專利名稱：使用了微生物催化劑的丙烯酰胺的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過作為微生物源酶的腈水合酶的作用由丙烯腈制造丙烯酰胺的方法。更詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及通過腈水合酶的作用由保管在低于30°c的溫度下的丙烯腈制造丙烯酰胺的方法以及裝置。
背景技術(shù)：
丙烯酰胺作為產(chǎn)業(yè)上的重要物質(zhì)而應(yīng)用于廣大領(lǐng)域中。例如，丙烯酰胺的聚合物廣泛應(yīng)用于廢水處理用絮凝劑、紙力增強(qiáng)劑、石油回收劑等。丙烯酰胺以往在工業(yè)上以還原狀態(tài)的銅為催化劑對相應(yīng)丙烯腈進(jìn)行水合而制造，近年來，開發(fā)了使用生物催化劑(微生物催化劑)來代替銅催化劑的方法，其一部分已經(jīng)實用化。生物催化劑法因兼具反應(yīng)條件溫和、幾乎沒有副產(chǎn)物、工藝極簡單，作為工業(yè)制法是最有希望的，至今為止，發(fā)現(xiàn)了多種含 有作為酶的腈水合酶的微生物，所述腈水合酶具有將丙烯腈水合而轉(zhuǎn)換成丙烯酰胺的催化能力。作為使用了微生物催化劑的丙烯酰胺的制造方法，可列舉出專利文獻(xiàn)廣3中記載的方法，作為反應(yīng)方法，可列舉出專利文獻(xiàn)4中記載的方法等。關(guān)于有效的反應(yīng)方法，也進(jìn)行了大量研究(專利文獻(xiàn)5、)。另外，為了更有效地制造高性能的丙烯酰胺，還針對對丙烯腈進(jìn)行處理或者使用雜質(zhì)少的丙烯腈進(jìn)行了各種研究(專利文獻(xiàn)1(Γ15)。然而，關(guān)于保存或貯藏丙烯腈時的溫度，記載了按照通常的MSDS(材料安全數(shù)據(jù)表，Material Safety Date Sheet)等在冷暗處保管(例如，非專利文獻(xiàn)I)，但關(guān)于丙烯腈保存溫度對丙烯酰胺水合反應(yīng)的影響，至今為止沒有研討過。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特開平11-123098號專利文獻(xiàn)2 :日本特開平7-265091號專利文獻(xiàn)3 :日本特公昭56-38118號專利文獻(xiàn)4 :日本特開平11-89575號專利文獻(xiàn)5 日本特表2004-524047號專利文獻(xiàn)6 :中國專利申請公開1482250號專利文獻(xiàn)7 :國際公開第2007/097292號專利文獻(xiàn)8 :國際公開第2007/132601號專利文獻(xiàn)9 :國際公開第03/000914號專利文獻(xiàn)10 :日本特開平9-227478號專利文獻(xiàn)11 :日本特開2000-016978號專利文獻(xiàn)12 :日本特開平11-123098號專利文獻(xiàn)13 :日本特開2001-288156號
專利文獻(xiàn)14 國際公開第2007/043466號專利文獻(xiàn)15 :國際公開第2004/090148號非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :制品安全數(shù)據(jù)表丙烯腈DIA-NITRIX CO.，LTD.制作

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的目的在于提供制造高濃度的丙烯酰胺的方法和裝置。用于解決問題的方案本發(fā)明人等為了解決上述問題而進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，關(guān)于丙烯腈的保存·溫度與使用該丙烯腈作為原料的丙烯酰胺的生成反應(yīng)的效率之間的關(guān)系，如果使用在低于30°C的溫度下保管的丙烯腈，則能夠以更少的催化劑量制造濃度更高的丙烯酰胺，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明如下所示。