用于提高真菌產(chǎn)β?葡萄糖醛酸苷酶酶活的發(fā)酵培養(yǎng)基及方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種用于提高真菌產(chǎn)β?葡萄糖醛酸苷酶酶活的發(fā)酵培養(yǎng)基及方法。該發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯和水的煮沸物過(guò)濾所得濾液中加入促進(jìn)劑和水所得的溶液，所述促進(jìn)劑為甘草酸或其鹽。利用本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基和方法分別將產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)Li?3、嗜松籃狀菌(Talaromyces pinophilum)Li?93、土曲霉(Aspergillus terreus)Li?20和焦曲霉(Aspergillus ustus)Li?62進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)β?葡萄糖醛酸苷酶的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)上述各真菌發(fā)酵酶活單位與現(xiàn)有發(fā)酵方法所得相比提高了100?600％，發(fā)酵時(shí)間提前了36?60小時(shí)。因此，本發(fā)明提供的真菌產(chǎn)β?葡萄糖醛酸苷酶的發(fā)酵培養(yǎng)基及方法具有操作簡(jiǎn)單、成本廉價(jià)、發(fā)酵酶活單位高、產(chǎn)酶時(shí)間短的特點(diǎn)。CGMCC No.1176520151130
【專(zhuān)利說(shuō)明】
用于提高真菌產(chǎn)e-葡萄糖酵酸昔酶酶活的發(fā)酵培養(yǎng)基及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于提高真菌產(chǎn)0-葡萄糖醒酸巧酶酶活 的發(fā)酵培養(yǎng)基及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 0-葡萄糖醒酸巧酶(0-旨111(3111'〇]11(1日36,6。3.2.1.31)是一類(lèi)能催化0-葡萄糖醒酸 酸巧鍵水解的糖巧酶，廣泛存在于人體、動(dòng)物、植物和微生物中。e-葡萄糖醒酸巧酶最早被 發(fā)現(xiàn)存在于人體和動(dòng)物的各種組織和體液中，尤其在肝、脾和腎上腺中的含量較高，早期人 們發(fā)現(xiàn)該酶與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，目前通過(guò)檢測(cè)該酶在特定部位的水平已成為腫瘤診 斷治療的一種重要手段。此外基于該酶的水解特性，己有研究將該酶用于腫瘤酶解前體藥 導(dǎo)向治療。很多抗腫瘤藥物具毒性高，水溶性差，體內(nèi)分布無(wú)祀向性等缺點(diǎn)，而將運(yùn)些藥物 進(jìn)行葡萄糖醒酸化修飾制成前體藥物后，上述缺陷得到改善。利用該e-葡萄糖醒酸巧酶在 腫瘤細(xì)胞和祀器官的高表達(dá)，使前體藥物在到達(dá)作用部位后，再在該酶的作用下水解釋放 出原型藥物并發(fā)生作用，提高藥物治療的效果，降低毒副作用。細(xì)菌來(lái)源的e-葡萄糖醒酸巧 酶自發(fā)現(xiàn)W來(lái)已得到很好的應(yīng)用。例如大腸桿菌來(lái)源的e-葡萄糖醒酸巧酶可水解底物形成 巧光或有色物質(zhì)，因此可利用運(yùn)一特性檢測(cè)飲用水或各種食品中大腸桿菌的污染。此外基 于運(yùn)一特性，e-葡萄糖醒酸巧酶常被作為報(bào)告基因，用于轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)記和目的基因表達(dá) 定位，成為相關(guān)科學(xué)研究工作的工具酶。
[0003] 隨著人們對(duì)天然化合物的認(rèn)識(shí)和研究，進(jìn)來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者已利用0-葡萄糖醒酸巧酶 水解甘草酸（Glycyrrhizin，化）最外側(cè)的(6-l，2糖巧鍵生成單葡萄糖醒酸基甘草次酸 ((Gly巧rrhetinic acid monoglu州;ronide，GAMG)) oGAMG的甜度是化的5倍，是薦糖的 1000 多倍，是一種低熱度，高甜度的新型甜味劑。GAMG不僅和化一樣具有消炎、抗癌，抗腫瘤、抗 變態(tài)、保肝護(hù)肝及增強(qiáng)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的功效，而且由于其極性適中，易于透過(guò)細(xì)胞膜，生物 利用度更高，生物安全性更好等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是甘草酸良好的替代品。甘草酸次酸 (Glycyrrhetinic acid，GA)是甘草酸水解糖基與巧元連接的0-1，2糖巧鍵生成的不含糖基 的化合物，其是甘草酸分子中主要的生物活性部分，它同樣具有具有消炎、抗變態(tài)、保肝、治 療肝炎抑制肝癌、利尿、抗干擾素誘生劑及增強(qiáng)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的功效。由于其為脂溶性，尤 其適合添加到膏狀等油性較強(qiáng)的化妝品中。研究表明甘草次酸不僅有良好的美白功能，而 且結(jié)合其消炎的功能，能夠起到潤(rùn)膚和清除氧自由基等多種功效而在化妝品領(lǐng)域中具有廣 泛應(yīng)用。
