專(zhuān)利名稱(chēng)：解淀粉芽孢桿菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開(kāi)涉及解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株 NRRLB-50350。該菌株表征為具有優(yōu)異的淀粉酶、表面活性劑和抗真菌活性的芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌。此外，本公開(kāi)的菌株產(chǎn)生多種有用的酶，并具有脂肪酶活性，噬菌體抗性和對(duì)pH、鹽和溫度的高耐受性。本公開(kāi)的解淀粉芽孢桿菌菌株及其產(chǎn)生的酶在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、洗滌劑工業(yè)、生物乙醇工業(yè)和烘烤工業(yè)領(lǐng)域中具有許多應(yīng)用。
背景技術(shù)：
解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens 或 B. amyloliquefaciens)是公知的有氧細(xì)菌，常常見(jiàn)于土壤樣品，其承擔(dān)世界上大部分α-淀粉酶和蛋白酶的生產(chǎn)。解淀粉芽孢桿菌是一種革蘭氏陽(yáng)性、能動(dòng)的(motile)、桿狀的細(xì)菌，其通常形成鏈狀(chains)。其生長(zhǎng)的最適溫度是30至40°C，在低于151或高于501不生長(zhǎng)。該生物體之前在Priest等,Bacillus amyloliquefaciens sp.nov.,nom. rev. , International Journal ofSystematic Bacteriology, 37，69-71 (1987)(通過(guò)提述以其整體并入本文)中描述并與枯草芽孢桿菌(B. subtilis)相區(qū)分。該生物體亦表征為具有較低G+C的生物體。

已顯示解淀粉芽孢桿菌的菌株B匪122可為有希望的化學(xué)農(nóng)業(yè)處理的生態(tài)替代方案，并用于開(kāi)發(fā)可持續(xù)的農(nóng)業(yè)管理以替代或減少農(nóng)用化學(xué)品的使用和/或?yàn)E用。舉例而言，一項(xiàng)研究報(bào)道使用解淀粉芽孢桿菌作為以環(huán)境友好的替代方案為特征的微生物生物控制劑(MBCA)，以減少或替代植物疾病的化學(xué)控制。參見(jiàn)，例如Correa等，Bacillusamyloliquefaciens BNM122，a potentialmicrobial biocontrol agent appliedon soybean seeds,causes a minor impact onrhizosphere and soil microbialcommunities, Applied Soil Ecology 41，185-194 (2009)(通過(guò)提述以其整體并入本文)。在此解淀粉芽孢桿菌的菌株當(dāng)作為種子上的覆層以控制土壤傳播的真菌病原體等時(shí)，顯示為定殖于種子和根。解淀粉芽孢桿菌的菌株MIR-41亦已描述為α -淀粉酶超生產(chǎn)者(hyperproducer)。該菌株已與其他微生物組合用于從淀粉底物產(chǎn)生乙醇。參見(jiàn)，例如 Abate 等,Production of amylolytic enzymes by Bacillus amyloliquefaciensinpure culture and in co-culture with Zymomonas mobilis, Biotechnology Letters21，249-252 (1999)(通過(guò)提述并入本文)。感興趣的現(xiàn)有技術(shù)包括美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，960，342，其涉及的解淀粉芽孢桿菌呈現(xiàn)廣譜抗真菌活性。該公開(kāi)亦涉及使用解淀粉芽孢桿菌菌株或包含該新穎菌株的抗真菌組合物以供控制廣泛范圍的真菌植物病原體。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，589，524涉及含有芽孢桿菌屬特定菌株的生物控制組合物和方法，所述菌株選自下組蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)NRRL B-30517和NRRL B-30519，解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)NRRL B-30518 以及枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)NRRL B-30520。在此，所述特定菌株在組合中提供了針對(duì)病原性真菌的作用。所述病原性真菌包括多種疫霉屬(Phytoph thora)菌種如辣椒疫霉(P. capsici)。W0/2005/059112涉及解淀粉芽孢桿菌KTGB0202，和使用其控制植物病原體的方法。該菌株具有針對(duì)作物白粉病(powdery mildew)的控制作用和針對(duì)植物病原性真菌的廣譜抗真菌活性，并抑制煙草花葉病毒感染，以及含有該細(xì)菌、用于控制白粉病的生態(tài)友好的細(xì)菌培養(yǎng)液。感興趣的現(xiàn)有技術(shù)還包括美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2/511，499，12/503, 272和12/492，816 (所有這些均通過(guò)提述以其整體并入本文)，其分別涉及解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50154, NRRL B-50151和NRRL B-50141，以及這些菌株的組合物和用途。解淀粉芽孢桿菌菌株SB3200包括在由Novozymes出售的、用于清潔和氣味控制應(yīng)用的產(chǎn)品中，其中酶幫助去除導(dǎo)致無(wú)機(jī)污物粘著并產(chǎn)生惡臭的有機(jī)污物，以及用于排水管線/油脂捕獲(grease trap)應(yīng)用的產(chǎn)品中，其中菌株幫助降解導(dǎo)致造成阻塞的排水管線積聚物的有機(jī)物和油脂。