(I) 一種使用具有腈水合酶的生物催化劑由丙烯腈制造丙烯酰胺的方法，所述方法包括按照丙烯腈的溫度低于30°C的方式冷卻和保管丙烯腈的工序。(2) 一種丙烯酰胺制造裝置，所述制造裝置使用具有腈水合酶的生物催化劑由丙烯腈制造丙烯酰胺，具備用于將丙烯腈的溫度維持在低于30°C的溫度調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)。發(fā)明的效果如果使用在低于30°C的溫度下保存的丙烯腈，則能夠以更少的催化劑量制造濃度更高的高品質(zhì)丙烯酰胺。即，與以往的制造方法相比，在本發(fā)明的制造方法中，每單位催化劑量的化合物的產(chǎn)量(即催化劑的生產(chǎn)效率(以下，也簡稱為“生產(chǎn)率”))顯著增加。而且，可以降低由生物催化劑或用于將其懸濁的液體帶入的、或者提取出的各種有機(jī)系雜質(zhì)(糖類、蛋白質(zhì))和/或無機(jī)系雜質(zhì)(礦物質(zhì)類)，可以得到濃度更高的丙烯酰胺。


圖I是本發(fā)明的丙烯酰胺制造裝置中使用的具備丙烯腈冷卻機(jī)構(gòu)的貯存裝置的說明立體圖。圖2是表示具備丙烯腈貯存裝置的丙烯酰胺制造裝置的概略的說明圖。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的實施方式進(jìn)行說明。以下的實施方式僅作為用于說明本發(fā)明的例示，本發(fā)明不受該實施方式的限制。本發(fā)明在不脫離其宗旨的范圍內(nèi)，可以通過各種方式實施。本說明書包含作為本申請優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本特愿2010-106562號說明書(申請日2010年5月6日)的內(nèi)容。關(guān)于本說明書中引用的所有出版物、例如、技術(shù)文獻(xiàn)和公開公報、專利公報以及其它專利文獻(xiàn)，將其整體作為本說明書的參考而援引于此。
使用了生物催化劑的丙烯酰胺的制造方法可以是利用連續(xù)反應(yīng)而進(jìn)行的方法(使丙烯酰胺連續(xù)生成的方法)，也可以是利用間歇式反應(yīng)而進(jìn)行的方法(使丙烯酰胺非連續(xù)地生成的方法)，對此沒有限定，優(yōu)選利用連續(xù)反應(yīng)而進(jìn)行的方法。此處，利用連續(xù)反應(yīng)而進(jìn)行的方法是指一邊連續(xù)或間歇地供給反應(yīng)原料(包括生物催化劑和丙烯腈)和連續(xù)或間歇地取出反應(yīng)混合物(包括生成的丙烯酰胺)，一邊連續(xù)地制造丙烯酰胺而不將反應(yīng)器內(nèi)的反應(yīng)混合物全部抽出的方法。反應(yīng)中的丙烯腈濃度根據(jù)所使用的生物催化劑的種類、形態(tài)而異，優(yōu)選為O. 5^15. O重量％左右。利用連續(xù)反應(yīng)進(jìn)行本發(fā)明的制造方法時，按照可以連續(xù)地制造而不將反應(yīng)器內(nèi)的反應(yīng)混合物全部抽出的方式，并考慮丙烯腈和生物催化劑的導(dǎo)入速度而決定從反應(yīng)器中取出反應(yīng)混合物時的流體速度。本發(fā)明所使用的生物催化劑中包含含有催化目標(biāo)反應(yīng)的酶(即，腈水合酶)的動 物細(xì)胞、植物細(xì)胞、細(xì)胞器、菌體(活菌體或死滅體)或其處理物。作為處理物，包含從細(xì)胞中提取的粗制酶或純化酶，進(jìn)而包含用包埋法、交聯(lián)法、載體結(jié)合法等將動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、細(xì)胞器、菌體(活菌體或死滅體)或酶自身固定化而成的產(chǎn)物。優(yōu)選的是，具有腈水合酶的生物催化劑是指用包埋法、交聯(lián)法、載體結(jié)合法等將包含具有腈水合酶活性的酶的菌體或其處理物或菌體或酶自身固定化而成的產(chǎn)物。