[0004] 目前已發(fā)現(xiàn)來(lái)自真菌的能轉(zhuǎn)化化的e-葡萄糖醒酸巧酶較多，例如發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng) 201410088328.3記載的一株保藏號(hào)為CGMCC NO. 5446的產(chǎn)紫青霉（Penici Ilium pu巧urogenum Li-3)Li-3菌株，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的一株保藏號(hào)為CGMCC No. 11765的嗜松籃狀菌 (化laromyces pino地ilun〇Li-93菌株，文獻(xiàn)"王小艷石河子大學(xué)碩：t論文，2007"報(bào)道±曲 霉(Aspergillus terreus)菌株Li-20和焦曲霉菌株(Aspergillus us1:us)Li-62，它們都可 W產(chǎn)生e-葡萄糖醒酸巧酶，可將化轉(zhuǎn)化成GAMG和/或GA，但是采用現(xiàn)有培養(yǎng)基對(duì)運(yùn)些菌株進(jìn) 行發(fā)酵生產(chǎn)e-葡萄糖醒酸巧酶時(shí)存在所產(chǎn)酶活低，且產(chǎn)酶時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)從而限制了該酶的 利用。
[0005] 因此本領(lǐng)域亟需提供一種優(yōu)化的菌株培養(yǎng)基及發(fā)酵方法，W提高發(fā)酵酶活，降低 GAMG或GA的制備成本，從而使該酶能應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于本領(lǐng)域上述不足和需求，本發(fā)明提供一種提高上述真菌產(chǎn)e-葡萄糖醒酸巧酶 酶活的發(fā)酵培養(yǎng)基及方法。該方法具有操作簡(jiǎn)單、低投入、高產(chǎn)出的優(yōu)點(diǎn)，使e-葡萄糖醒酸 巧酶發(fā)酵酶活得到大幅度提高。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[000引本發(fā)明提供一種用于提高真菌產(chǎn)0-葡萄糖醒酸巧酶酶活的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，其包 括在馬鈴馨和水的煮沸產(chǎn)物過(guò)濾所得濾液中，加入促進(jìn)劑和水所得的溶液。
[0009] 所述促進(jìn)劑為甘草酸或其鹽，它們可作為碳源被利用，在低濃度易利用碳源存在 時(shí)，真菌為了利用甘草酸或其鹽從而迫使自身產(chǎn)生大量e-葡萄糖醒酸巧酶水解甘草酸或其 鹽得到可利用的小分子葡萄糖醒酸或其鹽。
[0010] 所述馬鈴馨與所述溶液的質(zhì)量體積比為lg:5~50mL。本發(fā)明所提供的發(fā)酵產(chǎn)酶培 養(yǎng)基與現(xiàn)有普通培養(yǎng)基的區(qū)別之一是不含葡萄糖，由于真菌產(chǎn)e-葡萄糖醒酸巧酶時(shí)存在碳 阻遏現(xiàn)象，容易利用的碳源大量存在時(shí)，抑制了真菌產(chǎn)e-葡萄糖醒酸巧酶。而常規(guī)馬鈴馨液 體培養(yǎng)基中含有葡萄糖，且其馬鈴馨與水溶液的比例為lg:5mL，碳源過(guò)于豐富，不利于0-葡 萄糖醒酸巧酶的產(chǎn)生，因此稀釋1-10倍時(shí)，緩解了碳阻遏從而利于真菌產(chǎn)e-葡萄糖醒酸巧 酶。
[0011] 進(jìn)一步地，所述促進(jìn)劑在所述溶液中的濃度優(yōu)選為0.5-10g/L，促進(jìn)劑濃度過(guò)低時(shí) (<0.5g/L)，不易被真菌利用，濃度過(guò)高時(shí)(〉10g/L)，增加了發(fā)酵產(chǎn)酶成本。
[0012] 進(jìn)一步地，所述促進(jìn)劑具體為甘草酸單錠鹽。甘草酸單錠鹽比甘草酸的水溶解性 好。
[001引在本發(fā)明一些具體的實(shí)施例中，所述真菌選自由產(chǎn)紫青霉（Penicillium purpurogenum)菌株Li-3、嗜松籃狀菌（Talaromyces pinophilum)菌株Li-93、±曲霉 (Aspergillus terreus)菌株Li-20、焦曲霉菌株(Aspergillus ustus化i-62構(gòu)成的群組。