持續(xù)地需要鑒定出作為適于工業(yè)用途的酶的優(yōu)異生產(chǎn)者和分泌者的菌株。此外，持續(xù)地需要鑒定出產(chǎn)生/分泌多種有用的酶和/或具有抗真菌應(yīng)用的新菌株。期望鑒定出一個(gè)菌株，其可產(chǎn)生優(yōu)異的淀粉酶、表面活性劑和淀粉酶活性。需要鑒定出新菌株以解決用于改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、洗滌劑工業(yè)、生物乙醇工業(yè)和烘烤工業(yè)領(lǐng)域中的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的持續(xù)的產(chǎn)業(yè)需求。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)已鑒定并分離出新菌株，即解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350。該菌株表征為芽孢桿菌屬細(xì)菌的菌株，其產(chǎn)生具有優(yōu)異淀粉酶、表面活性劑和抗真菌活性的酶。此外，本公開(kāi)的解淀粉芽孢桿菌菌株具有脂肪酶活性，噬菌體抗性，并耐受極端pH、鹽和極端溫度。本公開(kāi)的解淀粉芽孢桿菌菌株及其產(chǎn)生的酶可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、洗滌劑工業(yè)、生物乙醇工業(yè)和烘烤工業(yè)領(lǐng)域中如下所示的多種用途。更具體而言，本公開(kāi)涉及解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350的生物學(xué)純培養(yǎng)物(biologically pure culture)。解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350是解淀粉芽孢桿菌的細(xì)菌噬菌體抗性(噬菌體抗性)菌株。為了繁殖解淀粉芽孢桿菌菌株NRRLB-50350至大到足以允許該菌株廣泛應(yīng)用的數(shù)目，需要反復(fù)的、大規(guī)模發(fā)酵。已知天然細(xì)菌噬菌體的自然導(dǎo)入可在標(biāo)準(zhǔn)大規(guī)模發(fā)酵系統(tǒng)中在反復(fù)的生長(zhǎng)事件或批次中發(fā)生。此種感染可在幾小時(shí)或幾日之內(nèi)迅速導(dǎo)致培養(yǎng)物的完全喪失，抵消了提供該菌株以供實(shí)際施用的能力。解淀粉芽孢桿菌菌株NRRLB-50350對(duì)此種噬菌體具有抗性，并因此保持生長(zhǎng)并實(shí)現(xiàn)本文中所述的益處。解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350能夠產(chǎn)生淀粉酶，其催化排液殘余物(drainresidues)的主要化學(xué)組分如淀粉的降解。
本公開(kāi)還涉及在水性溶液例如蒸餾水、自來(lái)水、鹽溶液或其他水性溶液中包含解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350的液體組合物。本公開(kāi)還涉及增強(qiáng)植物根發(fā)育和植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基的生物增進(jìn)的配制物。 本公開(kāi)亦涉及包含解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350的排液清潔劑(drainopener)配制物。本公開(kāi)亦涉及通過(guò)將真菌與解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350相接觸以殺滅真菌的方法。本公開(kāi)亦涉及包含解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350的殺滅真菌的液體配制物。本公開(kāi)亦涉及處理植物種子的方法，其包括將種子與有效量的解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350相接觸。本公開(kāi)亦涉及處理植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基的方法，其包括將生長(zhǎng)培養(yǎng)基與有效量的解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350相接觸。 本公開(kāi)亦涉及殺滅真菌的方法，其包括將真菌與有效量的解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350 相接觸。本公開(kāi)亦涉及降解淀粉的方法，其包括將淀粉與有效量的解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350 相接觸。本公開(kāi)亦涉及改變烘烤成分的方法，其包括將烘烤成分與有效量的解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350相接觸。本公開(kāi)亦涉及降解脂質(zhì)的方法，其包括將脂質(zhì)與有效量的解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350 相接觸。