專利名稱：一種鰤魚諾卡氏菌熒光定量pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及螄魚諾卡氏菌的檢測試劑，具體涉及一種螄魚諾卡氏菌熒光定量PCR 檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
螄魚諾卡氏菌(Mocardia seriolea )是一種近年發(fā)現的魚類、貝類和甲殼類等動 物的致病菌，該菌從感染、發(fā)病至死亡的延續(xù)流行時間長，感染性強，死亡率高，危害性大， 平均發(fā)病率高達40%，平均死亡率達35%。我們在海水養(yǎng)殖的大黃魚和淡水養(yǎng)殖的烏鱧中都 發(fā)現了該病菌，由于該病菌宿于動物的內臟(肝、脾、腎、心等)，主要癥狀為內臟出現白色結 節(jié)，而早期體表無明顯癥狀，給魚病檢測和防治帶來了困難。因此，建立螄魚諾卡氏菌的檢 測技術，尤其是早期快速檢測技術就顯得尤為重要和迫切。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種螄魚諾卡氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒， 該檢測試劑盒可以靈敏、快速、定量、特異性的檢測出早期的螄魚諾卡氏菌。本發(fā)明還提供 了用該檢測試劑盒檢測螄魚諾卡氏菌的方法，為水產養(yǎng)殖致病菌檢測、養(yǎng)殖環(huán)境監(jiān)測、養(yǎng)殖 飼料致病菌檢測等均具有重要意義。本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種螄魚諾卡氏菌熒光定量PCR 檢測試劑盒，該試檢測劑盒包括SYBR Premix Ex 7^《 !!專用試劑(2X ) (TaKaRa公司生 產，購于寶生物工程有限公司)10.0 μ 1，濃度為10 μ mol/L的上游引物溶液、下游引物溶液 各0.8 μ 1，所述上游引物的核苷酸序列為5’ TGCTACAATGGCCGG TACAGAG 3’，所述下游引 物的核苷酸序列為5’TTCACGAGGT CGAGTTGCAG AC 3’。上下游引物根據登錄號為AB060282 的螄魚諾卡氏菌16S-23S rRNA基因內轉錄間隔序列為模板，該序列大小為1359 bp，用引 物探測軟件primer explorer設計了上述一對特異性較高的螄魚諾卡氏菌引物，引物由上 海生工生物工程有限公司合成。用螄魚諾卡氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒檢測該致病菌的方法，包括下述步驟
1)致病菌提取將動物內臟研磨成組織液，取1.5ml組織液置于微量離心管中，在室 溫下6000 rpm離心2 min，棄上清液，在沉淀中加無菌水至半管，在室溫下6000 rpm離心5 min，棄上清液，再在沉淀中加無菌水至半管，在室溫下6000 rpm離心5 min，棄上清液，然后 在沉淀中加TE Buffer溶液至半管，在室溫下6000 rpm離心5 min，棄上清液，得到致病菌 提取物，所述TE Buffer溶液的pH8. 0 ；所述TE Buffer溶液購于上海生工生物工程有限公 司，也可以由濃度為lOmmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液(Tris-HCl )與濃度為lmmol/ L乙二胺四乙酸(EDTA)自配成pH8. 0的TE Buffer溶液；
2)致病菌酶解在上述致病菌提取物加入所述TEBuffer溶液450 μ 和濃度為50mg/ ml的溶菌酶20 μ ，置于37° C水浴中酶解24 h，然后加入質量百分濃度為20%的十二烷 基硫酸鈉(SDS)溶液25 μ 1，置于56° C水浴中酶解30 min,再加入濃度為20 mg/ml的蛋
