專利名稱：多拷貝高效表達(dá)重組菌絲霉素的畢赤酵母的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及重組菌絲霉素基因多拷貝表達(dá)載體及其重組酵母的制備方法。
背景技術(shù)：
菌絲霉素(Plectasin)是Mygind等從真菌(腐生子囊菌，the saprophytic ascomycete Pseudoplectania nigre 11a)中分離得到首例防御素(Mygind et al.， Nature, 2005,437 :975 980)。其高級(jí)結(jié)構(gòu)包含一個(gè)α - β模型，由一個(gè)α -螺旋和兩個(gè)反平行的β-折疊組成，由三個(gè)二硫鍵穩(wěn)定(Cys4-Cys30，Cysl5-Cys37，Cysl9-Cys39)。菌絲霉素高抗革蘭氏陽性菌、無細(xì)胞毒性、無溶血性及腦脊液滲透性好，在治療革蘭氏陽性菌病方面具有相當(dāng)大的潛力，是具有治療潛能的新的肽抗生素。采用基因工程手段構(gòu)建菌絲霉素基因工程菌，相對(duì)于化學(xué)合成和直接從生物組織中提取的方式以其生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。中國專利申請(qǐng)?zhí)枮?01010115149. 6的發(fā)明專利申請(qǐng)公開了一種酵母工程菌制備重組菌絲霉素的方法，但該方法存在如下不足1)主要為單拷貝整合，表達(dá)量有限；幻發(fā)生多次自發(fā)交換產(chǎn)生多拷貝基因的概率極低，幻篩選多拷貝的工作量大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種重組菌絲霉素基因多拷貝表達(dá)載體及其重組酵母的制備方法，該方法采用同尾酶法體外構(gòu)建菌絲霉素多拷貝表達(dá)盒，一次整合即可將多個(gè)表達(dá)盒插入酵母染色體，有效提高菌絲霉素在酵母中的表達(dá)豐度，實(shí)現(xiàn)其廉價(jià)生產(chǎn)。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案，其特征在于該方法，包括以下步驟(一 )菌絲霉素基因所述來源于真菌的菌絲霉素基因優(yōu)選自腐生子囊菌假黑盤菌(the saprophytic ascomycete Pseudoplectania nigrella)(專利號(hào)為 201010115149. 6)中經(jīng)過密碼子優(yōu)化改造得到的菌絲霉素基因(SEQ ID NO. 1)核苷酸序列。( 二)重組菌絲霉素單拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建所述的表達(dá)載體衍生于酵母表達(dá)載體，優(yōu)選的，所述酵母表達(dá)載體為pPIC系列表達(dá)載體，優(yōu)選的，所述的表達(dá)載體采用PPICZ α Α。所述的單拷貝表達(dá)載體含有一個(gè)拷貝的菌絲霉素表達(dá)盒，所述的菌絲霉素表達(dá)盒包括以下元件(a)起始信號(hào)元件為醇氧脫氫酶強(qiáng)啟動(dòng)子(AOX)；(b) α -因子信號(hào)肽基因及融合在其C端的菌絲霉素基因；(c)終止信號(hào)元件為AOX(TT)；在菌絲霉素基因的5'-端設(shè)計(jì)限制性內(nèi)切酶BioI酶切位點(diǎn)，并保留了 BioI酶切位點(diǎn)后的酵母Kex2切割位點(diǎn)(KR)編碼序列，以便分泌表達(dá)后信號(hào)肽的切割獲得重組
3Plectasin，在基因3'-端設(shè)計(jì)TAATAA終止子序列及)(ba I酶切位點(diǎn)，以便多肽表達(dá)的終止及載體構(gòu)建，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司直接合成，菌絲霉素基因片段經(jīng) Xho I和)(ba I雙酶切后克隆至經(jīng)相同酶切后的表達(dá)載體pPICZ α A上，構(gòu)建重組表達(dá)載體 pPICPlectasin。(三)重組菌絲霉素多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建所述的多拷貝表達(dá)載體中含有2個(gè)以上，更優(yōu)選4-16個(gè)，最優(yōu)選4-8個(gè)串聯(lián)排列
