專利名稱：從諾卡氏菌制備的一種生物絮凝劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及諾卡氏菌(Nocardia sp.)WSH-A11制備的一種新型生物絮凝劑REA-11，屬于微生物制劑技術(shù)領(lǐng)域。
生物絮凝劑是微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種新型、高效水處理藥劑。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成絮凝劑相比，生物絮凝劑具有應(yīng)用安全性高、無二次污染、來源廣等獨特的優(yōu)越性，因而近年來，隨著人們環(huán)保意識和健康意識的逐漸增強，生物絮凝劑的研究受到國內(nèi)外環(huán)境工程學(xué)者的重視，大有取代化學(xué)合成絮凝劑之勢。目前已發(fā)現(xiàn)的絮凝劑產(chǎn)生菌來源廣泛，涉及細(xì)菌，放線菌，酵母菌和霉菌。不同的微生物在不同的發(fā)酵條件下能夠合成不同種類的生物絮凝劑，目前已鑒定的生物絮凝劑大多為機能性多糖和機能性蛋白類物質(zhì)，或者幾種有機組分的復(fù)合體如糖蛋白，蛋白聚糖，脂蛋白等，另外還有極少數(shù)生物絮凝劑屬于DNA類物質(zhì)。Nakamura從Aspergillus sojae AJ7002的發(fā)酵液中提取到一種絮凝劑，該絮凝劑是一種以半乳糖胺為主的氨基糖和蛋白質(zhì)的復(fù)合體(Nakamura J.,Miyashiro S.,Hirose Y.,Agri.Biol.Chem.,1976,40(3):619-624)；Levy發(fā)明了從Cyanobacterium phrmidium sp.J1合成的一種硫酸酯化的雜多糖生物絮凝劑F-J1，其主要成分為糖醛酸，鼠李糖，甘露糖及半乳糖(Levy N.,Baror Y.,Magdassi S.,Colloids andSurfaces,1990,48:337-349)；Alcaligenes cupidus KT201代謝產(chǎn)生的Al-201是一種以42.5％葡萄糖、36.38％半乳糖、8.52％葡萄糖醛酸和10.3％乙酸為主要組成的生物絮凝劑(Toeda K.,Kurane R.,Agric.Biol.Chem.1991,55(11):2793-2799)；Paecilomyces sp.I-1產(chǎn)生的PF-101.絮凝劑是由氨基半乳糖以α-1,4糖苷鍵相連而成的粘多糖(Levy N.,Baror Y.,Magdassi S.,Colloids and Surfaces,1990,48:337-349)；M.Watanabe則報道了一種能產(chǎn)生DNA類絮凝劑的菌株Rhodovulum sp.PS88(M.Watanabe,K.Sasaki,Y.Nakashimada,T.Kakizono,N.Noparatnaraporn,N.Nishio,Appl.Microbiol.Biotechnol.1998,50(6):682-691)；日本的Kurane等人對Rhodococcus erythropolis S-1(原Nocardia菌屬)產(chǎn)生的絮凝劑NOC-1進行了較為深入的研究，囊括菌種篩選，培養(yǎng)條件優(yōu)化，絮凝物質(zhì)的分離純化及其應(yīng)用，Takeda et al.曾利用正丁醇-硫酸銨法將Rhodococcus erythropolis S-1產(chǎn)生的活性物質(zhì)從發(fā)酵液中分離出來，鑒定為蛋白質(zhì)性質(zhì)的絮凝劑NOC-1(M.Takeda,R.Kurane,J.Kiozumi,I.Nakamura,Agric.Biol.Chem.1991,55(10):2663-2664)；其后，Kurane卻從同一株菌的同樣條件的培養(yǎng)液中利用丙酮萃取法得到脂類絮凝劑，并對其脂質(zhì)結(jié)構(gòu)進行了詳細(xì)鑒定(R.Kurane.K.Hatamochi,T.Kakuno,K.Klyohara,K.Kawaguchi,Y.Mizuno,M.Hirano,Y.Taniguchi,Biosci.Biotech.Biochem.1994,58(11):1977-1982)。