4白酶K溶液5 μ 1，置于37 ° C水浴中酶解1 h，加入500 μ 1飽和酚，輕輕上下顛倒混合 均勻，在4° C下10000 rpm離心15 min,棄沉淀得到致病菌酶解液；酶解的目的是菌體破 壁，釋放DNA，溶菌酶可以裂解細胞壁，蛋白酶K可以降解蛋白質；溶菌酶和蛋白酶K購于上 海生工生物工程有限公司；
3)DNA粗提物制備將上述致病菌酶解液置于第一微量離心管中，加入與致病菌酶解 液等體積的第一有機溶液，所述第一有機溶液由酚、氯仿和異戊醇按體積比25 24 1配置 得到，上下顛倒混合均勻，在4° C下10000 rpm離心10 min,得到第一上清液，將第一上清 液置于第二微量離心管中，加入與所述第一上清液等體積的第二有機溶液，所述第二有機 溶液由氯仿、異戊醇按體積比24:1配置得到，上下顛倒混合均勻，在4° C下10000 rpm離 心10 min，得到第二上清液，將第二上清液置于第三微量離心管中，加入濃度為3mol/L的 醋酸鈉(NaAC)溶液，所述醋酸鈉溶液與所述第二上清液的體積比1 :10，再加入所述第二上 清液二倍體積的-20° C無水乙醇，置于-20° C冰箱中培養(yǎng)，至大量絲狀DNA沉淀出現，然 后用離心機以10000 rpm離心10 min，棄上清液，得到DNA沉淀，在DNA沉淀中加入質量百 分濃度為70%的乙醇至半管，用冷凍離心機在4° C下以12000 rpm離心洗滌2 min，棄上 清液，再同樣加70%的乙醇離心洗滌一次，然后將DNA沉淀在室溫下?lián)]干乙醇，得到DNA粗 提物；這樣通過三級粗提可以去除蛋白質等雜質；
4)DNA粗提物純化在上述DNA粗提物中加入所述TEBuffer溶液400 μ 1和濃度為10 mg/ml的RNA酶溶液5 μ 1，37 ° C下溫育1 h，得到粗提物酶解液，再加入與粗提物酶解液 等體積的所述第一有機溶液，上下顛倒混合均勻，在4° C下10000 rpm離心10 min,得到 第一 DNA上清液，將第一 DNA上清液置于離心管中，加入與第一 DNA上清液等體積的所述第 二有機溶液，上下顛倒混合均勻，在4° C下10000 rpm離心10 min,得到第二 DNA上清液， 將第二 DNA上清液置于另一離心管中，加入濃度為3mol/L的醋酸鈉溶液，所述醋酸鈉溶液 與所述第二 DNA上清液的體積比1 :10，再加入所述第二 DNA上清液二倍體積的-20° C無 水乙醇，置于-20° C冰箱中培養(yǎng)，至大量絲狀DNA沉淀出現，然后用離心機以10000 rpm離 心10 min,棄上清液，得到DNA純化物，加入所述TE Buffer溶液50 μ 1溶解DNA純化物， 得到模板DNA溶液，置于-20° C保存?zhèn)溆?；RNA酶購于上海生工生物工程有限公司，RNA 酶可以降解DNA粗提物中的RNA
5)檢測取上述模板DNA溶液1μ 1，加入到所述的螄魚諾卡氏菌熒光定量PCR檢測 試劑盒中，用滅菌去離子水定量至20 μ L，在Rotor-Gene 6000熒光定量PCR儀上擴增反應 進行檢測，擴增反應條件為第一步預變性95° C，1 min，1 Cycle ；第二步PCR反應，變 性 95° C, 5 sec、退火 60° C, 20 sec、延伸 72° C, 20 sec 共 40 循環(huán)(Cycle)；第三步 95° C，15 sec、60° C, 30 sec,95° C，15 sec，PCR反應結束，得到擴增曲線圖和熔解曲線 圖及Ct值，與已建立的螄魚諾卡氏菌DNA的PCR反應的擴增曲線和熔解曲線比較相似性， 判別是否含有螄魚諾卡氏菌，又根據檢測出的Ct值代入已建立螄魚諾卡氏菌DNA的標準曲 線，計算出的DNA含量。 與現有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于一種螄魚諾卡氏菌熒光定量PCR檢測試劑 盒及檢測方法，該試劑盒包括SYBR Premix Ex Taqm Π 用試劑10. 