本公開(kāi)亦涉及處理廢水的方法，其包括將解淀粉芽孢桿菌菌株NRRLB-50350添加至廢水的步驟。本公開(kāi)亦涉及清潔表面的方法，其包括將表面與解淀粉芽孢桿菌菌株NRRLB-50350相接觸的步驟。本公開(kāi)亦涉及包含解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350的組合物。合適的組合物包含一種或多種其他微生物。在實(shí)施方案中，合適的組合物包含一種或多種表面活性劑，和/或一種或多種酶。合適的酶的非限定性的實(shí)例包括一種或多種α-淀粉酶、纖維素酶、月旨肪酶、甘露聚糖酶、果膠酸裂合酶、過(guò)氧化物酶/氧化酶和蛋白酶，或其混合物。在實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包含一種或多種選自下組的成分分散劑、穩(wěn)定劑、抗微生物劑、香料、染料和殺生物劑。在組合物實(shí)施方案中解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL Β-50350以約IxlO5至IxlOici每ml的濃度存在。如用于本文中術(shù)語(yǔ)“有效量”指能夠提供有益作用或防止、減輕或消除不希望的狀況的量。有益作用的非限定性實(shí)例包括改善的植物種子品質(zhì)，改善的植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基品質(zhì)，對(duì)于真菌群體的殺生物作用，對(duì)于真菌群體的抑生物作用，淀粉降解，烘烤成分改變，脂質(zhì)降解，改善的廢水品質(zhì)，改善的表面清潔度，和/或減少的惡臭，及其組合。如用于本文中，詞語(yǔ)“處理”(“treat, ” “treating”或“treatment”)指使用本公開(kāi)的菌株或組合物預(yù)防性地防止一種或多種不希望的狀況的發(fā)作，或治療性地減輕一種或多種存在的不希望的狀況。依照本公開(kāi)的處理方案改善植物種子品質(zhì)，改善植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基品質(zhì)，減少和/或消除不希望的真菌，并改善表面的清潔度。
本公開(kāi)的這些和其他方面當(dāng)參考下述詳細(xì)描述時(shí)會(huì)是明顯的。


圖1是顯示隨時(shí)間淀粉酶比活性的圖。圖2是顯示隨時(shí)間淀粉酶比活性的圖。圖3是顯示隨時(shí)間蛋白酶比活性的圖。圖4是顯示隨時(shí)間脂肪酶比活性的圖。圖5是比較解淀粉芽孢桿菌的兩個(gè)菌株的生物表面活性劑產(chǎn)生的圖。圖6是比較解淀粉芽孢桿菌的兩個(gè)菌株之間生物表面活性劑產(chǎn)生的圖。圖7是比較解淀粉芽孢桿菌的兩個(gè)菌株之間表面張力對(duì)稀釋系數(shù)的圖。優(yōu)選實(shí)施方案的詳述本公開(kāi)涉及解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350。該菌株表征為具有優(yōu)異淀粉酶、表面活性劑和/或抗真菌活性的芽孢桿菌屬細(xì)菌。此外，本公開(kāi)的菌株產(chǎn)生多種有用的酶，并具有脂肪酶活性，噬菌體抗性和對(duì)鹽(例如，高至7. 5%氯化鈉)和溫度(例如，高至50°C)的高耐受性。本公開(kāi)的解淀粉芽孢桿菌菌株及其產(chǎn)生的酶在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、洗滌劑工業(yè)、生物乙醇工業(yè)和烘烤工業(yè)領(lǐng)域中具有多種應(yīng)用。 在實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350的生物純培養(yǎng)物。在實(shí)施方案中，本公開(kāi)的解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350適用于多種組合物和方法。合適的本公開(kāi)的組合物的非限定性實(shí)例包括任何含有解淀粉芽孢桿菌菌株NRRLB-50350的組合物；含有解淀粉芽孢桿菌菌株NRRLB-50350的水性溶液，含有解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350和一種或多種其他微生物的組合物；含有解淀粉芽孢桿菌菌株NRRLB-50350和表面活性劑的組合物；含有解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350和一種或多種酶的組合物。適于依照本公開(kāi)使用的非限定酶包括α-淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果膠酸裂合酶、過(guò)氧化物酶/氧化酶和蛋白酶，或其混合物。組合物的其他非限定性實(shí)例包括解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL Β-50350和一種或多種分散劑、穩(wěn)定劑、抗微生物劑、香料、染料和殺生物劑。在實(shí)施方案中，依照本公開(kāi)的組合物為含有水溶劑的液體形式?？紤]到本公開(kāi)的組合物具有以約IxlO5至IxIOki每ml的濃度存在的解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350。依照本公開(kāi)的合適的組合物的其他非限定性實(shí)例包括排水管清潔劑配制物，衛(wèi)生消毒劑配制物，或氣味去除組合物。在實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及在水性介質(zhì)中包含解淀粉芽孢桿菌菌株NRRLB-50350的排水管清潔劑配制物。合適的排水管清潔劑配制物的非限定性實(shí)例可進(jìn)一步包含表面活性劑和/或防腐劑。本公開(kāi)的排水管清潔實(shí)施方案相對(duì)于目前可獲得的排水管清潔劑具有許多優(yōu)點(diǎn)如在接近中性的PH的活性，和對(duì)皂類(lèi)、脂肪、油和油脂的溶解能力。實(shí)施方案進(jìn)一步提供了對(duì)糖類(lèi)具特異性的生物活性，并在排水管中和下游表面上形成生物膜以持續(xù)協(xié)助天然的生物降解過(guò)程。在實(shí)施方案中，所述排水管清潔劑配制物在水性介質(zhì)中含有活微生物，表面活性齊U，防腐劑，和任選的香料的穩(wěn)定懸液，具有大約5至6的優(yōu)選pH。
