一種香灰菌不產(chǎn)黑色素的培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于真菌培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種香灰菌不產(chǎn)黑色素的培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 香灰菌（歷sp.)是銀耳的伴生菌能夠與銀耳發(fā)生互生作用，在銀耳生產(chǎn) 栽培過(guò)程中銀耳幾乎不具備降解木質(zhì)素、纖維素的能力，銀耳菌絲單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)緩慢且 極易變黃、膠質(zhì)化并轉(zhuǎn)化為節(jié)孢子，只有當(dāng)香灰菌和銀耳生活在一起時(shí)才能結(jié)耳。香灰菌和 銀耳互作程中香灰菌能夠有效分解基質(zhì)為銀耳生長(zhǎng)提供必需的營(yíng)養(yǎng)成分以幫助其完成其 生活史，因此香灰菌生長(zhǎng)發(fā)育好壞直接影響銀耳產(chǎn)量和質(zhì)量。在現(xiàn)代銀耳生產(chǎn)栽培中香灰 菌對(duì)基質(zhì)的分解能力直接影響到銀耳的生長(zhǎng)發(fā)育。香灰菌菌絲在生長(zhǎng)到一定階段還會(huì)有大 量黑色素生成，這對(duì)幫助銀耳提高其生存競(jìng)爭(zhēng)能力具有非常重要的意義。銀耳生產(chǎn)栽培中 香灰菌菌絲生長(zhǎng)中途停止及菌種退化等都將影響銀耳子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育而導(dǎo)致銀耳嚴(yán)重減 產(chǎn)。由于不同條件下香灰菌形態(tài)發(fā)育及黑色素產(chǎn)量差異很大，香灰菌菌絲生長(zhǎng)及黑色素的 產(chǎn)生在銀耳生產(chǎn)中起著非常重要的作用，但目前關(guān)于香灰菌產(chǎn)生的黑色素對(duì)銀耳菌絲生長(zhǎng) 及香灰菌與銀耳之間的伴生關(guān)系的影響尚不明確。該條件不影響香灰菌菌絲生長(zhǎng)速度及其 形態(tài)，不產(chǎn)生黑色素，這將為香灰菌黑色素在銀耳菌絲生長(zhǎng)及其生產(chǎn)中的作用研究奠定基 礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種香灰菌不產(chǎn)黑色素的培養(yǎng)基，解決了銀耳與香灰菌共 同培養(yǎng)過(guò)程有大量黑色素生成，這對(duì)幫助闡明香灰菌與銀耳互作過(guò)程中黑色素的作用有非 常重要的意義。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 所述的培養(yǎng)基為每升培養(yǎng)基中葡萄糖〇. 5g，硝酸銨5g，KH2P04 0 . 2g，MgS04. 7H20 0.lg，CaCl2 0.Olg，pH4. 4、0. 02mol/L醋酸鈉緩沖液100mL。在以上培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% 的瓊脂。
[0005] -種香灰菌不產(chǎn)黑色素的培養(yǎng)基在香灰菌與銀耳互作研究中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：培養(yǎng)基配方成本低、成份明確，不影響香灰菌菌絲生長(zhǎng)； 消除香灰菌黑色素對(duì)液體培養(yǎng)的銀耳菌絲分離干擾； 首次提供香灰菌不產(chǎn)黑色素的培養(yǎng)基，這對(duì)幫助闡明香灰菌與銀耳互作過(guò)程中黑色素 的作用有非常重要的意義。
【附圖說(shuō)明】
[0007] 圖1不同營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)基菌絲形態(tài)特征，左：正面，右：背面，A:高氮低碳培養(yǎng)基； B:完全培養(yǎng)基；C:高無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基；D:三低培養(yǎng)基；E:低氮培養(yǎng)基；F:吐溫20培養(yǎng)基。
[0008] 圖2不同培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)速度。
[0009] 圖3不同營(yíng)養(yǎng)條件下黑色素產(chǎn)量，*P< 0? 05; **P< 0? 01;ns,P>0. 05。
【具體實(shí)施方式】 [0010] 1材料與方法 1. 1供試菌株： 香灰菌（Hypoxylonsp.)，為福建省古田縣恒春農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供。
[0011] 供試培養(yǎng)基： 完全培養(yǎng)基：葡萄糖 20g/L，酵母粉 3g/L，蛋白胨 3g/L，KH2P041. 5g/L，MgS04 7H201. 5g/L,VBiO.lg/L； 低氮培養(yǎng)基：葡萄糖l〇g/L，硝酸銨 0? 2g/L，KH2P040 . 2g/L，MgS04 7H20 0?lg/L，CaCl20. 01g/L，VBW. 001g/L，0. 02mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4. 4)lOOmL; 吐溫 20 培養(yǎng)基：葡萄糖 10g/L，硝酸銨 0. 2g/L，KH2P040 . 2g/L，MgS04 7H20 0.lg/L，CaCl20. 01g/L，VBW. 001g/L，0. 02mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4. 