0 μ 1,濃度為10 μ M 的上游引物溶液、下游引物溶液各0.8 μ ，上游引物的核苷酸序列為5’ TGCTACAATG GCCGGTACAG AG 3’，下游引物的核苷酸序列為5’ TTCACGAGGT CGAGTTGCAG AC 3’ ；檢測方法通過致病菌提取、致病菌酶解、DNA粗提物制備、DNA粗提物純化和檢測；該檢測試劑盒可以 靈敏、快速、定量、特異性的檢測出早期的螄魚諾卡氏菌，靈敏度可以達到10_6 μ g/μ 1，在 10_5 μ g/μ 1水平上基本能定量；并可以應用于多種樣品的檢測，如檢測水產養(yǎng)殖動物是否 感染螄魚諾卡氏菌，監(jiān)測養(yǎng)殖水體環(huán)境中螄魚諾卡氏菌含量，檢測養(yǎng)殖飼料和鮮活餌料是 否遭受螄魚諾卡氏菌污染等。該檢測試劑盒及檢測方法對水產養(yǎng)殖動物病害的發(fā)現和防 治、無公害水產品生產及養(yǎng)殖飼料和鮮活餌料質量安全均具有重要意義，可為其它養(yǎng)殖動 物病原菌早期檢測提供借鑒模式，具有廣泛的適用性。


圖1為螄魚諾卡氏菌DNA的熒光定量PCR檢測的擴增曲線的示意圖； 圖2為螄魚諾卡氏菌DNA的熒光定量PCR檢測的熔解曲線的示意圖3為螄魚諾卡氏菌熒光定量PCR檢測的標準曲線圖； 圖4為實施例7、8、9、10、11、12和13的擴增曲線圖； 圖5為實施例7、8、9、10、11、12和13的熔解曲線圖。
具體實施例方式以下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。實施例1
螄魚諾卡氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒包括SYBR Premix Ex T^tmH (2Χ )專用 試劑10.0 μ 1，濃度為10 μ M的上游引物溶液、下游引物溶液各0.8 μ 1，上游引物的核 苷酸序列為5’ TGCTACAATG GCCGGTACAG AG 3’，下游引物的核苷酸序列為5’ TTCACGAGGT CGAGTTGCAG AC 3’，上下游引物根據螄魚諾卡氏菌16S - 23S rRNA基因內轉錄間隔序列設 計，由上海生工生物工程有限公司合成。標準螄魚諾卡氏菌模板DNA制備將培養(yǎng)的螄魚諾卡氏菌菌懸液1. 5ml置于微量 離心管中6000 rpm離心5 min，棄去上清液，得到的沉淀溶于450 μ 1 TE Buffer溶液中， 加入濃度為50 mg/ml的溶菌酶20 μ 1，置于37° C水浴中酶解24 h，然后加入質量百分濃 度為20%的SDS溶液25 μ 1，置于56° C水浴中酶解30 min，再加入濃度為20 mg/ml的蛋 白酶K溶液5 μ 1，置于37 ° C水浴中酶解1 h，加入500 μ 1飽和酚，輕輕上下顛倒混合 均勻，在4° C下10000 rpm離心15 min，棄沉淀得到螄魚諾卡氏菌酶解液；將螄魚諾卡氏菌 酶解液置于第一微量離心管中，加入與螄魚諾卡氏菌酶解液等體積的第一有機溶液，第一 有機溶液由酚、氯仿和異戊醇按體積比25 24 1配置得到，上下顛倒混合均勻，在4° C下 10000 rpm離心10 min，得到第一上清液，將第一上清液置于第二微量離心管中，加入與第 一上清液等體積的第二有機溶液，第二有機溶液由氯仿、異戊醇按體積比24 1配置得到， 上下顛倒混合均勻，在4° C下10000 rpm離心10 min，得到第二上清液，將第二上清液置 于第三微量離心管中，加入摩爾濃度為3mol/L的NaAC溶液，NaAC溶液的加入體積為第二 上清液體積的1/10，再加入第二上清液二倍體積的-20° C的無水乙醇，置于-20° C冰箱 中培養(yǎng)，至大量絲狀DNA沉淀出現，然后用離心機以10000 rpm離心10 min，棄第三上清液， 得到DNA沉淀，DNA沉淀中加入質量百分濃度為70%的乙醇至半管，用冷凍離心機在4° C 下以12000 rpm離心洗滌2 min，棄上清液，再同樣加70%的乙醇離心洗滌一次，然后將DNA