目前發(fā)現(xiàn)的生物絮凝劑大都由于產(chǎn)量低，絮凝活性弱，生產(chǎn)成本高而限制了其在實際中的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是選育一種從諾卡氏菌(Nocardia sp.)WSH-A11制備的生物絮凝劑REA-11，本發(fā)明產(chǎn)品是具有較強絮凝活性的新型生物絮凝劑，通過對其分子結(jié)構(gòu)分析，為設(shè)計育種和代謝調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)，同時為生物絮凝劑的實際推廣應(yīng)用提供條件，加快生物絮凝劑的工業(yè)化進程。
本發(fā)明的具體操作步驟如下1．菌種諾卡氏菌(Nocardia sp.)WSH-A11，自土壤中篩選得到(已保藏在武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC NO.M201005)(1)菌種篩選方法篩選培養(yǎng)基(gL-1)蔗糖10，酵母膏0.5，尿素0.5,KH2PO40.1,K2HPO40.1,NaCl0.1,MgSO4·7H2O0.2，瓊脂20,pH8.0發(fā)酵培養(yǎng)基(gL-1)蔗糖10，酵母膏0.5，尿素0.5,KH2PO42,K2HPO45,NaCl0.1,MgSO4·7H2O0.2,pH8.0培養(yǎng)條件為150轉(zhuǎn)/分，28℃振蕩培養(yǎng)2～3天后，檢測發(fā)酵液的絮凝活性。
初篩方法取1mL發(fā)酵液加至裝有40mL高嶺土溶液和2.5mL1％CaCl2的50mL刻度試管中，用蒸餾水定容至刻度，混勻后，靜置片刻，目測高嶺土溶液的絮凝情況，挑選高絮凝活性產(chǎn)生菌株作為復(fù)篩菌株。
復(fù)篩方法從斜面上各取一環(huán)菌，接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，每株3瓶，28℃,150轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)2～3天，檢測發(fā)酵液的絮凝活性，挑選高絮凝劑合成菌株。
(2)菌種特征菌落無氣生菌絲，質(zhì)地柔軟、白色、粘稠；液體培養(yǎng)基中呈短桿狀，八字型或平行排列，培養(yǎng)后期，產(chǎn)生少量淡黃色素，同時菌體成為類球狀或極短小的桿狀；能利用葡萄糖、蔗糖、果糖、乙酸鈉和琥珀酸鹽生長良好；能利用硝酸鹽、檸檬酸鹽、乳糖和淀粉生長；基本不能利用亞硝酸鹽和甲酸鹽生長。
能液化明膠，部分抗酸，不水解淀粉。
2、發(fā)酵工藝液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成(gL-1)蔗糖10，玉米漿0.5，尿素0.5,KH2PO40.1,NaCl0.1,MgSO4.7H2O0.2(3)以1％蔗糖為碳源時能制備具有較高活性的生物絮凝劑REA-11；(4)玉米漿和尿素以1∶1(質(zhì)量比)復(fù)配作為培養(yǎng)基氮源時能制備具有較高活性的生物絮凝劑REA-11；(5)液體發(fā)酵條件為25～30℃(最佳28℃)，培養(yǎng)基初始pH4.0～10.0(最佳6.0)，搖床轉(zhuǎn)速120～150轉(zhuǎn)/分(最適120轉(zhuǎn)/分)振蕩培養(yǎng)48小時。
3、生物絮凝劑REA-11的提取(6)發(fā)酵液離心，條件為6000～10000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘除去發(fā)酵液中的菌體細(xì)胞和固形物得到上清液；(7)向(6)得到的離心上清液中加入3倍體積的乙醇，4℃靜置6小時后，7000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，得到沉淀物；(8)蒸餾水溶解(7)得到的沉淀，以聚乙二醇(PEG-20000)濃縮至原發(fā)酵液體積的1/10，利用DEAE離子交換柱進行純化，得到活性洗脫液；(9)收集(8)得到的活性洗脫液，濃縮后，利用凝膠柱SephadexG-100作進一步處理，得到凝膠柱處理活性洗脫液；(10)收集(9)得到的凝膠柱處理活性洗脫液，以乙醇沉淀并洗滌；(11)蒸餾水溶解(10)得到的沉淀，利用制備高壓液相色譜柱Superdex200 HR10/30進行活性物質(zhì)的精制處理，即得產(chǎn)品REA-11。