對(duì)于微生物可操作的濃度范圍是約Ix IO6至Ix 109CFU/ml，且在實(shí)施方案中，約Ix 108CFU/ml的濃度，如約Ix 107CFU/ml配制物。不像通常的洗滌劑主要僅清潔表面，本公開(kāi)的配制物實(shí)施方案中的表面活性劑可溶解油脂，并使其為生物可用的。所述表面活性劑可為任何容易生物可降解的表面活性劑，或?qū)ο到y(tǒng)中含有的微生物具有低毒性的表面活性劑的混合物。所述表面活性劑應(yīng)具有高油脂溶解能力。具有接近10的親水/親脂平衡的非離子/離子表面活性劑的混合物或離子表面活性劑對(duì)于必需的油脂溶解是特別優(yōu)選的。適用于本公開(kāi)的表面活性劑的非限定性實(shí)例包括正烷基苯磺酸鹽/酯和烷基磺酸鹽/酯。非離子表面活性劑的非限定性實(shí)例包括脂族醇燒氧化物，醇乙氧化物，聚烯氧化物共聚物(polyalkylene oxide copolymers),燒基酚烷氧化物，羧酸酯，羧酸酰胺，等等。在實(shí)施方案中，表面活性劑以總組合物或配制物的約3至10重量百分比的濃度存在。在排水管清潔劑配制物實(shí)施方案中，溶液的pH應(yīng)維持在盡可能接近中性，以確保充足的細(xì)菌活性，并最小化健康風(fēng)險(xiǎn)，但應(yīng)在與表面活性劑活性相容并有助于細(xì)菌存活的范圍?？刹僮鞯腜H范圍可為約3至10。在排水管清潔劑配制物實(shí)施方案中，添加防腐劑如對(duì)羥基苯甲酸酯(paraben)，對(duì)輕基苯甲酸甲酷(methyl paraben),或1，2_苯并異喔唑琳_3_麗(l-2-benzisothiazolin-3-one)以抑制或防止產(chǎn)品中不希望的微生物污染物的生長(zhǎng)。當(dāng)pH接近中性時(shí)，對(duì)防腐劑的需求最大，而當(dāng)pH在可操作范圍的極端時(shí)，需求最小。防腐劑的濃度根據(jù)出售者的推薦確定。用于實(shí)施例中的防腐劑的通常的濃度范圍是總組合物或配制物的約O. 075至O. 75重量百分比?？商貏e添加其他任選的防腐劑以保存微生物的孢子/芽孢形式。在實(shí)施方案中，按照重量計(jì)為約25至50ppm(w/v)的濃度的鄰氨基苯甲酸甲酯是令人滿意的添加劑。

在排水管清潔劑配制物實(shí)施方案中，任選地，添加螯合劑以增強(qiáng)配制物的穩(wěn)定化。在排水管清潔劑配制物實(shí)施方案中，可任選地添加香料以遮掩產(chǎn)物組分的氣味，以及用于市場(chǎng)吸引力。該香料必須與配制物的其他組分相容。在實(shí)施方案中，本公開(kāi)亦涉及包含解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350的衛(wèi)生消毒劑配制物。所述配制物包含衛(wèi)生消毒組合物，細(xì)菌芽孢，和表面活性劑均包含于水性溶液中的懸液。這些配制物具有下述優(yōu)點(diǎn)其為良好的表面清潔劑和良好的衛(wèi)生消毒劑，并提供有益細(xì)菌的長(zhǎng)效作用，即控制病原體，并在表面上和接受表面漂洗的污泥(sewage)系統(tǒng)中降解廢物。衛(wèi)生消毒劑或組合物以及消毒劑屬于同類(lèi)的抗微生物(活性)成分?？刮⑸?活性)成分為殺滅微生物或者防止或抑制其生長(zhǎng)和繁殖的化合物，并有助于包含其的產(chǎn)品中要求保護(hù)的作用。更具體而言，衛(wèi)生消毒劑是將微生物污染物或病原體的數(shù)目減少至根據(jù)公共衛(wèi)生要求判斷的安全水平的作用劑。在衛(wèi)生消毒劑實(shí)施方案中，表面活性劑組分起到通過(guò)去除污物、灰塵、干燥的尿液和皂而清潔表面的作用，并幫助對(duì)表面進(jìn)行衛(wèi)生消毒。衛(wèi)生消毒組合物對(duì)表面進(jìn)行衛(wèi)生消毒(殺滅病原體)，并維持配制物不受不希望的微生物的污染。細(xì)菌芽孢和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞起到接種廢物收集系統(tǒng)、控制氣味并提供健康的優(yōu)勢(shì)微生物群體的作用，所述群體通過(guò)底物競(jìng)爭(zhēng)、產(chǎn)生抗生素等抑制病原體的生長(zhǎng)。
在本公開(kāi)的一個(gè)衛(wèi)生消毒劑實(shí)施方案中，所述組合物以選擇范圍的濃度包含1，2-苯并異噻唑啉-3-酮(Proxel)，乙二胺四乙酸四鈉(EDTA)和異丙醇(IPA)，其與配方的其他成分組合能夠有效地使指標(biāo)生物失活。該衛(wèi)生消毒組合物優(yōu)選處于中性PH且不含有通常用作衛(wèi)生消毒劑的與氯相關(guān)的物質(zhì)。因此，該衛(wèi)生消毒組合物對(duì)環(huán)境更加友好，并具有較少或不具腐蝕性。在實(shí)施方案中，當(dāng)將衛(wèi)生消毒配制物施于浴室附屬裝置(bathroomfixture),水池，便盆等時(shí)，可將其噴灑或從容器直接擠出至表面或刷具上。然后將該配制物留在表面上，或用刷具洗刷表面不少于10分鐘。然后用水沖洗或漂洗該產(chǎn)品，并從裝置卸除。在實(shí)施方案中，本公開(kāi)的衛(wèi)生消毒配制物含有衛(wèi)生消毒劑、細(xì)菌芽孢和表面活性齊U。亦分別添加香料和染料以控制配制物的氣味和顏色。