6沉淀在室溫下?lián)]干乙醇，得到螄魚諾卡氏菌DNA粗提物；將螄魚諾卡氏菌DNA粗提物溶于 400 μ 1 TE Buffer溶液中，加入濃度為10 mg/ml的RNA酶溶液5 μ 1,37 ° C下溫育1 h，得到DNA酶解液，加入與DNA酶解液等體積的第一有機溶液，上下顛倒混合均勻，在4° C 下10000 rpm離心10 min，得到第一 DNA上清液，將第一 DNA上清液置于離心管中，加入與 第一 DNA上清液等體積的第二有機溶液，上下顛倒混合均勻，在4° C下10000 rpm離心10 min，得到第二DNA上清液，將第二DNA上清液置于另一離心管中，加入摩爾濃度為3mol/L的 NaAC溶液，NaAC溶液的加入體積為第二 DNA上清液體積的1/10，再加入第二 DNA上清液二 倍體積的-20° C無水乙醇，置于-20° C冰箱中培養(yǎng)，至大量絲狀DNA沉淀出現，然后用離 心機以10000 rpm離心10 min，棄上清液，得到DNA純化物，DNA純化物溶于TE Buffer溶 液，配成濃度為ΙΟ—1 μ g/μ 1螄魚諾卡氏菌DNA模板標準溶液，置于-20° C保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR檢測取上述螄魚諾卡氏菌DNA模板溶液1 μ 1，加入到上述螄魚諾 卡氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒中，用滅菌去離子水定量至20 μ L，在Rotor-Gene 6000 熒光定量PCR儀上擴增反應進行檢測，擴增反應條件為第一步預變性95° C，1 min，1 Cycle ；第二步PCR 反應，變性 95° C, 5 sec、退火 60° C, 20 sec、延伸 72° C, 20 sec 共 40 Cycle ；第三步95° C, 15 sec、60° C, 30 sec,95° C, 15 sec，PCR 反應結束，從熒光 定量PCR儀上可以得到如圖1所示的擴增曲線的示意圖和圖2所示的熔解曲線的示意圖， 為已建立的螄魚諾卡氏菌DNA的熒光定量PCR檢測的標準擴增曲線和熔解曲線。實施例2
與實施例1基本相同，所不同的只是螄魚諾卡氏菌DNA模板標準溶液濃度為10_2 μ g/μ 1， 擴增曲線和熔解曲線與實施例1基本相同。實施例3
與實施例1基本相同，所不同的只是螄魚諾卡氏菌DNA模板標準溶液濃度為10_3μ g/μ 1， 擴增曲線和熔解曲線與實施例1基本相同。實施例4
與實施例1基本相同，所不同的只是螄魚諾卡氏菌DNA模板標準溶液濃度為10_4μ g/μ 1， 擴增曲線和熔解曲線與實施例1基本相同。實施例5
與實施例1基本相同，所不同的只是螄魚諾卡氏菌DNA模板標準溶液濃度為10_5μ g/μ 1， 擴增曲線和熔解曲線與實施例1基本相同。實施例6
與實施例1基本相同，所不同的只是螄魚諾卡氏菌DNA模板標準溶液濃度為10_6μ g/μ 1 ； 本實施例具有與圖1和圖2基本相似的擴增曲線和熔解曲線，說明本發(fā)明的螄魚諾卡 氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒的靈敏度可以達到在10_6μ g/μ 1量可以定性。根據實施例1、2、3、4、5的Ct值，以Ct值為橫坐標，螄魚諾卡氏菌DNA模板溶液濃 度的log值為縱坐標，得出如圖3所示的螄魚諾卡氏菌熒光定量PCR檢測的標準曲線圖，其 中實施例1的Ct值為14. 42、實施例2的Ct值為17. 25、實施例3的Ct值為21. 23、實施 例4的Ct值為24. 54、實施例5的Ct值為28. 19，回歸方程為y = 0. 2865x -6. 0531，回 歸直線決定系數R2 = 0.998，說明本發(fā)明的螄魚諾卡氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒的對濃度為10_5 μ g/μ 1及以上可以定量檢測；上述螄魚諾卡氏菌DNA模板標準溶液濃度為ICT1 μ g/μ 1、1(Γ2 μ g/μ 1>10"3 μ g/μ IUO"4 μ g/μ IUO"5 μ g/μ 1，相當于 DNA 含量為 IO2 ng、10 ng > IO0 ng UCT1 ng、lCT2 ng。
實施例7