4) 100mL，吐溫 20 1.Og/L; 高氮低碳培養(yǎng)基：葡萄糖 〇. 5g/L，硝酸銨 5g/L，KH2P040 . 2g/L，MgS04 7H20 0.lg/L，CaCl20. 01g/L，VB! 0? 001g/L，0. 02mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4. 4)lOOmL; 高無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：葡萄糖l〇g/L，硝酸銨 0. 2g/L，KH2P042g/L，MgS04 7H20 1. 0g/L，CaCl20.lg/L，VBi0? 001g/L，0. 02mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4. 4)lOOmL; 低氮低碳低無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(三低培養(yǎng)基):葡萄糖〇. 5g/L，硝酸銨0. 2g/L，KH2P040 . 2g/L，MgS04 7H20 0?lg/L，CaCl2 0? 01g/L，VBW. 001g/L，0? 02mol/L、pH4. 4 醋酸鈉緩沖液 100mL; 加富培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨3g/L，KH2P041. 5g/L，MgS04 7H201. 5g/L，VBAlg/L，瓊脂 20g/L，pH自然； 固體培養(yǎng)基；在以上液體培養(yǎng)基中添加2%瓊脂； 1. 3方法 1. 3. 1菌株生長(zhǎng)速度測(cè)定、菌絲形態(tài)及黑色素產(chǎn)生情況觀察實(shí)驗(yàn)：將供試菌株接種在 加富PDA平板上，24°C培養(yǎng)，用打孔器打孔菌齡相同的1. 0cm菌塊分別接種于完全培養(yǎng)基、 低氮培養(yǎng)基、高氮低碳培養(yǎng)基、高無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基、低氮低碳低無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基、吐溫20培養(yǎng)基 平板(直徑90mm)，每種培養(yǎng)基平板接一個(gè)菌塊（d=l. 0cm)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于24°C恒溫培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速度，并觀察菌落形態(tài)及黑色素產(chǎn)生情況(郭艷艷等2014)。
[0012] 黑色素的提取實(shí)驗(yàn)：用打孔器打孔菌齡相同的1. 0cm菌塊分別接種于裝有100mL 液體完全培養(yǎng)基、低氮培養(yǎng)基、高氮低碳培養(yǎng)基、高無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基、低氮低碳低無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng) 基、吐溫20培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，每種培養(yǎng)基接種10片菌塊（d=l. 0cm)，每種培養(yǎng)基設(shè) 置3個(gè)重復(fù)，24°C，120r/min搖瓶培養(yǎng)7d;過(guò)濾除菌絲，濾液用6mol/LHC1酸化至pH值為 1. 5,4°C靜置過(guò)夜。10000r/min離心15min，取沉淀，用去離子水沖洗沉淀至pH為中性后再 10000r/min離心15min，取沉淀常溫真空干燥，得香灰菌黑色素粗品（Savaetal.2001 ; Harkietal. 1997)。
[0013] 結(jié)果與分析 2. 1不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)、黑色素的影響 2. 1. 1不同培養(yǎng)基對(duì)菌株生長(zhǎng)、黑色素產(chǎn)生的影響：菌株在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度 和菌絲形態(tài)差異較大，在完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快且菌絲健壯致密，菌絲背面因?yàn)楹谏?素的產(chǎn)生明顯變黑；在高氮低碳培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較快，但菌絲纖細(xì)稀疏、潔白，菌絲背面 由于沒(méi)有黑色素產(chǎn)生不會(huì)變黑；在低氮低碳低無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較慢，沒(méi)有黑色素 產(chǎn)生，菌絲潔白，纖細(xì)稀疏；在高無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基、低氮培養(yǎng)基和吐溫20培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度 最慢，菌絲致密，菌絲顯淡黃色，同時(shí)菌絲背面因大量黑色素的產(chǎn)生而變黑。綜上說(shuō)明：培養(yǎng) 基中氮源和碳源對(duì)香灰菌菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育有很大的影響，培養(yǎng)基中合適的碳氮比和無(wú)機(jī)鹽 含量能提高菌絲活力促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)；較高無(wú)機(jī)鹽含量和吐溫20對(duì)菌絲的影響非常明顯，能 夠抑制菌絲的生長(zhǎng)（圖1，2 ;表1)。