此處，作為包埋法，可列舉出將菌體或酶包入高分子凝膠的微細(xì)格子中或用半透膜性的高分子皮膜包覆的方法，作為交聯(lián)法，可列舉出將酶用具有兩個或兩個以上官能團(tuán)的試劑(多官能性交聯(lián)劑)進(jìn)行交聯(lián)的方法，作為載體結(jié)合法，可列舉出使酶與水不溶性的載體結(jié)合的方法。作為固定化載體，有玻璃微珠、硅膠、聚氨酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、角叉菜膠(carrageenan)、海藻酸、瓊脂以及明膠等。在將菌體固定化的方法之中，由于包埋固定化法可以得到菌體濃度高的固定化菌體，因此在工業(yè)上較常用。例如，日本特公昭58-35078、日本特開平7-203964中示出了將丙烯酰胺和/或丙烯酰胺的衍生物用作包埋固定化用單體的例子。作為本發(fā)明所指的具有腈水合酶活性的微生物，可優(yōu)選列舉出屬于芽孢桿菌(Bacillus)屬、無芽抱桿菌(Bacteridium)屬、微球菌(Micrococcus)屬、短桿菌(Brevibacterium)屬〔日本特公昭 62-21519 號〕、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬、諾卡氏菌(Nocardia)屬〔日本特公昭56-17918號〕、假單胞菌(Pseudomonas)屬〔日本特公昭59-37951 號〕、微桿菌(Microbacterium)屬〔日本特公平4-4873 號〕、紅球菌(Rhodococcus)屬〔日本特公平4-4873號、日本特公平6-55148號、日本特公平7-40948號〕、無色桿菌(Achromobacter)屬〔日本特開平6-225780〕、假諾卡氏菌(Pseudonocardia)屬〔日本特開平9-275978號〕的微生物，但不限定于這些。更優(yōu)選紅球菌(Rhodococcus)屬細(xì)菌。作為更優(yōu)選的菌體，可列舉出紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) Jl株(FERM BP-1478)。具有腈水合酶活性的紫紅紅球菌Rodococcus rhodochrousJl株以保藏號FERM BP-1478于1987年9月18日在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)進(jìn)行國際保藏。其中，委托保藏者的信息如下所示。名稱山田秀明
地址京都府京都市左京區(qū)松崎木之本町19番地I另外，也可以使用取得前述微生物源的腈水合酶基因，直接或人為地進(jìn)行改良，將該基因?qū)肴我馑拗鞫傻霓D(zhuǎn)化體。作為前述轉(zhuǎn)化體，可例示出用無色桿菌(Achromobacter)屬的腈水合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化的大腸桿菌MT 10770 (FERMP-14756)(日本特開平8-266277號)、用假諾卡氏菌(Pseudonocardia)屬的腈水合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化的大腸桿菌MT10822 (FERM BP-5785)(日本特開平9-275978號)或者用紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)種的腈水合酶(日本特開平4-211379號)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的微生物。進(jìn)而，還可以按照上述文獻(xiàn)中記載的方法或其他公知方法(分子克隆，實驗室手冊第二版(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nded.