1、致病菌提取將烏鱧魚1的內臟研磨成組織液，取1.5 ml組織液置于微量離心管中， 在室溫下6000 rpm離心2 min，沉淀中加無菌水至半管，在室溫下6000 rpm離心5 min，沉 淀中再加無菌水至半管，在室溫下6000 rpm離心5 min，然后在沉淀中加TE Buffer溶液至 半管，在室溫下6000 rpm離心5 min，棄去上清液，得到致病菌提取物；
2)致病菌酶解將上述致病菌提取物溶于450μ 1 TE Buffer溶液中，加入50 mg/ml 的溶菌酶20 μ 1，置于37° C水浴中酶解24 h，然后加入質量百分濃度為20%的SDS溶液 25 μ ，置于56° C水浴中酶解30 min，再加入濃度為20 mg/ml的蛋白酶K溶液5 μ ，置 于37 ° C水浴中酶解1 h，加入500 μ 1飽和酚，輕輕上下顛倒混合均勻，在4° C下10000 rpm離心15 min，棄沉淀得到致病菌酶解液；
3)DNA粗提物制備將上述致病菌酶解液置于第一微量離心管中，加入與致病菌酶解
液等
體積的第一有機溶液，第一有機溶液由酚、氯仿和異戊醇按體積比25 24 1配置得到， 上下顛倒混合均勻，在4° C下10000 rpm離心10 min，得到第一上清液，將第一上清液置 于第二微量離心管中，加入與第一上清液等體積的第二有機溶液，第二有機溶液由氯仿、異 戊醇按體積比24 :1配置得到，上下顛倒混合均勻，在4° C下10000 rpm離心10 min，得到 第二上清液，將第二上清液置于第三微量離心管中，加入濃度為3mol/L的NaAC溶液，NaAC 溶液的加入體積為第二上清液體積的1/10，再加入第二上清液二倍體積的-20° C無水乙 醇，置于-20° C冰箱中培養(yǎng)，至大量絲狀DNA沉淀出現，然后用離心機以10000 rpm離心 10 min，棄第三上清液，得到DNA沉淀，DNA沉淀中加入質量百分濃度為70%的乙醇至半管， 用冷凍離心機在4° C下以12000 rpm離心洗滌2 min,棄上清液，再同樣加70%的乙醇離 心洗滌一次，然后將DNA沉淀在室溫下?lián)]干乙醇，得到DNA粗提物；
4)DNA粗提物純化將上述DNA粗提物溶于400μ 1 TE Buffer溶液中，加入濃度為10 mg/ml的RNA酶溶液5 μ 1,37 ° C下溫育1 h，得到粗提物酶解液，加入與粗提物酶解液 等體積的第一有機溶液，上下顛倒混合均勻，在4° C下10000 rpm離心10 min，得到第一 DNA上清液，將第一 DNA上清液置于離心管中，加入與第一 DNA上清液等體積的第二有機溶 液，上下顛倒混合均勻，在4° C下10000 rpm離心10 min,得到第二 DNA上清液，將第二 DNA上清液置于另一離心管中，加入摩爾濃度為3mol/L的NaAC溶液，NaAC溶液的加入體 積為第二 DNA上清液體積的1/10，再加入第二 DNA上清液二倍體積的-20° C無水乙醇，置 于-20° C冰箱中培養(yǎng)，至大量絲狀DNA沉淀出現，然后用離心機以10000 rpm離心10 min, 棄上清液，得到DNA純化物，DNA純化物用50 μ 1 TE Buffer溶液溶解，即為模板DNA，置 于-20° C保存?zhèn)溆茫?br> 5)檢測取上述模板DNAlμ 1，加入到本發(fā)明的螄魚諾卡氏菌熒光定量PCR檢測試劑 盒中，用滅菌去離子水定量至20 μ L，在Rotor-Gene 6000熒光定量PCR儀上擴增反應進 行檢測，擴增反應條件為第一步預變性95° C，1 min，1 Cycle ；第二步PCR反應，變性 95° C，5 sec、退火 60° C, 20 sec、延伸 72° C, 20 sec 共 40 Cycle ；第三步95° C, 15
8sec、60° C, 30 sec,95° C，15 sec，PCR反應結束，得到如圖4和圖5所示的擴增曲線圖 和熔解曲線圖及Ct值為14. 46，其與已建立的螄魚諾卡氏菌DNA的PCR反應的擴增曲線和 熔解曲線基本相同，說明該烏鱧魚宿有螄魚諾卡氏菌，又根據檢測出的Ct值代入已建立螄 魚諾卡氏菌DNA的標準曲線，得出DNA含量為0. 813 X IO"2 μ g。實施例8
與實施例7基本相同，所不同的只是烏鱧魚2的內臟，該烏鱧魚2的螄魚諾卡氏菌熒光