[0014] 表1不同營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)基菌絲形態(tài)特征
注：++++表不程度尚；+++表不程度較尚；++表不程度低；+表不程度很低. 2. 1. 2不同培養(yǎng)基對(duì)黑色素產(chǎn)量的影響：菌株在6種不同液體培養(yǎng)基中黑色素產(chǎn)量 差異明顯，其在完全培養(yǎng)基上黑色素產(chǎn)量最高為0. 42g/L，在低氮培養(yǎng)基上次之，產(chǎn)量為 0. 34g/L，在高無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基和吐溫20培養(yǎng)基上產(chǎn)量較低，分別為0. 1lg/L和0. 03g/L，而在 高氮低碳培養(yǎng)基和三低培養(yǎng)基上不產(chǎn)黑色素（圖3)。與菌株在相應(yīng)固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn) 黑色素情況相一致。培養(yǎng)基中合適的營(yíng)養(yǎng)配比是菌絲生長(zhǎng)和黑色素產(chǎn)生的必要條件，碳源 不足時(shí)完全抑制了黑色素的產(chǎn)生，氮源對(duì)菌株黑色素生產(chǎn)影響不大。
[0015] 綜上研究表明在高氮低碳培養(yǎng)基(葡萄糖0. 5g/L，硝酸銨5g/L，KH2P040. 2g/ L，MgS04. 7H20 0?lg/L，CaC120. 01g/L，VB1 0? 001g/L，0? 02mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4. 4) lOOmL;)中香灰菌不產(chǎn)黑色素，同時(shí)不影響菌絲生長(zhǎng)速度及菌絲形態(tài)。
[0016] 該發(fā)明通過(guò)研究不同培養(yǎng)條件下香灰菌菌絲的生長(zhǎng)速度、菌絲形態(tài)及產(chǎn)黑色素特 性，獲得了一種抑制香灰菌產(chǎn)黑色素的培養(yǎng)基，條件為：每升培養(yǎng)基中葡萄糖0. 5g，硝酸銨 5g，KH2P04 0? 2g，MgS04. 7H20 0?lg，CaCl2 0? 01g，0? 02mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4. 4) 100mL。 此條件下香灰菌不產(chǎn)黑色素。
[0017] 目前尚未見通過(guò)相關(guān)研究報(bào)道，該條件的獲得為銀耳生產(chǎn)栽培中通過(guò)培養(yǎng)條件調(diào) 節(jié)香灰菌菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲形態(tài)及黑色素的產(chǎn)生提供重要的理論依據(jù)，同時(shí)為今后關(guān)于 香灰菌與銀耳相互作用關(guān)系中黑色素是否影響銀耳生長(zhǎng)發(fā)育的研究奠定基礎(chǔ)。
[0018] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種香灰菌不產(chǎn)黑色素的培養(yǎng)基，其特征在于：所述的培養(yǎng)基為每升培養(yǎng)基中葡萄 糖 〇? 5g，硝酸銨 5g，KH2PO4 0? 2g，MgSO4. 7H20 0? lg，CaCl2 〇? Olg，pH4. 4、0. 02mol/L 醋酸鈉 緩沖液l〇〇mL。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種香灰菌不產(chǎn)黑色素的培養(yǎng)基，其特征在于：在以上培養(yǎng) 基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂。3. 如權(quán)利要求1所述的一種香灰菌不產(chǎn)黑色素的培養(yǎng)基在香灰菌與銀耳互作研究中 的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于真菌培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種香灰菌不產(chǎn)黑色素的培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基為每升培養(yǎng)基中葡萄糖0.5g，硝酸銨5g，KH2PO4？0.2g，MgSO4.7H2O？0.1g，CaCl2？0.01g，pH4.4、0.02mol/L醋酸鈉緩沖液100mL，此條件下香灰菌不產(chǎn)黑色素。目前尚未見通過(guò)相關(guān)研究報(bào)道，該條件的獲得為銀耳生產(chǎn)栽培中通過(guò)培養(yǎng)條件保證香灰菌菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲形態(tài)及調(diào)節(jié)黑色素的產(chǎn)生提供重要的理論依據(jù)，同時(shí)為今后關(guān)于香灰菌與銀耳相互作用關(guān)系中黑色素是否影響銀耳生長(zhǎng)發(fā)育的研究奠定基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N1/14, C12Q1/02
【公開號(hào)】CN105112297
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510472952
【發(fā)明人】孫淑靜, 馮宏昌, 單書凱, 陳文星, 賴春芬, 胡開輝
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開日】2015年12月2日
【申請(qǐng)日】2015年8月5日