的菌絲霉素表達(dá)盒。將菌絲霉素單拷貝表達(dá)載體pPICPlectasin經(jīng)BglII和BamHI雙酶切，得到含有醇氧化酶基因啟動(dòng)子、α -信號(hào)肽因子、菌絲霉素基因、醇氧化酶基因末端終止子的完整表達(dá)盒序列作為串聯(lián)單元，連接到經(jīng)BglII單酶切的表達(dá)載體pPICPlectasin上，利用BglII 和BamHI同尾酶的特性(同向連接后連接處序列發(fā)現(xiàn)變化使BglII和BamHI無法識(shí)別)，可以反復(fù)酶切連接操作，構(gòu)建獲得一系列菌絲霉素多拷貝表達(dá)載體。(四)重組菌絲霉素不同拷貝酵母的構(gòu)建及拷貝數(shù)的鑒定所述的酵母優(yōu)選為畢赤酵母，所述的畢赤酵母優(yōu)選畢赤酵母X-33。重組菌絲霉素多拷貝表達(dá)載體pPICPlectasinQn)經(jīng)內(nèi)切酶BglII線性化處理， 電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33，將電擊后的混合液涂布在含100 μ g/ml Zeocin的YPDS平板上， ^TC培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落，經(jīng)菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，甘油管保存陽性轉(zhuǎn)化子。酵母基因組提取試劑盒提取各陽性轉(zhuǎn)化子基因組DNA，并根據(jù)菌絲霉素基因序列設(shè)計(jì)引物和探針FP 5~-GAGGCTGAAGCTGGTTTTGGT ； RP 5~-AATAGACTTACAATGGTTATGACATTGCA ；探針(Probe):
FAM-CCATGGGATGAAGATGA-MGB,以線性化單拷貝表達(dá)載體pPICPlectasin作為單拷貝標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)。(五)重組菌絲霉素不同拷貝酵母的誘導(dǎo)表達(dá)將含不同菌絲霉素基因拷貝數(shù)的重組酵母接種在BMGY中，振蕩培養(yǎng)使菌增殖至 OD = 5-6，離心收集菌體，將菌體重懸在BMMY中，使其OD值達(dá)到1. 0，在下進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)。每隔M小時(shí)補(bǔ)加甲醇至甲醇終濃度為0. 5%，在搖瓶水平比較重組菌絲霉素不同拷貝酵母的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)菌絲霉素單拷貝和四拷貝轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù)與表達(dá)量存在線性關(guān)系。通過附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式
進(jìn)行說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。


圖1.重組菌絲霉素單拷貝表達(dá)載體pPICPlectasin示意2.菌絲霉素多拷貝表達(dá)載體構(gòu)建示意3.菌絲霉素單拷貝、二拷貝、四拷貝、八拷貝表達(dá)載體Bglll/BamHI雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析1，6 =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2-5 單拷貝，二拷貝、四拷貝、八拷貝37 °C酶切4h圖4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證畢赤酵母菌絲霉素多拷貝轉(zhuǎn)化子整合拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線用紅色表示；各拷貝樣品用藍(lán)色表示圖5. Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)多拷貝轉(zhuǎn)化子120h發(fā)酵液上清
1-4 菌絲霉素單拷貝，二拷貝，四拷貝，八拷貝轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)120h的發(fā)酵液上清；5:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)” (New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press，1989)及“精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南”(美/F.奧斯伯等著，顏?zhàn)臃f等譯，北京，科學(xué)出版社，1998)中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。本發(fā)明的實(shí)施例中使用的畢赤酵母X33及pPIC系列表達(dá)載體pPICZ α A均購自 hvitrogen公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司(TIANGEN)，限制性內(nèi)切酶購自 NEB 公司(New England Biolabs)。