定量
PCR檢測試劑盒檢測得到的Ct值為13. 84，得出的DNA含量為1. 224X IO"2 Ugo實施例9
與實施例7基本相同，所不同的只是烏鱧魚3的內臟，該烏鱧魚3的螄魚諾卡氏菌熒光
定量
PCR檢測試劑盒檢測得到的Ct值為15. 05，得出的DNA含量為0. 551 X 10_2 μ g。實施例10
與實施例7基本相同，所不同的只是烏鱧魚4的內臟，該烏鱧魚4的螄魚諾卡氏菌熒光
定量
PCR檢測試劑盒檢測得到的Ct值為16. 58，得出DNA含量為0. 201 X 10_2 μ g。實施例11
與實施例7基本相同，所不同的只是烏鱧魚5的內臟，該烏鱧魚5的螄魚諾卡氏菌熒光
定量
PCR檢測試劑盒檢測得到的Ct值為13. 88，得出DNA含量為1. 19 X IO"2 Ugo實施例12
與實施例7基本相同，所不同的只是大黃魚1的內臟，該大黃魚1的螄魚諾卡氏菌熒光
定量
PCR檢測試劑盒檢測得到的Ct值為14. 61，得出DNA含量為0. 737 X IO"2 Ugo實施例13
與實施例7基本相同，所不同的只是大黃魚2的內臟，該大黃魚2的螄魚諾卡氏菌熒光
定量
PCR檢測試劑盒檢測得到的Ct值為17. 82，得出DNA含量為0. 886X IO^3Ug0從圖4和圖5中可以看出，實施例7、8、9、10、11的烏鱧魚和12、13的大黃魚的擴 增曲線和熔解曲線都與已建立的圖1的擴增曲線的示意圖和圖2的熔解曲線的示意圖基 本相似，因此說明實施例7、8、9、10、11的烏鱧魚和12、13的大黃魚宿有螄魚諾卡氏菌。本發(fā)明的檢測試劑盒和檢測方法，也可以用于貝類和甲殼類等水產動物的螄魚諾 卡氏致病菌的檢測，也可以用于檢測養(yǎng)殖飼料和鮮活餌料是否遭受螄魚諾卡氏菌污染，監(jiān) 測養(yǎng)殖水體環(huán)境中螄魚諾卡氏菌含量等，在此不一一列舉。
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權利要求
一種鰤魚諾卡氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒，該試檢測劑盒包括SYBR Premix Ex TaqTM專用試劑2×10.0 μl，濃度為10μmol/L的上游引物溶液、下游引物溶液各0.8 μl，其特征在于所述上游引物的核苷酸序列為5， TGCTACAATG GCCGGTACAG AG 3，，所述下游引物的核苷酸序列為5，TTCACGAGGT CGAGTTGCAG AC 3，。965054dest_path_image001.jpg
2.一種用權利要求1所述的螄魚諾卡氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒檢測該致病菌的方 法，其特征在于包括下述步驟1)致病菌提取將動物內臟研磨成組織液，取1.5ml組織液置于微量離心管中，在室 溫下6000 rpm離心2 min，棄上清液，在沉淀中加無菌水至半管，在室溫下6000 rpm離心5 min，棄上清液，再在沉淀中加無菌水至半管，在室溫下6000 rpm離心5 min，棄上清液，然后 在沉淀中加TE Buffer溶液至半管，在室溫下6000 rpm離心5 min，棄上清液，得到致病菌 提取物，所述TE Buffer溶液的pH8. 0 ；2)致病菌酶解在上述致病菌提取物加入所述TEBuffer溶液450 μ 和濃度為50mg/ ml的溶菌酶20 μ ，置于37° C水浴中酶解24 h，然后加入質量百分濃度為20%的十二烷 基硫酸鈉溶液25 μ 1，置于56° C水浴中酶解30 min，再加入濃度為20 mg/ml的蛋白酶K 溶液5 μ 1，置于37 ° C水浴中酶解1 h，加入500 μ 1飽和酚，輕輕上下顛倒混合均勻，在 4° C下10000 rpm離心15 min，棄沉淀得到致病菌酶解液；3)DNA粗提物制備將上述致病菌酶解液置于第一微量離心管中，加入與致病菌酶解 液等體積的第一有機溶液，所述第一有機溶液由酚、氯仿和異戊醇按體積比25 24 1配置 