，)冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989));分子生物學(xué)的現(xiàn)有草案(Current Protocols in Molecular Biology), (Johnffiley&Sons (1987-1997))，制作所期望的轉(zhuǎn)化體。在本發(fā)明的方法中，只要可表達(dá)腈水合酶基因，則可以使用任意的 轉(zhuǎn)化體來作為生物催化劑。生物催化劑的用量根據(jù)所使用的生物催化劑的種類和/或形態(tài)而異，優(yōu)選以在反應(yīng)溫度10°C下每mg干燥菌體達(dá)到5(T200U左右的方式調(diào)整向反應(yīng)器中導(dǎo)入的生物催化劑的活性。其中，前述單位U (unit)是指I分鐘內(nèi)由丙烯腈生成I微摩爾的丙烯酰胺，是使用制造中使用的丙烯腈測定而得到的值。與使用了在30°C以上保管的丙烯腈的丙烯酰胺的制造方法中使用的生物催化劑的量相比，本發(fā)明的制造方法能夠以更少的量進(jìn)行反應(yīng)，或者以等量的生物催化劑的量制造更多的丙烯酰胺。在本發(fā)明中，保管原料丙烯腈是指，例如在丙烯酰胺制造設(shè)備附帶的丙烯酰胺保管貯存設(shè)備中，將丙烯腈保管一定時間以上(例如，I天以上，優(yōu)選為3天以上，更優(yōu)選為7天以上)。作為保管貯存設(shè)備，有保管包含丙烯腈的桶的設(shè)備和貯存丙烯腈的罐等，工業(yè)上制造丙烯酰胺時，通常優(yōu)選丙烯腈貯存罐。丙烯腈的貯存設(shè)備優(yōu)選具有遮光性、氧隔絕性、防火性、抗靜電性、防振性等，進(jìn)而，理想的是具備可以使貯存環(huán)境處于密閉且可以根據(jù)情況排氣/換氣的機(jī)構(gòu)。貯存形態(tài)只要能夠確保丙烯腈的穩(wěn)定性則沒有特別限定，為了提高丙烯腈的穩(wěn)定性，可以任選添加穩(wěn)定劑。按照丙烯腈的溫度低于30°C的方式冷卻和保管是指，在夏季、高溫地域貯存丙烯腈時，以內(nèi)部的丙烯腈溫度不會達(dá)到30°C以上的方式進(jìn)行冷卻和保管。本發(fā)明還提供設(shè)置有用于冷卻和保管丙烯腈的冷卻裝置的丙烯酰胺制造裝置(設(shè)備)。作為用于防止內(nèi)部溫度上升的冷卻裝置，只要是可使用冷卻用流體冷卻丙烯腈的裝置則沒有特別限定。對冷卻用流體沒有特別限定，較之氣體，通過使用熱容量大的液體可以更有效地冷卻丙烯腈。特別是，冷卻用液體之中優(yōu)選使用成本低且容易處理的水。上述那樣的具備罐的冷卻設(shè)備可以用各種方法冷卻丙烯腈。作為丙烯腈的貯存罐的冷卻機(jī)構(gòu)，例如可列舉出向罐的表面噴灑水或冷卻水的機(jī)構(gòu)、設(shè)置于罐壁的冷卻用夾套機(jī)構(gòu)或者在罐壁或罐內(nèi)部設(shè)置蛇管并使冷卻水、乙二醇水溶液等冷卻用溶液(冷媒)在蛇管內(nèi)部流通的機(jī)構(gòu)等。冷卻水或冷媒可以循環(huán)反復(fù)使用，在噴灑廉價且不影響環(huán)境的水時，也可以不重復(fù)使用而直接排水。
以下，針對具備噴水設(shè)備的丙烯腈的貯存裝置，使用圖I進(jìn)行更詳細(xì)的說明。需要說明的是，圖I所示那樣的丙烯腈的貯存裝置僅為一個例子，丙烯腈的冷卻方法不限定于以下的說明。如圖I所示那樣，丙烯腈的貯存裝置2具備能夠組裝到丙烯酰胺的制造裝置30(參照圖2)的構(gòu)成，用于貯存丙烯腈的貯存罐4具備用于將容納于該罐4的丙烯腈冷卻至例如低于30°C的冷卻機(jī)構(gòu)10。貯存罐4由金屬等導(dǎo)熱度高的材料形成，罐表面實施了耐腐蝕加工以使其不被水等腐蝕。作為貯存罐4的冷卻機(jī)構(gòu)，可以使用內(nèi)部蛇管式或夾套式，從運轉(zhuǎn)成本等低等方面出發(fā)，冷卻機(jī)構(gòu)優(yōu)選使用噴水方式。噴水方式的冷卻機(jī)構(gòu)10具備溫度檢測部12、冷卻水閥16等。在可以根據(jù)經(jīng)驗通過外界氣溫、天氣等氣候條件推測丙烯腈的溫度的情況下，也可以不使用溫度檢測部12。
·
