專利名稱：核酸酶P1作為芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)催化劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶的新應(yīng)用，特別涉及核酸酶Pl作為芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱 Aldol反應(yīng)催化劑的應(yīng)用，還涉及應(yīng)用所述核酸酶Pl催化芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱 Aldol反應(yīng)的方法。
背景技術(shù)：
生物催化劑因具有選擇性高、反應(yīng)條件溫和、易于再生等優(yōu)點(diǎn)而在不對(duì)稱合成、環(huán) 境友好和可持續(xù)性方面優(yōu)于現(xiàn)有的化學(xué)催化劑。但其同時(shí)也存在缺陷，例如目前只發(fā)現(xiàn)了 有限數(shù)量的酶，且每種酶只催化特定的底物。因此，充分挖掘現(xiàn)有酶的非天然催化活性以擴(kuò) 大酶的應(yīng)用范圍，對(duì)現(xiàn)代工業(yè)發(fā)展具有重要意義。C-C鍵的立體選擇性形成是有機(jī)合成的重要方面。直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)是最有 效的不對(duì)稱合成方法之一。目前關(guān)于有機(jī)小分子催化直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的報(bào)道較多， 但除了醛縮酶對(duì)直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)具有天然催化活性以外，關(guān)于其它酶催化直接不對(duì) 稱Aldol反應(yīng)的報(bào)道極少。2003年C. Brarmeby等報(bào)道了用突變的脂肪酶(lipase from Candida antarctica)催化直接Aldol反應(yīng)。2008年C. Li等也報(bào)道了用脂肪酶催化直接 Aldol反應(yīng)。但是，這些酶催化的直接Aldol反應(yīng)多數(shù)沒(méi)有對(duì)映體選擇性，即使有對(duì)映體選 擇性也較差，對(duì)映體過(guò)量(enantiomeric excess, ee)值最高僅43. 6%。因此，迫切需要開 發(fā)一種能夠催化直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)且具有高對(duì)映選擇性的酶。核酸酶Pl (nuclease PI, EC 3. 1. 30. 1)是由桔青霉(Penicillium citrinum)產(chǎn) 生的一種能將單鏈DNA和RNA水解為5’ -核苷酸的磷酸二酯酶，也是酶法生產(chǎn)5'-核苷 酸的主要工業(yè)用酶。但用其催化直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于確認(rèn)核酸酶Pl是否能夠作為芳香醛和環(huán)狀酮 的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)催化劑應(yīng)用。為達(dá)到此目的，本發(fā)明選擇苯甲醛或取代苯甲醛與環(huán)戊酮、環(huán)己酮或環(huán)庚酮在核 酸酶Pl催化下進(jìn)行直接Aldol反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核酸酶Pl能夠催化苯甲醛或取代苯甲醛與 環(huán)戊酮、環(huán)己酮或環(huán)庚酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)并具有高對(duì)映選擇性，從而確認(rèn)了核酸 酶Pl能夠作為芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)催化劑應(yīng)用，尤其適用于作為苯甲 醛或取代苯甲醛與環(huán)戊酮、環(huán)己酮或環(huán)庚酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)催化劑應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明的目的之二在于建立應(yīng)用核酸酶Pl催化芳香醛和環(huán)狀酮的 直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的優(yōu)化方法。為達(dá)到此目的，本發(fā)明對(duì)核酸酶Pl催化芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng) 的反應(yīng)溶劑、底物投料比、酶用量、含水量、反應(yīng)溫度等進(jìn)行了系統(tǒng)研究，綜合考慮產(chǎn)率和ee 值，提出如下優(yōu)化技術(shù)方案