取決于意欲的用途，所述配制物可任選地含有磨蝕劑(abrasive)。盡管關(guān)鍵組分保持相同，可在含和不含磨蝕劑的配制物中使用不同的增稠劑。盡管許多衛(wèi)生消毒劑可用于使表面上的病原體失活，但并非所有這些均可用于本公開(kāi)的實(shí)施方案。這是因?yàn)橛糜诒竟_(kāi)的衛(wèi)生消毒劑不僅需要有效地使病原體失活，但必須不對(duì)配制物中含有的細(xì)菌芽孢的活性和穩(wěn)定性具有負(fù)面作用。此外，所述衛(wèi)生消毒劑需要對(duì)于環(huán)境較為友好，且不應(yīng)導(dǎo)致皮膚致敏(sensitization)，且不應(yīng)腐蝕其使用的裝置的構(gòu)建材料。在實(shí)施方案中，本公開(kāi)的衛(wèi)生消毒組合物以選定的濃度范圍包含Proxel，EDTA和IPA。Proxel不太會(huì)導(dǎo)致皮膚致敏的最大濃度是約2900mg/L。用于在10分鐘內(nèi)產(chǎn)生指標(biāo)生物計(jì)數(shù)的41og減少的Proxel, Versene (Versene含有3996EDTA)和IPA的合適濃度分別是O. 087至O. 29% (體積)，O. 36至1. 19% (體積)，和3. 5至7%(體積)。亦可將另一種化合物，鄰氨基苯甲酸甲酯用于本發(fā)明的配制物中。使用鄰氨基苯甲酸甲酯的目的是幫助配制物的防腐。在實(shí)施方案中，亦可將衛(wèi)生消毒劑如季銨化合物(QAC)，含氮有機(jī)硫和硫-氮化合物用于本公開(kāi)的衛(wèi)生消毒組 合物。在衛(wèi)生消毒實(shí)施方案中，對(duì)于微生物可操作的濃度范圍是Ix IO5至lxl09CFU/ml，如107CFU/ml (CFU，菌落形成單位)配制物。在實(shí)施方案中，在本公開(kāi)的衛(wèi)生消毒配制物中含有表面活性劑。所述表面活性劑可潤(rùn)濕和乳化存在于臟表面上的污物，包括臟污(dirt)、干燥的尿液、皂等等。此外，表面活性劑幫助表面的衛(wèi)生消毒。不像通常用于表面清潔的表面活性劑，用于本公開(kāi)的表面活性劑對(duì)配制物內(nèi)含有的微生物具有低毒性。在實(shí)施方案中，可使用一種表面活性劑或幾種表面活性劑的混合物。適用于衛(wèi)生消毒劑實(shí)施方案的表面活性劑的非限定性實(shí)例包括非離子表面活性齊U，因?yàn)槠涮峁┢谕臐?rùn)濕和乳化作用，而不顯著地抑制芽孢的穩(wěn)定性和活性。非離子表面活性劑是當(dāng)溶解或分散于水性介質(zhì)中時(shí)不具有電荷的表面活性劑。非離子表面活性劑的非限定性實(shí)例包括脂族醇烷氧化物，醇乙氧化物，聚烯氧化物共聚物，烷基酚烷氧化物，羧酸酯，羧酸酰胺，等等。陰離子表面活性劑或陰離子和非離子表面活性劑的混合物亦可用于本公開(kāi)的配制物。陰離子表面活性劑是在水溶液中具有處于陰離子或負(fù)電荷狀態(tài)的親水模塊的表面活性劑。適于本文中使用的陰離子表面活性劑的非限定性實(shí)例包括磺酸，硫酸酯，羧酸，及其鹽。在實(shí)施方案中，本公開(kāi)的組合物包括磨蝕劑，其為不溶于水的固體顆粒。使用磨蝕劑的目的是提供深度洗刷和清潔。取決于應(yīng)用，磨蝕劑可任選地用于本公開(kāi)的配制物。合適的磨蝕劑的非限定性實(shí)例包括碳酸鈣，碳酸鎂，二氧化硅等。在實(shí)施方案中，磨蝕劑可以80至325篩目的篩目尺寸存在(ASTM E 11-70(1995)。因?yàn)榧?xì)菌芽孢的比重通常高于水，在本公開(kāi)中需使用增稠劑以懸浮芽孢。合適的水性增稠劑的非限定性實(shí)例包括聚丙烯酸，聚苯乙烯，聚乙烯醇，聚丙烯等等。在實(shí)施方案中，用于懸浮細(xì)菌芽孢的增稠劑是聚丙烯酸(例如來(lái)自Rohm and Haas Co.的AcrysolTT615)。如果在配制物中使用磨蝕劑，可需要除了聚丙烯酸之外的增稠劑以維持磨蝕劑的懸浮。在實(shí)施方案中，可任選地分別添加香料和染料以掩蔽產(chǎn)品成分的氣味和控制產(chǎn)品組分的顏色，以及用于市場(chǎng)吸引力。所述香料和染料必須與配制物的其他組分相容。在實(shí)施方案中，本公開(kāi)亦涉及在水溶液中包含解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350的組合物。在實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)水溶液以提供短期和長(zhǎng)期氣味控制作用，并對(duì)環(huán)境友好，使用經(jīng)濟(jì)。在實(shí)施方案中，對(duì)于解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350可操作的濃度范圍是約Ix IO5至Ix 10lclCFU/ml，例如約Ix IO6至Ix 108CFU/ml。在實(shí)施方案中，對(duì)于解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350可操作的濃度范圍是約Ix 108CFU/ml配制物的量，或在實(shí)施方案中約Ix 107CFU/ml配制物。
在實(shí)施方案中，本公開(kāi)的除臭組合物可包含氣味中和劑，其為可與有氣味化合物迅速通過(guò)化學(xué)反應(yīng)相互作用以產(chǎn)生無(wú)氣味化合物的作用劑。這些作用劑不應(yīng)依賴香料的遮掩機(jī)制來(lái)控制氣味。此外，這些作用劑必須對(duì)于使用是安全的，且為合算的。所述中和劑必須與微生物組分相容。在本公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方案中，所述中和劑是碳酸丙酯，其具有分子式C4H603。適于依照本公開(kāi)使用的碳酸丙酯可從商業(yè)賣(mài)家如Huntsman ChemicalCorporation獲得。與組合物的其他組分組合，碳酸丙酯可有效地減少氣味，包括胺和氨氣味如三甲胺、二甲胺和氨，其為主要的目標(biāo)臭味化合物(target odorouscompound)。此外，即使在長(zhǎng)期接觸之后，碳酸丙酯并不使微生物組分失活。其他氣味中和化合物，如檸檬酸鈉，碳酸氫鈉和碳酸鈉，亦可用于本公開(kāi)的實(shí)施方案。在實(shí)施方案中，所述氣味中和劑或化合物以總組合物l_15wt. %，如2-lOwt. %的