[0014] 本發(fā)明還提供一種用于提高真菌產(chǎn)(6-葡萄糖醒酸巧酶酶活的發(fā)酵產(chǎn)酶方法，該方 法的步驟包括:采用所述的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基對(duì)所述真菌的種子液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)。
[0015] 在本發(fā)明的一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述步驟還包括，在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)之前，將所 述真菌的抱子進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)得到種子液。
[0016] 在一些具體的實(shí)施例中，所擴(kuò)繁培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選為馬鈴馨和水的煮沸產(chǎn)物過(guò)濾 所得濾液中加入葡萄糖和水所得的溶液;所述馬鈴馨與所述溶液的質(zhì)量體積比為lg:5~ 50mL。與常規(guī)馬鈴馨液體培養(yǎng)基（馬鈴馨與水溶液的比例為lg:5mL)相比，稀釋了 1-10倍， 擴(kuò)繁培養(yǎng)種子液時(shí)，其培養(yǎng)基成份需接近發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，否則易導(dǎo)致產(chǎn)酶培養(yǎng)時(shí)的延滯 期過(guò)長(zhǎng)，增加了產(chǎn)酶培養(yǎng)時(shí)間，從而增加酶制備成本。
[0017] 所述葡萄糖在所述溶液中的濃度為l-20g/L，葡萄糖濃度過(guò)低時(shí)，易導(dǎo)致種子液生 物量過(guò)低，影響真菌產(chǎn)酶量;過(guò)高時(shí)，種子液培養(yǎng)結(jié)束后殘余葡萄糖被帶入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)過(guò) 程中，使易利用碳源濃度過(guò)高，阻遏e-葡萄糖醒酸巧酶的產(chǎn)生。
[0018]在一些實(shí)施例中，具體地，所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)的條件為:發(fā)酵溫度15-35C、振蕩或 攬拌速度為100-300巧m、發(fā)酵時(shí)間為24-16她。
[0019]在本發(fā)明一些具體的實(shí)施例中，所述真菌選自由產(chǎn)紫青霉（Penicillium purpurogenum)菌株Li-3、嗜松籃狀菌（Talaromyces pinophilum)菌株Li-93、±曲霉 (Aspergillus terreus)菌株Li-20、焦曲霉菌株(Aspergillus ustus化i-62構(gòu)成的群組。
[0020]本發(fā)明對(duì)上述提高產(chǎn)(6-葡萄糖醒酸巧酶酶活的發(fā)酵培養(yǎng)基及對(duì)應(yīng)的發(fā)酵方法進(jìn) 行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵酶活單位與現(xiàn)有發(fā)酵方法所得相比提高了 100-600%，發(fā)酵時(shí)間提前了 36-60小時(shí)。由此可見(jiàn)，本發(fā)明提供的0-葡萄糖醒酸巧酶發(fā)酵方法具有操作簡(jiǎn)單、成本廉價(jià)、 且發(fā)酵酶活單位高，產(chǎn)酶時(shí)間短的特點(diǎn)。
[0021 ] 所述嗜松籃狀菌(Talaromyces pino地il皿)菌株Li-93的保藏信息如下：
[0022] 菌種保藏名稱(chēng):Li-93
[0023] 保藏號(hào):CGMCC No. 11765
[0024] 分類(lèi)命名:嗜松籃狀菌
[00巧]拉下名：Tala;romyces pino地il皿
[0026] 保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、
[0027] 保藏單位地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào) [002引保藏日期:2015年11月30日
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，W下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常 規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030] 生物材料的來(lái)源及記載出處 [0031 ]本發(fā)明所用到的兩株真菌：
[0032] 產(chǎn)紫青霉（Peni C i 11 ium purpurogenum) Li-3菌株記載于發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng) 201410088328.3中，其保藏號(hào)為CGMCC No. 5446;