應(yīng)用核酸酶Pl催化芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的方法向反應(yīng)容器 中加入芳香醛、環(huán)狀酮、核酸酶Pl和水，控溫15 40°C攪拌反應(yīng)；環(huán)狀酮與芳香醛的摩爾 比為4 5 1 ；核酸酶Pl與芳香醛的用量比為1000 2000U Immol，水與核酸酶Pl的 質(zhì)量比為0. 15 0. 7 1。從獲得高ee值角度考慮，更佳的，反應(yīng)溫度為15°C ；更佳的，環(huán)狀酮與芳香醛的摩 爾比為5 1 ；更佳的，核酸酶Pl與芳香醛的用量比為1000U Immol ；更佳的，水與核酸酶 Pl的質(zhì)量比為0. 15 1。上述方法尤其適用于應(yīng)用核酸酶Pl催化苯甲醛或取代苯甲醛與環(huán)戊酮、環(huán)己酮 或環(huán)庚酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)核酸酶Pl能夠催化芳香醛和環(huán)狀核酸 酶Pl催化的芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)可在相對(duì)溫和及無(wú)溶劑條件下進(jìn)行， 具有經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景好。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn) 一步的詳細(xì)描述，其中圖1示出了底物投料比對(duì)核酸酶Pl催化的對(duì)氰基苯甲醛和環(huán)己酮的直接不對(duì)稱 Aldol反應(yīng)的影響。圖2示出了酶用量對(duì)核酸酶Pl催化的對(duì)氰基苯甲醛和環(huán)己酮的直接不對(duì)稱Aldol 反應(yīng)的影響。圖3示出了含水量對(duì)核酸酶Pl催化的對(duì)氰基苯甲醛和環(huán)己酮的直接不對(duì)稱Aldol 反應(yīng)的影響。圖4示出了反應(yīng)溫度對(duì)核酸酶Pl催化的對(duì)氰基苯甲醛和環(huán)己酮的直接不對(duì)稱 Aldol反應(yīng)的影響。
具體實(shí)施例方式下面將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中所使用的核酸酶Pl購(gòu)自南寧龐博生物工程有限公司，比活力為5U/ mg。優(yōu)選實(shí)施例中采用薄層色譜法(GF2M硅膠板)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，采用快速柱色譜法 (100 200目硅膠加壓柱，洗脫劑為乙醚-乙酸乙酯混合溶劑)純化粗產(chǎn)物，采用Bruker AV-300型核磁共振儀測(cè)定非對(duì)映異構(gòu)體的核磁共振氫譜(1HNMR),采用LC 2030型高效液 相色譜儀和AD-H、0D-H、AS-H或OJ-H手性柱測(cè)定對(duì)映異構(gòu)體的手性高效液相色譜圖。優(yōu)選 實(shí)施例中所給出的產(chǎn)率為經(jīng)快速柱色譜法純化后的產(chǎn)物收率；產(chǎn)物的相對(duì)構(gòu)型和絕對(duì)構(gòu)型 通過(guò)與已知化合物的屯NMR和手性高效液相色譜數(shù)據(jù)比較確定；d.r.值為順式產(chǎn)物與反式 產(chǎn)物的摩爾比，通過(guò)測(cè)定非對(duì)映異構(gòu)體的1H NMR獲得；主產(chǎn)物(反式產(chǎn)物)的ee值通過(guò)測(cè) 定對(duì)映異構(gòu)體的手性高效液相色譜測(cè)定。一、核酸酶Pl催化芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的條件優(yōu)化本發(fā)明以核酸酶Pl催化的對(duì)氰基苯甲醛和環(huán)己酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)作為 模型反應(yīng)，分別對(duì)反應(yīng)溶劑、底物投料比、酶用量、含水量、反應(yīng)溫度等進(jìn)行了系統(tǒng)考察和優(yōu)化。1、反應(yīng)溶劑的影響在反應(yīng)瓶中加入對(duì)氰基苯甲醛(1.5mm0l)和環(huán)己酮(IOmmol)，然后序號(hào)1 7加 入核酸酶Pl QOOmg)、水(0.75ml)和有機(jī)溶劑(5ml)；序號(hào)8加入核酸酶Pl QOOmg)；序號(hào)9 加入經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)于30°C預(yù)處理M小時(shí)使失去活性的核酸酶Pl(200mg)；序號(hào) 10不加入核酸酶Pl ；控溫20°C攪拌反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾，濾餅用二氯甲烷洗滌，合并濾 液和洗液，加水OOml)稀釋后，用二氯甲烷萃取3次(每次20ml)，合并二氯甲烷萃取液， 無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓蒸餾除去溶劑得粗產(chǎn)物，經(jīng)快速柱色譜法純化即得目標(biāo)產(chǎn) 物。