實(shí)施例1菌絲霉素基因工程菌的構(gòu)建1. 1基于酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)Plectasin的基因根據(jù)巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)密碼子使用的偏愛性(http://WWW. kazusa. or. jp/codon/)人工設(shè)計(jì)Plectasin的基因，所得序列如SEQ ID NO. 1所示。1. 2重組菌絲霉素單拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建在Plectasin基因的5’ -端設(shè)計(jì)了 Plectasin基因中不具備但載體多克隆位點(diǎn)上具有的限制性內(nèi)切酶》ιοΙ酶切位點(diǎn)，并保留了 BioI酶切位點(diǎn)后的酵母Kex2切割位點(diǎn) (KR)編碼序列，以便分泌表達(dá)后信號(hào)肽的切割，獲得重組Plectasin，在基因3’ -端設(shè)計(jì) TAATAA終止子序列及^CbaI酶切位點(diǎn)，以便多肽表達(dá)的終止及載體構(gòu)建所設(shè)計(jì)用于表達(dá)的 Plectasin基因，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司直接合成，Xho I和)(ba I雙酶切后克隆至》ιοΙ和)(ba I雙酶切后的表達(dá)載體pPICZ α A上，構(gòu)建重組菌絲霉素單拷貝表達(dá)載體pPICPlectasin (圖1)，測(cè)序正確后轉(zhuǎn)化并保存在大腸桿菌DH5 α中。1. 3重組菌絲霉素多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建提取大腸桿菌DH5ci中重組菌絲霉素單拷貝表達(dá)載體pPICPlectasin，利用表達(dá)載體存在的一對(duì)同尾酶Bgl II/BamHI位點(diǎn)來構(gòu)建重組菌絲霉素多拷貝表達(dá)載體 pPICPlectasin (2n).Plectasin單拷貝表達(dá)載體pPICPlectasin中含有的表達(dá)盒(pAOXl及目的基因)，約3.61Λ。單拷貝表達(dá)載體上下游側(cè)翼分別為獨(dú)個(gè)的Bgl II及BamH I位點(diǎn)。限制性內(nèi)切酶BamH I、BglII為同尾酶，含目的基因的pPICPlectasin用Bgl II及BamH I消化分離表達(dá)盒(約1.61Λ)，用BglII單酶切獲得線性質(zhì)粒pPICPlectasin，將表達(dá)盒再插入線性質(zhì)粒pPICPlectasin以產(chǎn)生串聯(lián)重復(fù)表達(dá)盒，重復(fù)該插入程序可產(chǎn)生一系列逐漸增加數(shù)目表達(dá)盒的載體(圖2)，用體外形成的多拷貝子轉(zhuǎn)化畢赤酵母增加了多拷貝表達(dá)盒重組子出現(xiàn)的頻率。圖3為構(gòu)建的Plectasin —，二，四和八拷貝重組載體，分別為3. 6,5. 2,8. 4和 14.8kb，經(jīng)BamH I、Bgl II雙酶切后產(chǎn)生的表達(dá)盒分別為1. 6、3. 2、6. 4和12. 8kb。1. 4菌絲霉素各拷貝表達(dá)載體轉(zhuǎn)化篩選及拷貝數(shù)鑒定Bgl II線性化菌絲霉素二拷貝、四拷貝、八拷貝表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33 感受態(tài)細(xì)胞及陽性轉(zhuǎn)化子的篩選。甘油管保存陽性轉(zhuǎn)化子。將鑒定的重組表達(dá)載體pPICPlectasin^i)經(jīng)內(nèi)切酶Bgl II線性化處理，電擊轉(zhuǎn)化(1.2Κν，25μΡ，400Ω)處理好的感受態(tài)畢赤酵母Χ_33，電擊結(jié)束后，加入冰預(yù)冷的 IM山梨醇，混勻后轉(zhuǎn)入離心管中，30°C靜止?jié)?；取適量樣品涂YPDS平板(含100yg/mL Zeocin)，倒置培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落。根據(jù)優(yōu)化的菌絲霉素基因序列設(shè)計(jì)上下游引物F 1,-GTTTTGGTTGTAACGGTCCATGGGATGAAGATGATATGCA-3~ ；Rl，-ACCACCCTTAGCACAGTAACCACCCTTGTAACCCTTAATA-3~。