在使用具有溫度檢測部12的冷卻機(jī)構(gòu)10時，基于由溫度檢測部12輸入的溫度信息反饋控制丙烯腈的溫度，溫度調(diào)節(jié)部14基于溫度信息控制冷卻水閥16的開關(guān)，調(diào)節(jié)丙烯腈的溫度。從冷卻水源供給的冷卻水使用例如溫度調(diào)節(jié)至5°C 20°C的經(jīng)冷卻的水或乙二醇水溶液，或者在可廉價地獲取工業(yè)用水等的情況下，直接使用工業(yè)用水。使用工業(yè)用水時，可以進(jìn)行排水而不回收所噴灑的水。貯存罐4的上部設(shè)置有用于噴灑冷卻水的、例如形成為環(huán)狀的噴水環(huán)4a，從冷卻水源經(jīng)由冷卻水供給管20向噴水環(huán)4a供給冷卻水。噴水環(huán)在外圓周上穿通有小噴水孔18，以便使水均勻地潤濕貯存罐4的表面。由噴水環(huán)4a介由噴水孔18噴灑的冷卻水在流過例如貯存罐4表面的同時冷卻罐表面，由此來冷卻貯存罐4內(nèi)的丙烯腈。只要能夠冷卻貯存罐4，則對噴水環(huán)4a的大小、噴水孔18的尺寸沒有特別限定，例如，可以將噴水環(huán)4a的直徑設(shè)為40mm，在該噴水環(huán)4a上以75mm的間隔設(shè)置直徑3. 5mm的噴水孔18。作為冷卻水閥16的驅(qū)動形式，例如可列舉出以下形式等在溫度檢測部12檢測的丙烯腈的溫度超過閾值(例如，25°C )時打開冷卻水閥16，向貯存罐4側(cè)供給冷卻水，而在所檢測的丙烯腈的溫度處于閾值以下時關(guān)閉冷卻水閥16。通過這樣打開冷卻水閥16向貯存罐4側(cè)供給冷卻水，可以將貯存罐4內(nèi)貯存的丙烯腈維持在低于30 °C。接著，使用圖2說明具有丙烯腈的貯槽裝置的丙烯酰胺的制造裝置。需要說明的是，關(guān)于丙烯腈的貯存裝置，與圖I所例示的貯存裝置相同的部分賦予相同的符號，僅作簡單說明而省略其詳細(xì)說明。如圖2所示那樣，丙烯酰胺的制造裝置30具備丙烯腈的貯存裝置2、反應(yīng)器36、分離器39、丙烯酰胺貯留罐43、冷卻水供給部45等。冷卻水供給部45可以經(jīng)由冷卻水路向反應(yīng)器36供給冷卻水，反應(yīng)器36能夠通過所供給的冷卻水進(jìn)行冷卻。從反應(yīng)器36排出的冷卻水經(jīng)由冷卻水路返回至冷卻水供給部45。制造裝置30中，從丙烯腈的貯存罐2經(jīng)由供給線47向反應(yīng)器36供給丙烯腈，供給于反應(yīng)器36的丙烯腈例如通過攪拌槳36a與生物催化劑混合，利用腈水合酶反應(yīng)生成丙烯酰胺。從反應(yīng)器36中排出混合了丙烯酰胺的反應(yīng)混合液，所排出的反應(yīng)混合液供給于以例如離心分離機(jī)等為代表的分離器39。從供給于分離器39的反應(yīng)混合液中分離丙烯酰胺，所分離的丙烯酰胺被貯留在丙烯酰胺的貯留罐43中，所分離的生物催化劑以廢催化劑的形式被廢棄。罐4內(nèi)的丙烯腈的溫度被控制在例如25°C以下，將這樣調(diào)節(jié)過溫度的丙烯腈供給于反應(yīng)器36中，從而可以高效地生產(chǎn)丙烯酰胺，另外，可以提供高品質(zhì)的丙烯酰胺。需要說明的是，針對上述冷卻時的閾值，作為一例例示出了 25°C，但閾值不限于此，可以按照腈水合酶反應(yīng)所使用的生物催化劑的性質(zhì)、反應(yīng)時的溫度進(jìn)行適當(dāng)變更。特別是有時微生物的腈水合酶活性水平會因各種條件而變動，在這種情況下，理想的是，基于其條件確定反應(yīng)溫度，靈活地變更丙烯腈冷卻時的閾值的設(shè)定。如上所述，本發(fā)明的丙烯酰胺制造裝置可以將丙烯腈維持在低于30°C的溫度下，而使其不受該裝置所處的外部環(huán)境溫度(周圍溫度)影響。例如，對于具備使用冷卻水的冷卻機(jī)構(gòu)的制造裝置而言，該裝置的周圍溫度高于適合于丙烯酰胺的生產(chǎn)的溫度時，可以 更積極地使用冷卻水。此時，優(yōu)選預(yù)先監(jiān)測丙烯腈的溫度，但也可以不進(jìn)行監(jiān)測而根據(jù)氣溫和/或陽光的照射進(jìn)行判斷并使冷卻機(jī)構(gòu)運轉(zhuǎn)。