[0033] 嗜松籃狀菌(Talaromyces pino地ilun〇Li-93菌株記載于發(fā)明人同日提交的另一 篇發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)文件中，其保藏號(hào)為CGMCC No. 11765,保藏信息如上所述。
[0034] 上曲霉(Aspergillus terreus)菌株Li-20記載于文獻(xiàn)："王小艷石河子大學(xué)碩± 論文，2〇〇r
[00巧]焦曲霉(Aspergillus US化S)菌株Li-62記載于文獻(xiàn)："王小艷石河子大學(xué)碩±論 文，2〇〇r。
[0036] 本發(fā)明中催化化僅生成GAMG的0-葡萄糖醒酸巧酶酶活定義：每分鐘生成Inmol GAMG所需的酶量為一個(gè)活力單位化)。
[0037] 本發(fā)明中催化化僅生成GA的的0-葡萄糖醒酸巧酶酶活定義:每分鐘生成Inmol GA 所需的酶量為一個(gè)活力單位化)。
[0038] 本發(fā)明中催化化同時(shí)生成GAMG和GA的0-葡萄糖醒酸巧酶酶活定義：每分鐘生成 Inmol GA+GAMG所需的酶量為一個(gè)活力單位化）。
[0039] 實(shí)施例1、采用本發(fā)明1號(hào)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶
[0040] 將產(chǎn)紫青霉Li-3、嗜松籃狀菌Li-93、±曲霉Li-20和焦曲霉Li-62分別進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn) 酶培養(yǎng)，具體操作過(guò)程如下：
[0041 ]將產(chǎn)紫青霉Li-3、嗜松籃狀菌Li-93、±曲霉Li-20和焦曲霉Li-62的抱子分別接于 馬鈴馨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于30°C、200rpm的搖床上培養(yǎng)4她。然后W5%的接種量接入二 級(jí)種子液培養(yǎng)基中，于30°C、200巧m的搖床上培養(yǎng)2地后得到上述各真菌的二級(jí)種子液。
[0042] 二級(jí)種子液培養(yǎng)基：稱(chēng)取去皮馬鈴馨200g，加水800mL，煮沸30分鐘左右，紗布過(guò) 濾，加入Ig葡萄糖，溶解后加水至2000mL，自然抑，121°C高溫滅菌15min。
[0043] 將上述各真菌的二級(jí)種子液WlO%的接種量分別接入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于30 °C、200rpm的搖床上培養(yǎng)4她時(shí)±曲霉Li-20達(dá)到最高酶活為13.21U/mg，培養(yǎng)60h時(shí)產(chǎn)紫青 霉Li-3、嗜松籃狀菌Li-93和焦曲霉Li-62達(dá)到最高酶活，分別為10.1抓/mg，15.13U/mg和 15.35U/mg,。
[0044] 1號(hào)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基制備方法:稱(chēng)取去皮馬鈴馨200g，加水800mL，煮沸30分鐘左 右，紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入0.5g甘草酸單錠鹽、溶解后加水至lOOOmL，自然抑，12rC高溫 滅菌15min。
[0045] 實(shí)施例2、采用本發(fā)明2號(hào)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶
[0046] 將產(chǎn)紫青霉Li-3、嗜松籃狀菌Li-93、±曲霉Li-20和焦曲霉Li-62分別進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn) 酶培養(yǎng)，具體操作過(guò)程如下：
[0047] 將產(chǎn)紫青霉Li-3、嗜松籃狀菌Li-93、±曲霉Li-20和焦曲霉Li-62的抱子分別接于 馬鈴馨葡萄糖液體培養(yǎng)基液培養(yǎng)基中，于30°C、200rpm的搖床上培養(yǎng)4她。然后W5%的接種 量接入二級(jí)種子液培養(yǎng)基中，于30°C、200rpm的搖床上培養(yǎng)24h后得到上述各真菌的二級(jí)種 子液。
[004引二級(jí)種子液培養(yǎng)基：稱(chēng)取去皮馬鈴馨200g，加水800mL，煮沸30分鐘左右，紗布過(guò) 濾，加入5g葡萄糖，溶解后加水至2000mL，自然抑，121°C高溫滅菌15min。
[0049] 將上述各真菌的二級(jí)種子液WlO%的接種量分別接入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于30 °C、2(K)rpm的搖床上培養(yǎng)至3611時(shí)±曲霉Li-20達(dá)到最高酶活為16.34U/mg，培養(yǎng)至4她時(shí)產(chǎn) 紫青霉Li-3、嗜松籃狀菌Li-93和焦曲霉Li-62達(dá)到最高酶活，分別為14.1抓/mg、19.47U/mg 和20.42U/mg。