煮凍煮菌落PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)化子。瓊脂糖凝膠(1 % )電泳檢測(cè)PCR結(jié)果，甘油管保存陽性轉(zhuǎn)化子。酵母基因組提取試劑盒提取各陽性轉(zhuǎn)化子基因組DNA，并根據(jù)菌絲霉素基因序列設(shè)計(jì)引物和探針如下，實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)。 FP 5~-GAGGCTGAAGCTGGTTTTGGT ；RP 5~-AATAGACTTACAATGGTTATGACATTGCA ；探針(Probe)FAM-CCATGGGATGAAGATGA-MGB線性化單拷貝表達(dá)載體pPICPlectasin作為單拷貝標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。起始質(zhì)粒拷貝數(shù)為5. 16X107，進(jìn)行兩倍梯度稀釋，共10個(gè)梯度，每個(gè)梯度三個(gè)平行樣品作為擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將提取的各拷貝轉(zhuǎn)化子基因組稀釋成50ng/y L作為PCR模板。熒光定量PCR反應(yīng)體系
Template1.5 μ L
2XMix7.5 μ L
ROX0.3μ L
FP(200nM)0.3μ L
RP(200nM)0.3μ L
Probe(250nM)0.36 μ L
ddH204.99 μ L
Total 循環(huán)參數(shù) 啟動(dòng)50°C 預(yù)變性95°C 變性95°C 退火延伸60 0C
15μ L
2min 5min 15s
60s 循環(huán)40次
提取各拷貝轉(zhuǎn)化子的畢赤酵母X-33基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證(圖4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌絲霉素單拷貝，二拷貝，四拷貝和八拷貝轉(zhuǎn)化子的Ct值存在線性關(guān)系，即后者總比前者早一個(gè)循環(huán)達(dá)到熒光信號(hào)閾值，整個(gè)擴(kuò)增曲線斜率為-3. 289, R2為0. 992，擴(kuò)增效率為101.41%。其中單拷貝至八拷貝三個(gè)平行樣品Ct值的平均值分別為32. 174,31.269, 30.019,28. 671。實(shí)施例2重組菌絲霉素的誘導(dǎo)表達(dá)的接種量接種鑒定正確的菌絲霉素二拷貝，四拷貝，八拷貝轉(zhuǎn)化子至IOmL BMGY培養(yǎng)基中，300C，250rpm搖至OD600nm4. 0 (對(duì)數(shù)生長期，大約16_18h)；室溫，2500g離心5min。棄上清，用50mL BMMY培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至OD6tltlnmL 0 ；在250mL三角瓶中加入上述培養(yǎng)物，加蓋4層滅菌紗布，放入搖床繼續(xù)生長；每M小時(shí)，加甲醇至終濃度為0. 5%繼續(xù)誘導(dǎo)；在下列的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，011，對(duì)11，4811，7211，9611，12011取11^培養(yǎng)基至1. 5mL離心管并測(cè)量該時(shí)間點(diǎn)的OD值，室溫12000rpm離心2_;3min，誘導(dǎo)時(shí)間為120h。將菌懸液稀釋為相同的 OD值，離心收集上清至離心管中，-20°C保存。Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，單拷貝和四拷貝重組菌株120h的發(fā)酵上清液在約4. 4kDa處有明顯加粗的條帶，與菌絲霉素理論分子量相符，結(jié)合凝膠成像軟件分析發(fā)現(xiàn)四拷貝轉(zhuǎn)化子的菌絲霉素表達(dá)量是單拷貝轉(zhuǎn)化子的 4倍(圖5)，表達(dá)量和拷貝數(shù)之間存在線性關(guān)系。 以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要書及其等同物界定。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)菌絲霉素的酵母細(xì)胞，其特征在于，所述酵母細(xì)胞的染色體中整合有表達(dá)菌絲霉素的構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有2-16個(gè)串聯(lián)排列的菌絲霉素表達(dá)盒，每個(gè)所述菌絲霉素表達(dá)盒包括以下元件(a)起始信號(hào)元件為醇氧脫氫酶強(qiáng)啟動(dòng)子(AOX) ； (b) α -因子信號(hào)肽基因及融合在其C端的菌絲霉素基因；(c)終止信號(hào)元件為AOX (TT)。