量存在。在本公開(kāi)的組合物中，其他微生物組分適于在其中使用。能夠在普通家用、工業(yè)、寵物和動(dòng)物廢物上生長(zhǎng)并且降解這些，能夠在配制物中生存，并與配制物相容，且當(dāng)起作用時(shí)不產(chǎn)生惡臭的活微生物，或其混合物，可用于本公開(kāi)的實(shí)施方案?？捎糜诒竟_(kāi)的組合物的其他微生物的非限定性實(shí)例包括已知產(chǎn)生能夠分解可在地毯或其他纖維材料上導(dǎo)致氣味的有機(jī)材料的酶的產(chǎn)堿菌屬(Alcaligens)，芽孢桿菌屬(Bacillus),腸桿菌屬(Enterobacter),克雷伯氏菌屬(Klebsiella),乳桿菌屬(Lactobacillus),硝化桿菌屬(Nitrobacter),亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),假單胞菌屬(Pseudomonas)和鏈球菌屬(Streptococcus)的菌株。其他成分可用于本公開(kāi)的組合物，包括表面活性劑、香料和染料。在組合物實(shí)施方案中，表面活性劑可潤(rùn)濕并乳化經(jīng)處理的系統(tǒng)中存在的不溶性廢物材料，且在本公開(kāi)的組合物中納入表面活性劑會(huì)增加其清潔能力。此外，表面活性劑可用于分解不溶性廢物，因此增加它們對(duì)于微生物降解的可利用性。本公開(kāi)的合適的表面活性劑包括非離子型和陰離子型。在實(shí)施方案中，表面活性劑以組合物的0-8wt. %，如0-6wt. %的量存在。在實(shí)施方案中，可任選地分別添加香料和染料以遮掩本公開(kāi)的組合物的氣味，并控制其顏色，并用于市場(chǎng)吸引力。所述香料和染料必須與植物的其他成分相容。已發(fā)現(xiàn)本公開(kāi)的菌株具有非常強(qiáng)的表面活性劑活性。此外，本公開(kāi)的菌株適用于控制病原性真菌。病原性真菌的一個(gè)非限定性實(shí)例是產(chǎn)生已知導(dǎo)致粹倒病(damping offdisease)的卵孢子(ooze spore)的真菌。在實(shí)施方案中，卵孢子對(duì)表面活性劑，包括本公開(kāi)的菌株產(chǎn)生的表面活性劑敏感。將卵孢子與本公開(kāi)的菌株和/或表面活性劑相接觸對(duì)于已知產(chǎn)生卵孢子的真菌具有殺生物或抑生物作用。在實(shí)施方案中，本公開(kāi)的菌株針對(duì)腐霉屬菌種(Pythium spp.)具有優(yōu)異的抗真菌活性。在實(shí)施方案中，將解淀粉芽孢桿菌菌株NRRLB-50350和含有該菌株的組合物與需處理的種子和/或具有不希望的真菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)基相接觸。解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350對(duì)真菌具有殺生物作用，并減輕不希望的真菌狀況。相應(yīng)地，所述種子和/或植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基受改變，并更適于在其中生長(zhǎng)植物。在實(shí)施方案中，依照本公開(kāi)的方法適于殺滅稱(chēng)作腐霉屬的寄生卵菌屬(genus of parasiticoomycete)。在本公開(kāi)的實(shí)施方案中，方法和組合物適用于洗滌劑領(lǐng)域。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本公開(kāi)的菌株包含非常高的淀粉酶、表面活性劑和抗真菌活性。舉例而言，本公開(kāi)的菌株產(chǎn)生優(yōu)異量的淀粉酶、表面活性劑，且針對(duì)腐霉屬菌種具有優(yōu)異的抗真菌活性。在實(shí)施方案中，將解淀粉芽孢桿菌菌株NRRLB-50350和含有該菌株的組合物與需要處理的沾污的底物相接觸。解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350分解其中的淀粉和淀粉污跡，并減輕不希望的不清潔狀況。相應(yīng)地，改變了底物如織物或表面，且其表觀更加清潔。在實(shí)施方案中，含有本公開(kāi)的解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350的菌株和組合物適用于多種方法應(yīng)用。合適的方法的非限定性實(shí)例包括處理植物種子，即將種子與有效量的本公開(kāi)的解淀粉芽孢桿菌菌株相接觸；處理植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基，即將生長(zhǎng)培養(yǎng)基與有效量的本公開(kāi)的解淀粉芽孢桿菌菌株相接觸；殺滅真菌，即將真菌與有效量的本公開(kāi)的解淀粉芽孢桿菌菌株相接觸；降解淀粉，即將脂肪與有效量的本公開(kāi)的解淀粉芽孢桿菌菌株相接觸；改變烘烤成分，即將烘烤成分與有效量的本公開(kāi)的解淀粉芽孢桿菌菌株相接觸；降解脂質(zhì)，即將脂質(zhì)與有效量的本公開(kāi)的解淀粉芽孢桿菌菌株相接觸；處理廢水，其包括向廢水添加本公開(kāi)的解淀粉芽孢桿菌菌株的步驟；和清潔表面，即將表面與有效量的本公開(kāi)的解淀粉芽孢桿菌菌株相接觸。