另外，還可以省略控制冷卻水供給的閥或泵，而使低于30°C的一定溫度的冷卻水在丙烯腈的貯存罐內(nèi)持續(xù)循環(huán)等，從而將丙烯腈維持于低于30°C。通過這樣的結(jié)構(gòu)也可以高效地生產(chǎn)丙烯酰胺。實施例以下列舉實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受它們的限制。[實施例I和2]:使用在20°C或28°C下進(jìn)行保管的丙烯腈制造丙烯酰胺(丙烯腈的保管)將丙烯腈(DIA-NITRIX CO.，LTD.制造)放入500mL的玻璃瓶中，在調(diào)整至20°C和28°C的恒溫槽中分別保管7天。(生物催化劑的制備)利用包含葡萄糖2%、尿素1%、胨O. 5%、酵母提取物O. 3%、氯化鈷O. 05% (均為重量％)的培養(yǎng)基(PH7.0)在30°C下對具有腈水合酶活性的紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)Jl (FERMBP-1478)進(jìn)行需氧培養(yǎng)。使用離心分離機(jī)對其進(jìn)行分離，用5OmM磷酸緩沖液(PH7. 0)進(jìn)行洗滌，得到菌體懸濁液(干燥菌體15重量％)。(由丙烯腈至丙烯酰胺的反應(yīng))向IL的附帶夾套的可拆式燒瓶中加入664g去離子水，將水溫控制在18°C。30分鐘后，添加0. Sg之前得到的菌體懸濁液，在ISOrpm攪拌下，連續(xù)地添加丙烯腈以使丙烯腈的濃度總是保持2%，開始制造丙烯酰胺。其結(jié)果，在使用以20°C或28°C中的任一溫度進(jìn)行保管的丙烯腈的情況下，從開始添加丙烯腈起25小時內(nèi)所生成的丙烯酰胺的濃度均達(dá)到45%，達(dá)到目標(biāo)。〔比較例I〕除了使用以35°C進(jìn)行保管的丙烯腈之外，與實施例I同樣地實施，25小時時丙烯酰胺濃度僅達(dá)到42%。因此，將菌體的添加量設(shè)為0. 9g時，25小時時達(dá)到45%。以上示出，與使用在30°C以上的溫度下進(jìn)行保管的丙烯腈的情況相比，使用在低于30°C的溫度下進(jìn)行保管的丙烯腈能夠以更少的生物催化劑量制造丙烯酰胺。[實施例3]:具有紫紅紅球菌M8株源的腈水合酶的轉(zhuǎn)化體的制作
(I)由紫紅紅球菌M8株(以下，稱為M8株。)制備染色體DNAM8株(SU 1731814)可以從俄羅斯菌株中心IBFM(VKPMS_926)獲取。在IOOml的MYK(O. 5%多聚蛋白胨、O. 3%Bacto酵母提取物、O. 3%Bacto麥芽提取物、O. 2%Κ2ΗΡ04、0· 2°/οΚΗ2Ρ04)培養(yǎng)基(ρΗ7· O)中在30°C下對Μ8株進(jìn)行72小時振蕩培養(yǎng)。對培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，將所收集的菌體懸濁在4ml Saline-EDTA溶液(O. 1MEDTA、0. 15MNaCl (pH8. O))中。向懸濁液中加入8mg溶菌酶，在37°C下振蕩f 2小時后，在_20°C下凍結(jié)。接著，邊平穩(wěn)地振蕩邊向該懸濁液中加入IOml的Tris-SD S液(1%SD S、0. IMNaCl,O. IM Tris-HCl (ρΗ9· O))。進(jìn)而，向該懸濁液中加入蛋白酶K(Merck&Co.)(終濃度O. lmg)，在37°C下振蕩I小時。接著，加入等量的TE飽和苯酚，攪拌后(TE : IOmMTris-HCl、ImM EDTA(pH8. O))進(jìn)行離心。采取上層，加入2倍量的乙醇，用玻璃棒卷取DNA。其后，將其依次用90%、80%、70%的乙醇離心分離，去除苯酚。