[0050] 2號(hào)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基制備方法:稱(chēng)取去皮馬鈴馨200g，加水800mL，煮沸30分鐘左 右，紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入8g甘草酸單錠鹽、溶解后加水至2000mL，自然抑，12rC高溫滅 菌15min(此培養(yǎng)基中馬鈴馨與溶液的質(zhì)量體積比為：Ig: 10ml)。
[0051] 實(shí)施例3、采用本發(fā)明3號(hào)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶
[0化2]將產(chǎn)紫青霉Li-3、嗜松籃狀菌Li-93、±曲霉Li-20和焦曲霉Li-62分別進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn) 酶培養(yǎng)，具體操作過(guò)程如下：
[0化3]將產(chǎn)紫青霉Li-3、嗜松籃狀菌Li-93、±曲霉Li-20和焦曲霉Li-62的抱子分別接于 馬鈴馨葡萄糖液體培養(yǎng)基液培養(yǎng)基中，于30°C、200rpm的搖床上培養(yǎng)4她。然后W5%的接種 量接于二級(jí)種子液培養(yǎng)基中，于30°C、200rpm的搖床上培養(yǎng)24h后得到上述各真菌的二級(jí)種 子液。
[0054]二級(jí)種子液培養(yǎng)基制備方法:去皮馬鈴馨200g，加水lOOOmL，煮沸30分鐘左右，紗 布過(guò)濾，加入8g葡萄糖，溶解后加水至5000mL，自然抑，121°C高溫滅菌15min。
[0055] 將上述各真菌的二級(jí)種子液WlO%的接種量接入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于3(TC、 2(K)rpm的搖床上培養(yǎng)至3加時(shí)產(chǎn)紫青霉Li-3、嗜松籃狀菌^-93和±曲霉Li-20達(dá)到最高酶 活，分別為16.54U/mg、23.7抓/mg和15.43U/mg，培養(yǎng)至4化時(shí)焦曲霉Li-62達(dá)到最高酶活為 18.81U/mg〇
[0056] 3號(hào)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的制備方法:稱(chēng)取去皮馬鈴馨200g，加水800mL，煮沸30分鐘左 右，紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入25g甘草酸單錠鹽、溶解后補(bǔ)足水至5000mL，自然抑，m°C高溫 滅菌15min。
[0057] 實(shí)施例4、采用本發(fā)明4號(hào)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶
[0化引將產(chǎn)紫青霉Li-3、嗜松籃狀菌Li-93、±曲霉Li-20、和焦曲霉Li-62分別進(jìn)行培養(yǎng) 及發(fā)酵產(chǎn)酶，具體操作過(guò)程如下：
[0059] 將上述各菌的抱子分別接于馬鈴馨葡萄糖液體培養(yǎng)基液培養(yǎng)基中，于30°C、 200巧m的搖床上培養(yǎng)4她。然后W5%的接種量接于二級(jí)種子液培養(yǎng)基中，于30°C、200rpm的 搖床上培養(yǎng)2地后得到上述各真菌的二級(jí)種子液。
[0060] 二級(jí)種子液培養(yǎng)基制備方法:去皮馬鈴馨200g，加水lOOOmL，煮沸30分鐘左右，紗 布過(guò)濾，加入8g葡萄糖，溶解后加水至5000mL，自然抑，121°C高溫滅菌15min。
[0061] 將上述各真菌的二級(jí)種子液WlO%的接種量接入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于3(TC、 20化pm的搖床上培養(yǎng)至36h時(shí)，嗜松籃狀菌^-93和±曲霉Li-20達(dá)到最高酶活，分別為 19.22U/mg和14.02U/mg;培養(yǎng)至4化時(shí)，產(chǎn)紫青霉Li-3和焦曲霉Li-62達(dá)到最高酶活，分別為 14.5011/111邑和15.7抓/111邑。
[0062] 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基制備方法:稱(chēng)取去皮馬鈴馨200g，加水800mL，煮沸30分鐘左右，紗 布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入lOOg甘草酸單錠鹽、溶解后補(bǔ)足水至lOOOOmL，自然抑，12rc高溫滅 菌15mi。