得到，上下顛倒混合均勻，在4° C下10000 rpm離心10 min,得到第一上清液，將第一上清 液置于第二微量離心管中，加入與所述第一上清液等體積的第二有機溶液，所述第二有機 溶液由氯仿、異戊醇按體積比24:1配置得到，上下顛倒混合均勻，在4° C下10000 rpm離 心10 min，得到第二上清液，將第二上清液置于第三微量離心管中，加入濃度為3mol/L的 醋酸鈉溶液，所述醋酸鈉溶液與所述第二上清液的體積比1 :10，再加入所述第二上清液二 倍體積的-20° C無水乙醇，置于-20° C冰箱中培養(yǎng)，至大量絲狀DNA沉淀出現，然后用離 心機以10000 rpm離心10 min，棄上清液，得到DNA沉淀，在DNA沉淀中加入質量百分濃度 為70%的乙醇至半管，用冷凍離心機在4° C下以12000 rpm離心洗滌2 min，棄上清液，再 同樣加70%的乙醇離心洗滌一次，然后將DNA沉淀在室溫下?lián)]干乙醇，得到DNA粗提物；4)DNA粗提物純化在上述DNA粗提物中加入所述TEBuffer溶液400 μ 1和濃度為10 mg/ml的RNA酶溶液5 μ 1,37 ° C下溫育1 h，得到粗提物酶解液，再加入與粗提物酶解液 等體積的所述第一有機溶液，上下顛倒混合均勻，在4° C下10000 rpm離心10 min,得到 第一 DNA上清液，將第一 DNA上清液置于離心管中，加入與第一 DNA上清液等體積的所述第 二有機溶液，上下顛倒混合均勻，在4° C下10000 rpm離心10 min,得到第二 DNA上清液， 將第二 DNA上清液置于另一離心管中，加入濃度為3mol/L的醋酸鈉溶液，所述醋酸鈉溶液 與所述第二 DNA上清液的體積比1 :10，再加入所述第二 DNA上清液二倍體積的-20° C無 水乙醇，置于-20° C冰箱中培養(yǎng)，至大量絲狀DNA沉淀出現，然后用離心機以10000 rpm離 心10 min,棄上清液，得到DNA純化物，加入所述TE Buffer溶液50 μ 1溶解DNA純化物， 得到模板DNA溶液，置于-20° C保存?zhèn)溆茫?)檢測取上述模板DNA溶液1μ 1，加入到所述的螄魚諾卡氏菌熒光定量PCR檢測 試劑盒中，用滅菌去離子水定量至20 μ L，在Rotor-Gene 6000熒光定量PCR儀上擴增反應進行檢測，擴增反應條件為第一步預變性95° C，1 min，1 Cycle ；第二步PCR反應，變 性 95° C, 5 sec、退火 60° C, 20 sec、延伸 72° C, 20 sec 共 40 循環(huán)；第三步95° C, 15 sec、60° C, 30 sec,95° C，15 sec，PCR反應結束，得到擴增曲線圖和熔解曲線圖及Ct值， 與已建立的螄魚諾卡氏菌DNA的PCR反應的擴增曲線和熔解曲線比較相似性，判別是否含 有螄魚諾卡氏菌，又根據檢測出的Ct值代入已建立螄魚諾卡氏菌DNA的標準曲線，計算出 的DNA含量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鰤魚諾卡氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法，該試檢測劑盒包括SYBRPremixExTaqTM專用試劑10.0μl，濃度為10μmol/L的上游引物溶液、下游引物溶液各0.8μl，其特征在于所述上游引物的核苷酸序列為5， TGCTACAATGGCCGGTACAGAG 3，所述下游引物的核苷酸序列為5，TTCACGAGGTCGAGTTGCAGAC 3，；檢測方法通過致病菌提取、致病菌酶解、DNA粗提物制備、DNA粗提物純化和檢測；該檢測試劑盒可以靈敏、快速、定量、特異性的檢測出早期的鰤魚諾卡氏菌，靈敏度可以達到10-6μg/μl，在10-5μg/μl水平上基本能定量。
文檔編號C12Q1/06GK101962678SQ20101029164
公開日2011年2月2日 申請日期2010年9月26日 優(yōu)先權日2010年9月26日
發(fā)明者劉璐, 李思源, 王國良 申請人:寧波大學