所述酵母細(xì)胞在甲醇誘導(dǎo)下表達(dá)菌絲霉素，表達(dá)量與菌絲霉素基因拷貝數(shù)之間存在線性關(guān)系。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)菌絲霉素的酵母細(xì)胞，其特征在于，所述酵母細(xì)胞選自畢赤酵母、釀酒酵母或漢遜酵母，優(yōu)選的，所述酵母細(xì)胞選自畢赤酵母，更優(yōu)選的，所述酵母細(xì)胞選自畢赤酵母Χ-33。
3.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)菌絲霉素的酵母細(xì)胞，其特征在于，所述的構(gòu)建物衍生于酵母表達(dá)載體，優(yōu)選的，所述酵母表達(dá)載體為PPIC系列表達(dá)載體，更優(yōu)選的，所述的表達(dá)載體采用PPICZ α Α,且菌絲霉素基因包括SEQ ID NO. 1所示的序列。
4.一種構(gòu)建物，其特征在于，所述構(gòu)建物含有2-16個(gè)串聯(lián)排列的菌絲霉素表達(dá)盒，每個(gè)所述菌絲霉素表達(dá)盒包括以下元件(a)起始信號(hào)元件為醇氧脫氫酶強(qiáng)啟動(dòng)子(AOX)； (b) α -因子信號(hào)肽基因及融合在其C端的菌絲霉素基因；(c)終止信號(hào)元件為AOX(TT)；
5.構(gòu)建權(quán)利要求4所述的構(gòu)建物的方法，其特征在于，所述方法包括(1)將菌絲霉素基因定點(diǎn)插入包括起始信號(hào)元件、信號(hào)肽和終止信號(hào)元件的質(zhì)粒中，以獲得單拷貝表達(dá)質(zhì)粒；(2)對(duì)所述單拷貝表達(dá)質(zhì)粒含有完整的菌絲霉素表達(dá)盒，其中，所述表達(dá)盒包含(a) 起始信號(hào)元件為醇氧脫氫酶強(qiáng)啟動(dòng)子(AOX) ； (b) α-因子信號(hào)肽基因及融合在其C端的菌絲霉素基因；(c)終止信號(hào)元件為AOX(TT)；(3)采用限制性內(nèi)切酶BglII和BamHI粘性末端能互補(bǔ)的原則，通過反復(fù)酶切、連接和轉(zhuǎn)化操作，將所述菌絲霉素表達(dá)盒重復(fù)插入所述質(zhì)粒中，從而獲得含有2-16個(gè)串聯(lián)排列的菌絲霉素表達(dá)盒的構(gòu)建物。
6.權(quán)利要求1所述的表達(dá)菌絲霉素的酵母細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括步驟用權(quán)利要求4所述的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，其所述的構(gòu)建物整合入酵母染色體中， 從而獲得權(quán)利要求1所述的表達(dá)菌絲霉素的酵母細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多拷貝表達(dá)重組菌絲霉素的畢赤酵母的制備方法。該方法包括根據(jù)畢赤酵母翻譯的密碼子偏愛性，設(shè)計(jì)出菌絲霉素表達(dá)基因的序列；將優(yōu)化的菌絲霉素基因融合在表達(dá)載體pPICZαA的α-因子信號(hào)肽C端，構(gòu)建單拷貝表達(dá)載體，該載體含有由起始信號(hào)元件醇氧脫氫酶強(qiáng)啟動(dòng)子(AOX)、α-因子信號(hào)肽基因及融合在其C端的菌絲霉素基因和終止信號(hào)元件AOX(TT)等組成的菌絲霉素表達(dá)盒；利用限制性內(nèi)切酶BglII和BamHI粘性末端能互補(bǔ)的原則，通過反復(fù)酶切、連接和轉(zhuǎn)化操作，獲得含菌絲霉素基因的不同拷貝串聯(lián)表達(dá)盒的重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母后，在甲醇誘導(dǎo)下能高效分泌表達(dá)菌絲霉素，表達(dá)量與菌絲霉素基因拷貝數(shù)之間存在線性關(guān)系。本發(fā)明所構(gòu)建的多拷貝高表達(dá)酵母細(xì)胞可用于提高產(chǎn)量、降低成本，適于菌絲霉素的規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/865GK102409003SQ201010291818
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者張軍, 楊雅麟, 滕達(dá), 王少然, 王建華 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所