接著，將DNA溶于3ml的TE緩沖液，添加核糖核酸酶A溶液(10(TC，進(jìn)行了 15分鐘的加熱處理)以使該核糖核酸酶A達(dá)到10yg/ml，在37°C下振蕩30分鐘。進(jìn)而，加入蛋白酶K(Merck&Co.)，在37°C下振蕩30分鐘。向其加入等量的TE飽和苯酚，離心分離后，分離成上層和下層。進(jìn)一步在上層中加入等量的TE飽和苯酚，離心分離后，分離成上層和下層。再次重復(fù)該操作。其后，在上層中加入等量的氯仿(含4%異戊醇)，進(jìn)行離心分離，回收上層。接著，在上層中加入2倍量的乙醇，用玻璃棒卷取DNA并進(jìn)行回收，得到染色體DNA。(2)使用PCR由M8株染色體DNA制備腈水合酶基因M8 株源的臆水合酶在 Veiko, V. P. et al, Cloning, nucleotide sequence ofnitrile hydratase gene from Rhodococcusrhodochrous M8, Biotekhnologiia(Mosc. )5,
3-5(1995)中有所記載，β亞基、α亞基、激活劑的序列示于表I。[表 I]
Μ8菌株 j堿基序列~j氨基酸序列 P-亞基^序列號I^序列號2 α-亞基^序列號3^序列號4 激活劑序列號5^序列號6基于上述序列信息，合成引物Μ8-1和Μ8-2，以(I)中制備的染色體DNA為模板進(jìn)行 PCR。< 引物 >Μ8-1 GGTCTAGAATGGATGGTATCCACGACACAGGC (序列號 7)M8-2 CCCCTGCAGGTCAGTCGATGATGGCCATCGATTC (序列號 8)< PCR反應(yīng)溶液組成>模板DNA (染色體 DNA) 200ngPrimeSTAR Max Premix (寶酒造公司制造)25 μ I
引物M8_110pmol引物M8_210pmol<反應(yīng)條件>(98°C下 10 秒、55°C下 5 秒、72°C下 3O 秒)X3O 個循環(huán)PCR結(jié)束后，將5 μ I反應(yīng)液供于O. 7%瓊脂糖凝膠(使用同仁化學(xué)公司制造的Agarose I ;瓊脂糖濃度O. 7重量％)電泳，進(jìn)行I. 6kb的擴(kuò)增片段的檢測。反應(yīng)結(jié)束液體使用 Wizard SV Gel and PCRClean-Up Syste (Promega KK.)進(jìn)行了純化。使用連接試劑盒(Ligation Kit)(寶酒造公司)將所回收的PCR產(chǎn)物連結(jié)于載體(pUC 118/HincII位點)，利用反應(yīng)液對大腸桿菌JM 109的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。由所得轉(zhuǎn)化體菌落向I. 5mlLB-Amp培養(yǎng)基上接種數(shù)個克隆，在37°C下振蕩培養(yǎng)12小時。培養(yǎng)后，通過離心分離收集該培養(yǎng)物的細(xì)菌。通過使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Amersham Biosciences K. K),從所收集的菌體中提取質(zhì)粒DNA。針對所得質(zhì)粒DNA,使用測序試劑盒和自動測序儀CEQ 8000 (Beckman Coulter, Inc.)確認(rèn)腈水合酶的堿基序列。接著，用限制性內(nèi)切酶XbaI和Sse8387I將所得質(zhì)粒DNA切斷后，利用O. 7%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，回收腈水合酶基因片段(I. 6kb)，導(dǎo)入質(zhì)粒pSJ042的XbaI-Sse8387I位點。將所得質(zhì)粒命名為pSJ-NOlA。另外，pSJ042為紅球菌菌中表達(dá)Jl株腈水合酶的質(zhì)粒，用日本特開2008-154552號公報所示的方法進(jìn)行制作，制作PSJ042所使用的pSJ023以轉(zhuǎn)化體ATCC12674/PSJ023 (FERM BP-6232)于1997年3月4日在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)進(jìn)行保藏。其中，保藏者的信息如下所示。名稱MitsubishiRayon Co. , Ltd.