4、生物絮凝劑的組分鑒定(12)利用高壓液相、氣相色譜、質(zhì)譜等分析測試手段，結(jié)合特征化學(xué)反應(yīng)，對精制得到的REA-11進行組成鑒定，結(jié)果表明，由Nocardia sp.WSH-A11制備的生物絮凝劑REA-11是一種以半乳糖醛酸為主體的酸性多糖，其分子中還含有極微量的蛋白組分，協(xié)助維持該生物大分子的絮凝活性。REA-11的GC-MS鑒定圖譜如附

圖1、附圖2-1和附圖2-2所示。
從土壤中篩選獲得的絮凝劑產(chǎn)生菌——Nocardia sp.WSH-A11，能以蔗糖、玉米漿、尿素等廉價原料為發(fā)酵基質(zhì)制備具有較高絮凝活性的生物絮凝劑REA-11，降低了生產(chǎn)成本。通過對REA-11的提取精制，并進而進行結(jié)構(gòu)鑒定，發(fā)現(xiàn)REA-11為一種以半乳糖醛酸為主體的蛋白聚糖類新型生物絮凝劑，目前國內(nèi)外尚未見到此類生物絮凝劑的報道。以上發(fā)現(xiàn)為指導(dǎo)設(shè)計育種和通過代謝調(diào)控優(yōu)化發(fā)酵條件提高產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)，亦為降低生物絮凝劑的生產(chǎn)成本提供了可能，促進了生物絮凝劑在工業(yè)生產(chǎn)中的實際應(yīng)用進程。
以下實例更為詳細(xì)地解釋了本發(fā)明中的某些關(guān)鍵點，為更好地理解本發(fā)明提供了依據(jù)。
實施例1分別選取幾種不同的碳源，在其他發(fā)酵工藝(如說明書所述)相同的情況下進行生物絮凝劑的發(fā)酵制備，結(jié)果如表1表1碳源對菌體生長及生物絮凝劑制備的影響碳源 絮凝率/％菌體干重/gL-1葡萄糖851.62果糖 85.3 1.58蔗糖 90.5 1.62乳糖 23.3 0.34淀粉 00.31乙酸鈉43.3 1.63乙醇 9.5 1.19結(jié)果顯示以蔗糖為碳源時，菌體生長良好(菌體干重)，絮凝活性(絮凝率)較高，而產(chǎn)品成本較低。
實施例2以1％的蔗糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，分別選擇不同的有機氮源與尿素按1∶1(質(zhì)量比)復(fù)配，在其他發(fā)酵工藝(如說明書所述)相同的情況下，進行生物絮凝劑的發(fā)酵制備，結(jié)果如表2表2復(fù)合氮源對菌體生長及生物絮凝劑制備的影響氮源 絮凝率/％ 菌體干重/gL-1尿素53.31.08酵母膏+尿素 88.23 1.63牛肉膏+尿素 65 1.01胰蛋白胨+尿素87.82 1.45蛋白胨+尿素 89.93 1.40豆餅粉+尿素 69.27 1.66玉米漿+尿素 91.89 1.70結(jié)果顯示，玉米漿和尿素以1∶1(質(zhì)量比)復(fù)配作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源時，菌體生長良好(菌體干重)，絮凝活性(絮凝率)亦較高，而產(chǎn)品成本較低。
權(quán)利要求
1.從諾卡氏菌制備的一種生物絮凝劑，本發(fā)明特征為以諾卡氏菌(Nocardia sp.)WSH-A11為絮凝劑產(chǎn)生菌，以蔗糖為碳源，玉米漿和尿素復(fù)配為氮源時能制備一種新型生物絮凝劑REA-11，(1)菌種諾卡氏菌(Nocardia sp.)WSH-A11(已保藏在武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號CCTCC NO.M201005)(2)發(fā)酵工藝液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成(gL-1)蔗糖10，玉米漿0.5，尿素0.5,KH2PO40.1,NaCl 0.1,MgSO4·7H2O 0.2a．以蔗糖為碳源時能制備具有較高活性的生物絮凝劑REA-11；b．