用于依照本公開(kāi)清洗的合適表面的非限定性實(shí)例包括硬表面，優(yōu)選由一種或多種選自下組的材料組成金屬、塑料、橡膠、板(board)、玻璃、木材、紙、混凝土、巖石、大理石、石膏和陶瓷材料如瓷料；或軟表面，優(yōu)選由一種或多種選自纖維例如紗線(yarn)、織物、植物纖維的材料組成；石棉,毛發(fā)；皮膚；角質(zhì)材料；和內(nèi)臟例如肺；或有孔表面。在實(shí)施方案中，所述處理包括施用有效量的一種或多種菌株組合物。非限定性實(shí)例包括排水管清潔劑配制物，衛(wèi)生消毒配制物和氣味中和劑組合物。此類(lèi)處理可防止、減輕或消除不希望的狀況。有益作用的非限定性實(shí)例包括改善的植物種子品質(zhì)，改善的植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基品質(zhì)，對(duì)于真菌群體的殺生物作用，對(duì)于真菌群體的抑生物作用，淀粉降解，烘烤成分改變，脂質(zhì)降解，改善的廢水品質(zhì)，改善的表面清潔度，和/或減少的惡臭，及其組合。牛物材料的保藏解淀粉芽孢桿菌菌株根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2010年3月4日保藏于農(nóng)業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心/農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心(Agricultural Research ServiceCulture Collection), 1815North University Street, Peoria, Illinois61604, U. S. A.,保藏號(hào)為NRRL B-50350。該保藏在授予的專(zhuān)利的整個(gè)有效期內(nèi)應(yīng)在保藏機(jī)構(gòu)維持在活的條件，并可為任何個(gè)人或單位以非商業(yè)用途不受限制地獲得，但須符合管理該保藏物的法律的規(guī)定。

下述實(shí)施例作為本公開(kāi)的示例給出，但不意欲對(duì)其進(jìn)行限制。為使得本領(lǐng)域技術(shù)人員更加能夠?qū)崿F(xiàn)本文中所述的組合物和方法，下述實(shí)施例作為本組合物和方法的制備的說(shuō)明。應(yīng)注意本公開(kāi)并不限于實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)的具體細(xì)節(jié)。
實(shí)施例實(shí)施例1材料和方法解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B_50350(“菌株SB3778”)從研究實(shí)驗(yàn)室區(qū)域分離。進(jìn)行了研究，包括細(xì)菌鑒定研究；DNA指紋研究；生物表面活性劑活性研究；抗真菌活性研究；應(yīng)力耐受研究；蛋白酶活性研究；和對(duì)于淀粉酶的基因克隆。解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350的分離和鑒定從解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350分離株獲得1600堿基的全長(zhǎng)16sDNA，并分析序列。該分析將所述細(xì)菌分離株鑒定為解淀粉芽孢桿菌。解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350在SM平板上具有獨(dú)特的形態(tài)將解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350與解淀粉芽孢桿菌的已知菌株相比較。具體而言，比較了生長(zhǎng)和形態(tài)。解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350在SM培養(yǎng)基上與所有其他解淀粉芽孢桿菌菌株形態(tài)上不同。所有其他解淀粉芽孢桿菌菌株在SM瓊脂平板上產(chǎn)生表多糖(exopolysaccharide),而解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350則不然。解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350具有獨(dú)特的基因型將解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350與解淀粉芽孢桿菌的已知菌株通過(guò)DNA指紋分析相比較。結(jié)果表明解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350與解淀粉芽孢桿菌的已知菌株具有70%相似性。解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350與用于內(nèi)部(in house)纖維素酶產(chǎn)生的解淀粉芽孢桿菌的公知菌株相比產(chǎn)生更高淀粉酶活性
評(píng)價(jià)了解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350相對(duì)于已知為淀粉酶生產(chǎn)者的解淀粉芽孢桿菌的已知的菌株(即，DD3，具有保藏登錄號(hào)NRRL B-50154)的淀粉酶活性。淀粉酶活性使用BAN用Konelab KNU-B分析確定。在該方法中，α -淀粉酶(l，4_a -D-葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2.1.1)通過(guò)切割1，4-α -糖苷鍵催化聚合糖類(lèi)如直鏈淀粉、支鏈淀粉和糖原的水解降解。在多糖和寡糖中，多個(gè)糖苷鍵同時(shí)水解。麥芽三糖，最小的這種單位，轉(zhuǎn)化為麥芽糖和葡萄糖，盡管非常緩慢。