地址東京都港區(qū)港南I 丁目6番地41(3)感受態(tài)細(xì)胞的制作將紫紅紅球菌ATCC 12674株(以下，稱為ATCC 12674株)用MYK培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)增殖期前期，利用離心分離器收集細(xì)胞，用冰冷卻過的滅菌水洗滌3次，并懸濁于滅菌水中，制作感受態(tài)細(xì)胞。(4)具有M8株源的腈水合酶的轉(zhuǎn)化體的制作混合所得質(zhì)粒pSJ-NOlAO. I μ g和ATCC12674株的感受態(tài)細(xì)胞的菌體懸濁液各20μ 1，分別在冰上冷卻。向比色皿中加入各混合液，通過基因?qū)胙b置Gene Pulser(ΒΙ0RAD)以20KV/cm、2000HMS進(jìn)行電脈沖處理。將電脈沖處理液在冰冷卻下靜置10分鐘，在37°C下進(jìn)行10分鐘熱休克。其后，向比色皿中加入500 μ IMYK培養(yǎng)基，在30°C下靜置5小時后，涂布于添加了 SOyg/ml卡那霉素的MYK瓊脂培養(yǎng)基，在30°C下培養(yǎng)3天。確認(rèn)所得轉(zhuǎn)化體菌落中含有的質(zhì)粒DNA，將該重組細(xì)菌作為具有M8株源的腈水合酶的紅球菌屬重組細(xì)菌(ATCC12674/pSJ-N01A)。(5)紅球菌屬重組細(xì)菌的制備與實施例I同樣地進(jìn)行培養(yǎng)，得到重組菌體懸濁液(干燥菌體6重量％)。(6)基于重組細(xì)菌由丙烯腈至丙烯酰胺的反應(yīng)向IL的附帶夾套的可拆式燒瓶中加入600g去離子水，將水溫控制在25°C。30分鐘后，添加5g之前得到的重組細(xì)菌(ATCC12674/pSJ-N01A)菌體懸濁液，在180rpm攪拌下，以84g/h的添加速度連續(xù)地添加預(yù)先在室溫(25度以下)下進(jìn)行保管的丙烯腈，開始制造丙烯酰胺。4小時后，丙烯酰胺濃度達(dá)到40%，即達(dá)到目標(biāo)。該反應(yīng)的生產(chǎn)率約為900。{比較例2}除了使用在35°C下進(jìn)行保管的丙烯腈之外，與實施例2同樣地實施，4小時后丙烯酰胺濃度為38%，其后僅丙烯腈濃度上升，未達(dá)到40%，即未達(dá)到目標(biāo)。[實施例4]:具有Psedonocardiathermophila JCM3095株源的腈水合酶的轉(zhuǎn)化體的制作(I)使用PCR由pPT-DBl質(zhì)粒DNA制備腈水合酶基因 pPT-DBl為日本特開平9-275978所得的包含嗜熱假諾卡氏(Psedonocardiathermophila) JCM3095株(以下，稱為JCM3095株。)源腈水合酶基因的質(zhì)粒。JCM3095株在日本特開平9-275978中有所記載，β亞基、α亞基、激活劑的序列不于表2。[表2]
權(quán)利要求
1.一種使用具有腈水合酶的生物催化劑由丙烯腈制造丙烯酰胺的方法，所述方法包括 按照丙烯腈的溫度低于30°c的方式冷卻和保管丙烯腈的工序。
2.一種丙烯酰胺制造裝置，所述裝置使用具有腈水合酶的生物催化劑由丙烯腈制造丙烯酰胺，具備用于將丙烯腈的溫度維持在低于30°C的溫度調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)。
全文摘要
本發(fā)明提供通過作為微生物源酶的腈水合酶的作用由丙烯腈更有效地制造丙烯酰胺的方法。更具體而言，本發(fā)明提供使用具有腈水合酶的生物催化劑由丙烯腈制造丙烯酰胺的方法，所述方法包括按照丙烯腈的溫度低于30℃的方式冷卻和保管丙烯腈的工序。另外，本發(fā)明還提供一種使用具有腈水合酶的生物催化劑由丙烯腈制造丙烯酰胺的制造裝置。
文檔編號C12N15/09GK102884199SQ20118002284
公開日2013年1月16日 申請日期2011年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者村尾耕三, 加納誠, 平田祐司 申請人:大野綠水株式會社