[0063] 實(shí)施例1-4中的甘草酸單錠鹽也可W用甘草酸或其它甘草酸鹽代替。
[0064] 對(duì)比例1、W改良察氏培養(yǎng)基為發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基
[0065] 由于真菌產(chǎn)0-葡萄糖醒酸巧酶時(shí)具有碳代謝阻遏現(xiàn)象，在葡萄糖、薦糖等優(yōu)先碳 源存在的情況下，即使添加甘草酸單錠鹽為誘導(dǎo)劑所產(chǎn)e-葡萄糖醒酸巧酶的酶活也極低。 因此本對(duì)比例展示的是最初選擇W甘草酸單錠鹽為單一碳源的改良察氏培養(yǎng)基為發(fā)酵產(chǎn) 酶培養(yǎng)基生產(chǎn)e-葡萄糖醒酸巧酶的方法：
[0066] 將產(chǎn)紫青霉菌株Li-3、嗜松籃狀菌株Li-93、±曲霉Li-20和焦曲霉Li-62的抱子分 別接于一級(jí)種子液培養(yǎng)基中，于30°C、200巧m的搖床上培養(yǎng)72h。然后W5%的接種量接于二 級(jí)種子液培養(yǎng)基中，于30°C、200巧m的搖床上培養(yǎng)2地，得到上述各真菌的二級(jí)種子液。
[0067] 一級(jí)種子液和二級(jí)種子液培養(yǎng)基為:NaN〇3 3g/L，K2HP〇4 lg/L，MgS〇4 ? 7出0 0.5g/ 1，1((：10.5邑/1，尸65〇4?7出0 0.01邑/1，葡萄糖5邑/1，自然口山
[006引將上述各真菌的二級(jí)種子液WlO%的接種量接入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于3(TC、 20化pm的搖床上培養(yǎng)至60h時(shí)，±曲霉Li-20達(dá)到最高酶活為4. lOU/mg;培養(yǎng)至72h時(shí)，嗜松 籃狀菌Li-93和焦曲霉Li-62達(dá)到最高酶活，分別為5.92U/mg和6.45U/mg;培養(yǎng)至8地時(shí)，產(chǎn) 紫青霉Li-3達(dá)到最高酶活2.31U/mg，
[0069]發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(改良察氏培養(yǎng)基）：甘草酸單錠鹽3g/L，化N03 3g/L，K2HP化Ig/ L，KC1 lg/L，MgS〇4 ? 7出0 0.5g/LJe2S〇4 ? 7出0 0.01g/L，pH 5.0
[0070] 對(duì)比例2、W馬鈴馨葡萄糖液體培養(yǎng)基為發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基
[0071] 將產(chǎn)紫青霉Li-3、嗜松籃狀菌Li-93、±曲霉Li-20和焦曲霉Li-62的抱子分別接于 馬鈴馨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于30°C、200rpm的搖床上培養(yǎng)4她。然后W10%的接種量接于 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于30°C、200rpm的搖床上培養(yǎng)至84h時(shí)，±曲霉Li-20達(dá)到最高酶活為 7.8抓/mg，培養(yǎng)至9加時(shí)產(chǎn)紫青霉Li-3、嗜松籃狀菌Li-93和焦曲霉Li-62達(dá)到最高酶活，分 別為7.83U/mg，10.32U/mg和9.24U/mg。
[0072] 本對(duì)比例中用到的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常用的發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴馨葡萄糖液 體培養(yǎng)基中添加 5g/L的甘草酸單錠鹽制成的培養(yǎng)基。
[0073] 所述馬鈴馨葡萄糖液(固）體培養(yǎng)基制備方法如下：
[0074] 稱(chēng)取去皮馬鈴馨200g，加水800mL，煮沸30分鐘左右，紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入20g 葡萄糖、溶解后補(bǔ)足水至lOOOmL，自然pH，若制成固體培養(yǎng)基則向其中加入20g瓊脂，121°C 高溫滅菌15-20min(此培養(yǎng)基中馬鈴馨與溶液的質(zhì)量體積比為，1 g: 5ml)。
[00對(duì)對(duì)比結(jié)果分析:
