(qiáng)北五味子的活性和提高木脂素成分含量，為高效利用北五味子，節(jié)省藥源、開發(fā)新型功能性保健食品提供依據(jù)。本發(fā)明發(fā)酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內(nèi)生真菌，它為黑曲霉(Aspergillus niger) WJl,它能使北五味子中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素等主要活性成分顯著提高，因此在以獲得五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素為目的的原料生產(chǎn)中可以選擇五味子內(nèi)生真菌WJl發(fā)酵五味子以提高得率，節(jié)省藥源。


圖I為具體實(shí)施方式
一中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl的菌落形態(tài)圖；圖2為具體實(shí)施方式
一中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl的菌落形態(tài)圖；圖3為具體實(shí)施方式
一中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl的菌落形態(tài)圖；圖4為具體實(shí)施方式
一中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl的PCR擴(kuò)增的電泳圖，其中M泳道表示Marker，WJl泳道表示W(wǎng)Jl ；圖5為具體實(shí)施方式
一中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖；圖6為具體實(shí)施方式
一中混合對(duì)照品的HPLC色譜圖，其中I表示五味子醇甲，2表不五味子酯甲，3表不五味子甲素和4表不五味子乙素；圖7為具體實(shí)施方式
一中北五味子的HPLC色譜圖，其中I表示五味子醇甲，2表示五味子酯甲，3表不五味子甲素和4表不五味子乙素；圖8為具體實(shí)施方式
一中WJl發(fā)酵后的五味子HPLC色譜圖,其中I表不五味子醇甲，2表不五味子酯甲，3表不五味子甲素和4表不五味子乙素。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式發(fā)酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內(nèi)生真菌，它為黑曲霉(Aspergillus niger)WJ1，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC No :M2012044，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。本實(shí)施方式中黑曲霉(Aspergillus niger) WJl，它在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌絲初為白色，后變成黑色厚絨狀，背面無色，菌株頂部形成球狀頂囊，其上全面覆蓋一層?；鸵粚有」＃祥L(zhǎng)有成串黑褐色球狀分生孢子，孢子直徑3. 5 y m，分生孢子頭球狀，褐黑色(如圖1、2和3所示)。本實(shí)施方式中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl，其生長(zhǎng)溫度為28°C，生長(zhǎng)pH值自然。本實(shí)施方式中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl,該菌株分離自健康的藥用植物北五味子植株的根莖，采自黑龍江省帽兒山地區(qū)，并經(jīng)黑龍江省中醫(yī)研究院付克治研究員鑒定為木蘭科植物五味子屬Schisandra Chinensis (Turcz. ) Baill.的植株,樣本現(xiàn)存于黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥實(shí)驗(yàn)室；它按以下步驟進(jìn)行分離培養(yǎng)(I)材料預(yù)處理選取健康北五味子的根莖用自來水沖洗干凈后以無菌濾紙吸干水分，切成0. 5cm小段，備用；(2)表面消毒于無菌超凈臺(tái)內(nèi)將健康北五味子的根莖按下述方法進(jìn)行表面消毒75%酒精浸泡3 次氯酸鈉浸泡15min-無菌水沖洗4次。用無菌手術(shù)刀將樣品從中間切開，分別置于馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基和馬鈴薯液體分離培養(yǎng)基中，28°C恒溫培養(yǎng)箱和搖床中培養(yǎng)，待其邊緣及頂端長(zhǎng)出菌絲后，及時(shí)挑取菌落轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的培養(yǎng)基中；(3)陰性對(duì)照取最后一次沖洗北五味子的無菌水涂布培養(yǎng)平板(馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基)或取適量此沖洗液倒入馬鈴薯液體分離培養(yǎng)基內(nèi)作對(duì)照，另將消毒后的實(shí)驗(yàn)材料在平板(馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基)上滾動(dòng)一周作對(duì)照，于相同的條件下培養(yǎng)；(4)菌體培養(yǎng)將消毒后的實(shí)驗(yàn)材料分別置于馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基和馬鈴薯液體分離培養(yǎng)基中，于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7d，待實(shí)驗(yàn)材料周圍長(zhǎng)出菌體，挑取菌體轉(zhuǎn)入平板(馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基)上多次劃線分離純化，將純化后的菌株于斜面固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4 °C保存?zhèn)溆?。馬鈴薯液體分離培養(yǎng)基馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA):每L由200g的馬鈴薯、20g的蔗糖和余量的水組成，pH自然，121°C高壓滅菌30min ;其中馬鈴薯去皮，切成小塊煮沸30min，用6層紗布過濾。馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA):每L由200g的馬鈴薯、20g的蔗糖，16g的瓊脂粉和余量的水組成，pH自然，121°C高壓滅菌30min ;其中馬鈴薯去皮，切成小塊煮沸30min，用6層紗布過濾。斜面固體培養(yǎng)基取5mL馬鈴薯固體培養(yǎng)基裝于試管中，121°C高壓滅菌30min后，鋪成斜面冷卻，以備保存菌種。試驗(yàn)用主要儀器設(shè)備和試劑見表I ;表I
權(quán)利要求
1.一株發(fā)酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內(nèi)生真菌，其特征在于它為黑曲霉(Aspergillus niger) WJl,已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號(hào)為CCTCC No:M2012044，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。
全文摘要
一株發(fā)酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內(nèi)生真菌，它涉及一株內(nèi)生真菌。發(fā)酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內(nèi)生真菌，它為黑曲霉(Aspergillus niger)WJ1，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NoM2012044，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。本發(fā)明黑曲霉(Aspergillus niger)WJ1能使北五味子中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素等主要活性成分顯著提高，因此在以獲得五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素為目的的原料生產(chǎn)中可以選擇五味子內(nèi)生真菌WJ1發(fā)酵五味子以提高得率，節(jié)省藥源。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102628018SQ20121012623
公開日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者劉玉潔, 鄭春英, 陸欣媛 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)