這里描述的動(dòng)力學(xué)方法是基于公知的α-淀粉酶對(duì)4，6-亞乙基-(G7)-1, 4-硝基苯基-(Gl) - a -D-麥芽七糖苷的切割，以及所有降解產(chǎn)物在α -葡糖苷酶的協(xié)助下隨后水解為對(duì)硝基苯酚。這導(dǎo)致生色團(tuán)的100%釋放。該過(guò)程在Konelab Arena 30中自動(dòng)進(jìn)行，具有下述步驟1)將200微升Rl試劑移液入小杯，2)將16微升樣品添加至小杯，3)將混合物溫育300秒以獲得37°C的溫度，4)將20微升R2試劑移液入小杯，并將混合物溫育180秒，和5)在405nm每18秒測(cè)量吸收，對(duì)于每個(gè)樣品進(jìn)行總共7次測(cè)量。限定的寡糖在α -淀粉酶的催化作用下受切割。所得的PNP衍生物通過(guò)α _葡糖苷酶的作用直接切割為ΡΝΡ，且形成的對(duì)硝基苯酚的色強(qiáng)度與α -淀粉酶活性成正比，并通過(guò)分光光度法測(cè)量。5 亞乙基 _G7PNP+H20 — . 2 亞乙基 _G5+2G2PNP+2 亞乙基 _G4+2G3PNP+ 亞乙
基-g3+g4pnp(i)2G2PNP+2G3PNP+G4PNP+14H20 — 5PNP+14G (2)反應(yīng)⑴由從標(biāo)樣或樣品添加的淀粉酶介導(dǎo)。反應(yīng)(2)由試劑盒中提供的葡糖苷酶介導(dǎo)。結(jié)果證明來(lái)自解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350的淀粉酶活性比已知的菌株，SPDD3 (菌株NRRL B-50154)高至至少5倍。酶分析對(duì)于每個(gè)菌株，將單菌落接種入IOmL PCB培養(yǎng)基并放置過(guò)夜。將每個(gè)菌株大約IxlO4個(gè)細(xì)胞接種入IOOmL淀粉培養(yǎng)基。在下圖中指明的每個(gè)時(shí)點(diǎn)取得O. D.讀數(shù)。對(duì)于每個(gè)時(shí)點(diǎn)的每個(gè)菌株，將2mL的不含細(xì)胞的上清材料與ImL 50%甘油合并，并儲(chǔ)藏于-20°C。對(duì)于所有樣品的酶活性如前所述使用BAN通過(guò)Konelab KNU-B分析確定。進(jìn)行該步驟的重復(fù)以供結(jié)果確認(rèn)?，F(xiàn)參見(jiàn)圖1，該研究在當(dāng)amyl (菌株NRRL B-50350)與DD3 (菌株NRRLB-50154)相比較時(shí)在淀粉酶產(chǎn)生方面得到了大約五倍增加。第二次試驗(yàn)在當(dāng)amyl (菌株NRRL B-50350)與DD3(菌株NRRL B-50154)相比較時(shí)在淀粉酶產(chǎn)生方面得到了四倍增加。這些結(jié)果示于表2。在兩個(gè)研究中，菌株NRRL B-50350在淀粉酶產(chǎn)生中均持續(xù)地表現(xiàn)優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)菌株，并對(duì)于菌株NRRL B-50350具有約800KN的最大淀粉酶產(chǎn)生。定義的單位BAN是可從Novozymes獲得的α -淀粉酶。其分析標(biāo)準(zhǔn)以360KNU (B)/g=360NU (B) /mg提供。解淀粉芽孢桿菌菌株NRRL B-50350具有蛋白酶和脂肪酶活性蛋白酶測(cè)定根據(jù)對(duì)于上述淀粉酶測(cè)定所述的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)定。如下所述進(jìn)行Konelab 分析
權(quán)利要求
1.一種解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株NRRL B-50350的生物學(xué)純培養(yǎng)物。
2.一種殺滅真菌的方法，其包括將真菌與有效量的權(quán)利要求1的解淀粉芽孢桿菌菌株相接觸。
3.一種組合物，其包含權(quán)利要求1的解淀粉芽孢桿菌菌株。
4.一種依照權(quán)利要求3的組合物，進(jìn)一步包含一種或多種其他微生物。
5.權(quán)利要求3的組合物，其進(jìn)一步包含表面活性劑。
6.權(quán)利要求5的組合物，其進(jìn)一步包含一種或多種酶。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述酶選自下組α-淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果膠酸裂合酶、過(guò)氧化物酶/氧化酶和蛋白酶，或其混合物。
8.權(quán)利要求3的組合物，其進(jìn)一步包含一種或多種選自下組的成分分散劑、穩(wěn)定劑、抗微生物劑、香料、染料和殺生物劑。
9.權(quán)利要求3的組合物，其中解淀粉芽孢桿菌菌株NRRLΒ-50350以約IxlO5至IxIOki每ml的濃度存在。
全文摘要
本公開(kāi)涉及解淀粉芽孢桿菌的菌株，其超產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶。該菌株亦適于產(chǎn)生脂肪酶以供降解油狀材料如脂肪、油脂和烹調(diào)用油。該菌株亦具有優(yōu)異的殺真菌和抑真菌品質(zhì)。本公開(kāi)的菌株及其產(chǎn)生的酶由此具有多種用途，包括農(nóng)業(yè)用途，洗衣和洗碟劑，排水管清潔劑和污跡去除劑，以及烘烤用途等。
文檔編號(hào)C12N1/00GK103038334SQ201180022493
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2011年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月4日
發(fā)明者康耀衛(wèi), S.塞蒙斯, J.史密斯, M.弗洛迪馬 申請(qǐng)人:諾維信生物股份有限公司