[0076] 上述實(shí)施例1-4與對(duì)比例1-2的對(duì)比結(jié)果如下表1所示，可W看出本發(fā)明提供的1-4 號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基的產(chǎn)酶效果顯著優(yōu)于對(duì)比例1-2的現(xiàn)有培養(yǎng)基。尤其是，實(shí)施例3中W不含葡 萄糖的馬鈴馨液體培養(yǎng)基稀釋5倍加甘草酸單錠鹽制成發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基時(shí)，產(chǎn)紫青霉Li-3 菌株和嗜松籃狀菌Li-93菌株發(fā)酵所得(6-葡萄糖醒酸巧酶單位酶活分別比對(duì)比例1中W改 良察氏培養(yǎng)基做為發(fā)酵培養(yǎng)基和對(duì)比例2中W馬鈴馨葡萄糖液體培養(yǎng)基加甘草酸單錠鹽作 為發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基時(shí)分別提高了 616.02 %和111.24 %，301.18 %和130.14 % ;實(shí)施例2中的 ±曲霉Li-20和焦曲霉Li-62產(chǎn)0-葡萄糖醒酸巧酶單位酶活分別比對(duì)比例1和對(duì)比例2中分 別提高了298.54%和107.89% ,216.59%和121.00%，且本發(fā)明提供的培養(yǎng)基和發(fā)酵方法 使上述各真菌達(dá)到最高酶活的時(shí)間比后兩者提前了 36-60小時(shí)。
[0077] 表1:本發(fā)明提供的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基和現(xiàn)有培養(yǎng)基的產(chǎn)酶效果比較 [007引
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于提高真菌產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶酶活的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，其特征在于，包括在馬 鈴薯和水的煮沸物過(guò)濾所得濾液中，加入促進(jìn)劑和水所得的溶液； 所述促進(jìn)劑為甘草酸或其鹽； 所述馬鈴薯與所述溶液的質(zhì)量體積比為1 g: 5~50mL。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，其特征在于，所述促進(jìn)劑在所述溶液中的濃 度為 0.5-10g/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，其特征在于，所述促進(jìn)劑為甘草酸單銨 鹽。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，其特征在于，所述真菌選自由產(chǎn)紫青 霉（Penicillium purpurogenum)菌株 1^-3、嗜松籃狀菌（丁&1&1'〇1115^6 3 pinophilum)菌株 Li_93、土曲霉（Aspergillus terreus)菌株Li_20、焦曲霉菌株（Aspergillus ustus)Li_62 構(gòu)成的群組。5. 用于提高真菌產(chǎn)β_葡萄糖醛酸苷酶酶活的發(fā)酵產(chǎn)酶方法，其特征在于，包括:采用權(quán) 利要求1-3任一所述的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基對(duì)所述真菌的種子液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)酵產(chǎn)酶方法，其特征在于，還包括，在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)之前，將 所述真菌的孢子進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)得到種子液。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵產(chǎn)酶方法，其特征在于，所述擴(kuò)繁培養(yǎng)的培養(yǎng)基為馬鈴薯 和水的煮沸產(chǎn)物過(guò)濾所得濾液中加入葡萄糖和水所得的溶液;所述馬鈴薯與所述溶液的質(zhì) 量體積比為lg:5~50mL;所述葡萄糖在所述溶液中的濃度為l-20g/L。8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)的條件為:發(fā)酵 溫度15-35°(：、振蕩或攪拌速度為100-300印111、發(fā)酵時(shí)間為24-16811。9. 根據(jù)權(quán)利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述真菌選自由產(chǎn)紫青霉 (Penicillium purpurogenum)菌株Li_3、嗜松籃狀菌（Talaromyces pinophilum)菌株Li-93、土曲霉 (Aspergillus terreus) 菌株 Li-20、焦曲 霉菌株(Aspergillus us tus)Li-62構(gòu) 成的群組。
【文檔編號(hào)】C12R1/66GK106047839SQ201610245024
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年4月19日
【發(fā)明人】李春, 徐贏華, 賈錦彤, 呂波, 馮旭東
【申請(qǐng)人】北京理工大學(xué), 南京精微生物科技有限公司