結(jié)果見(jiàn)表1，反應(yīng)溶劑對(duì)核酸酶Pl催化的對(duì)氰基苯甲醛和環(huán)己酮的直接不對(duì)稱 Aldol反應(yīng)影響較大。以二甲亞砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑，反應(yīng)96小時(shí)的 產(chǎn)率為53 72%，d.r.(反式/順式)為64 36 72 28，ee (反式)為M 55% ； 以四氫呋喃(THF)、乙腈、環(huán)己烷、二氯甲烷或水為溶劑，反應(yīng)96小時(shí)的產(chǎn)率為18 觀％， d.r.(反式/順式)為42 58 79 21，ee (反式)為42 67% ；而在無(wú)溶劑條件下， 反應(yīng)96小時(shí)的產(chǎn)率為30%，d.r.(反式/順式)為85 15，ee (反式)為81 %。在無(wú)溶 劑條件下反應(yīng)ee值達(dá)到了所有溶劑中的最佳值。此外，在無(wú)溶劑條件下，用EDTA處理使核 酸酶Pl失活后的產(chǎn)率僅3%，不加酶反應(yīng)168小時(shí)沒(méi)有檢測(cè)到產(chǎn)物，說(shuō)明核酸酶Pl確實(shí)能 夠催化對(duì)氰基苯甲醛和環(huán)己酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)。因此，本發(fā)明優(yōu)選在無(wú)溶劑條件 下進(jìn)行反應(yīng)。表1反應(yīng)溶劑對(duì)核酸酶Pl催化的對(duì)氰基苯甲醛和環(huán)己酮的直接不對(duì)稱Aldol反
應(yīng)的影響
權(quán)利要求
1.核酸酶Pl作為芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)催化劑的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述核酸酶Pl的應(yīng)用，其特征在于所述芳香醛為苯甲醛或取代苯甲 醛，所述環(huán)狀酮為環(huán)戊酮、環(huán)己酮或環(huán)庚酮。
3.應(yīng)用核酸酶Pl催化芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的方法，其特征在于 向反應(yīng)容器中加入芳香醛、環(huán)狀酮、核酸酶Pl和水，控溫15 40°C攪拌反應(yīng)；環(huán)狀酮與芳 香醛的摩爾比為4 5 1，核酸酶Pl與芳香醛的用量比為1000 2000U lmmol，水與 核酸酶Pl的質(zhì)量比為0. 15 0.7 1。
4.如權(quán)利要求3所述應(yīng)用核酸酶Pl催化芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的 方法，其特征在于控溫15°C攪拌反應(yīng)。
5.如權(quán)利要求3所述應(yīng)用核酸酶Pl催化芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的 方法，其特征在于環(huán)狀酮與芳香醛的摩爾比為5 1。
6.如權(quán)利要求3所述應(yīng)用核酸酶Pl催化芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的 方法，其特征在于核酸酶Pl與芳香醛的用量比為1000U Immol0
7.如權(quán)利要求3所述應(yīng)用核酸酶Pl催化芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的 方法，其特征在于水與核酸酶Pl的質(zhì)量比為0.15 1。
8.如權(quán)利要求3至7任一項(xiàng)所述應(yīng)用核酸酶Pl催化芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱 Aldol反應(yīng)的方法，其特征在于所述芳香醛為苯甲醛或取代苯甲醛，所述環(huán)狀酮為環(huán)戊 酮、環(huán)己酮或環(huán)庚酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及酶的新應(yīng)用，特別涉及核酸酶P1作為芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)催化劑的應(yīng)用，還涉及應(yīng)用核酸酶P1催化芳香醛和環(huán)狀酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的方法，具有高對(duì)映選擇性、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等特點(diǎn)，應(yīng)用前景好。
文檔編號(hào)C12P13/00GK102115771SQ201010292100
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者何延紅, 官智, 李海虹 申請(qǐng)人:西南大學(xué)