玉米漿和尿素復(fù)配為氮源時能制備具有較高活性的生物絮凝劑REA-11；c．液體發(fā)酵條件為25～30℃(最佳28℃)，培養(yǎng)基初始pH4.0～10.0(最佳6.0)，搖床轉(zhuǎn)速120～150轉(zhuǎn)/分(最適120轉(zhuǎn)/分)振蕩培養(yǎng)48小時；(3)生物絮凝劑REA-11的提取d．發(fā)酵液離心，得到離心上清液；e．向(d)得到的離心上清液中加入三倍體積的乙醇，離心，得到沉淀物；f．蒸餾水溶解(e)得到的沉淀，利用離子交換柱處理，得到活性洗脫液；g．收集(f)得到的活性洗脫液，濃縮后，利用凝膠柱處理，得到凝膠柱處理活性洗脫液；h．收集(g)得到的凝膠柱處理活性洗脫液，以乙醇沉淀并洗滌；i．蒸餾水溶解(h)得到的沉淀，利用制備高壓液相色譜柱作進一步精制處理，即得產(chǎn)品REA-11；(4)生物絮凝劑的組分鑒定j．利用高壓液相、氣相色譜、質(zhì)譜等分析測試手段，結(jié)合特征化學(xué)反應(yīng)，對產(chǎn)品REA-11進行組成鑒定。
2.按權(quán)利要求1所述制備的生物絮凝劑，其特征為Nocardia sp.WSH-A11，在以1％蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中能制備具有較高絮凝活性的生物絮凝劑。
3.按權(quán)利要求1所述制備的生物絮凝劑，其特征為Nocardia sp.WSH-A11，在玉米漿和尿素以1∶1(質(zhì)量比)復(fù)配作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源時能制備具有較高絮凝活性的生物絮凝劑。
4.按權(quán)利要求1所述制備的生物絮凝劑，為純化生物絮凝劑REA-11，其特征為所述離心條件為6000～10000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘得到上清液。
5.按權(quán)利要求1和4所述制備的生物絮凝劑，為純化生物絮凝劑REA-11，其特征為向離心上清液中加入3倍體積的乙醇，4℃靜置6h后，7000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，得到沉淀物。
6.按權(quán)利要求1和5所述制備的生物絮凝劑，為純化生物絮凝劑REA-11，其特征為蒸餾水溶解乙醇沉淀物后，以聚乙二醇(PEG-20000)濃縮至原發(fā)酵液體積的1/10，利用DEAE離子交換柱進行純化，得到活性洗脫液。
7.按權(quán)利要求1和6所述制備的生物絮凝劑，為純化生物絮凝劑REA-11，其特征為從DEAE柱中得到的活性洗脫液，通過的凝膠柱為Sephadex G-100。
8.按權(quán)利要求1和7所述制備的生物絮凝劑，為純化生物絮凝劑REA-11，其特征為從Sephadex G-100得到的活性洗脫液，經(jīng)乙醇沉淀并洗滌后，通過的制備高壓液相色譜柱為Superdex 200 HR10/30。
9.按權(quán)利要求1所述制備的生物絮凝劑，為鑒定REA-11的分子組成，其特征為Nocardia sp.WSH-A11制備的生物絮凝劑REA-11是一種以半乳糖醛酸為主體的酸性多糖，其分子中還含有微量蛋白組分，協(xié)助維持生物大分子的絮凝活性。
全文摘要
本發(fā)明公開了從諾卡氏菌制備的一種生物絮凝劑,屬于微生物制劑技術(shù)領(lǐng)域。諾卡氏菌(Nocardia sp.)WSH－A11在以蔗糖為碳源,玉米漿和尿素復(fù)配為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中能夠制備具有較高絮凝活性的新型生物絮凝劑REA－11。該生物絮凝劑是一種以半乳糖醛酸為主要組分的蛋白聚糖。本發(fā)明為指導(dǎo)設(shè)計育種和實現(xiàn)代謝調(diào)控奠定了基礎(chǔ),推動了生物絮凝劑的工業(yè)化進程。
文檔編號C02F3/34GK1322681SQ0110804
公開日2001年11月21日 申請日期2001年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月11日
發(fā)明者陳堅, 何寧, 李寅, 倫世儀 申請人:無錫輕工大學(xué)