一株假諾卡氏菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一株具有抑菌活性的假諾卡氏菌及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 放線菌是創(chuàng)造系數(shù)較高的一類藥源微生物資源，隨著微生物樣品采集和培養(yǎng)技術(shù) 的發(fā)展，大量具有特色的海洋放線菌被發(fā)現(xiàn)和研究。近年來一系列研究表明，從海洋放線菌 中發(fā)現(xiàn)新的化學(xué)實(shí)體和生物活性化合物的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了陸生放線菌，而且，海洋放線菌 次生代謝產(chǎn)物往往結(jié)構(gòu)骨架新穎，生物合成途徑與高等生物迴異，因此，來自海洋環(huán)境的放 線菌，將是新的生理活性化合物的極好源泉。
[0003] 中國專利CN102296039A公開一種假諾卡氏菌及利用其制備Deownyboquinone 的方法。假諾卡氏菌Pseudonocardiasp.SCSIO01299于2011年7月18日保藏于 中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（CCTCC)，保藏編號為CCTCCN0:M2011255。能產(chǎn)生抗生 素Deoxynyboquinone,可在制備Deoxynyboquinone,為生產(chǎn)具有抗腫瘤活性的抗生素 Deoxynyboquinone提供方法。
[0004] 中國專利CN103898004A公開假諾卡氏菌及其發(fā)酵生產(chǎn)骨化二醇的方法，該假諾 卡氏菌Pseudonocardiaautotrophica，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中屯、，保藏編號CGMCCNo. 7935。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的目的是提供一株具有抑菌活性的假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp.)GY0556及其應(yīng)用。
[0006] 所述假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556,已于2015年4月23日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中 國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101,保藏中屯、登記入冊編號：CGMCCNo. 10737。
[0007] 所述假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556可在改良2216E培養(yǎng)基上生長，最 適生長溫度為30~35°C，最適生長環(huán)境抑值為8~9,最適鹽濃度為0~3%，為好氧菌。
[0008] 所述假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556為革蘭氏陽性菌，硝酸鹽還原試 驗(yàn)、過氧化氨酶試驗(yàn)、屯葉巧、明膠和P-硝基苯-0 -D-化喃半乳糖巧水解試驗(yàn)呈陽性，嗎I噪 產(chǎn)生試驗(yàn)、氧化酶和脈酶試驗(yàn)為陰性。
[0009] 由于所述假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556具有較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌譜 較廣，其代謝產(chǎn)物含有大量的抑菌活性成分，因此所述假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp.) GY0556可在制備抑菌劑中應(yīng)用。
【附圖說明】
[0010] 圖1為本發(fā)明所述假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556在改良2216E培養(yǎng) 基上的宏觀形態(tài)。
[0011] 圖2為本發(fā)明所述假諾卡氏菌（PseudonocardiaSP.)GY0556在改良2216E培養(yǎng) 基上的顯微鏡照片。
[0012] 圖3為本發(fā)明所述假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556及部分相關(guān)菌株依 據(jù)16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
【具體實(shí)施方式】 陽〇1引 實(shí)施例1
[0014] 本實(shí)施例假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556為革蘭氏陽性菌，參照《伯杰 細(xì)菌鑒定手冊》對假諾卡氏菌GY0556進(jìn)行生理生化鑒定：假諾卡氏菌GY0556硝酸鹽還原 試驗(yàn)，過氧化氨酶試驗(yàn)，屯葉巧、明膠和P-硝基苯-0 -D-化喃半乳糖巧水解試驗(yàn)呈陽性，嗎I 噪產(chǎn)生試驗(yàn)、氧化酶和脈酶試驗(yàn)為陰性。
[0015] 本發(fā)明假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556可在改良2216E培養(yǎng)基上生長， 假諾卡氏菌GY0556最適生長溫度為30~35°C，最適生長環(huán)境抑值為8~9,最適鹽濃度 為0~3%，為好氧菌。
[0016] 改良2216E培養(yǎng)基（1000血）由5g蛋白腺，Ig酵母提取物，15g瓊脂粉和余量的海 水組成，調(diào)節(jié)抑至7. 4~7. 6,于121度高壓滅菌30min。
[0017] 實(shí)施例2
[0018] 本實(shí)施例假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556從7118m深的西太平洋海底 沉積物中分離得到。具體分離步驟如下：稱取約2g沉積物樣品，加入15ml含有50yg/mL 糞晚酬酸和75yg/mL制霉菌素的無菌陳海水中，28°C富集培養(yǎng)2周，吸取200y1富集培養(yǎng) 液涂布到改良2216E培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)3~4周，根據(jù)長出菌落的形態(tài)特征，挑取形態(tài)特 征不同的菌落進(jìn)行劃線純化，多次劃線后得到純菌種假諾卡氏菌GY0556。
[0019] 對分離得到的假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556進(jìn)行分子鑒定，按W 下步驟進(jìn)行：用生物化學(xué)法提取菌株的基因組DNA，采用國際細(xì)菌鑒定通用引物（27F: 5, -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和 1492R:5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行，W基因組 DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，之后進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化， 篩選陽性克隆的菌落，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。
[0020] 假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556 的 16SrDNA序列長度為 1484bp，其序 列如SEQIDNO: 1所示，將測序結(jié)果與GenBank中的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比對，然后 用MEGA6. 0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖3所示），W確定菌株的種屬關(guān)系。同源性分析 結(jié)果表明，該序列與假諾卡氏菌（Pseudonocardiahy化ocarbonoxydans、Pseudonocardia sulfidoxydans和Pseudonocardiaalaniniphila)的 16SrDNA序列的同源性最高，相 似性均為97. 6%。通過結(jié)合菌體形態(tài)特征，生長條件和生理生化鑒定結(jié)果確定假諾卡氏 菌（Pseudonocardiasp.)GY0556 屬于假諾卡氏科（Pseudonocardiaceae)假諾卡氏屬 (Pseudonocardia)。 陽OW 實(shí)施例3
[0022] 對本實(shí)施例假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性測 定，具體步驟如下：
[0023] 1、假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556的活化：在超凈工作臺中無菌操作， 用接種環(huán)挑取假諾卡氏菌（PseudonocardiaSP. )GY0556,在改良2216E培養(yǎng)基上用接種環(huán) 劃線，在30°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0024] 2、供試菌株的活化：用接種環(huán)分別挑取4株供試細(xì)菌（枯草芽抱桿菌、金黃色葡萄 球菌、大腸桿菌和蘇云金芽胞桿菌），于無菌環(huán)境下，在LB斜面培養(yǎng)基（蛋白腺1%，化Cl 1%，酵母膏0. 5%，瓊脂1. 5% )上進(jìn)行化線，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[00巧]3、假諾卡氏菌（Pseudonocardia sp. )GY0556發(fā)酵樣品的制備：將分離得到的假 諾卡氏菌GY0556接種于50血改良2216E培養(yǎng)基中，置于20化pm 28°C空氣浴搖床中，培 養(yǎng)兩天后取出，作為種子液；將種子液按照1:50的接種量分別接種到50ml改良2216E培 養(yǎng)基和ACTl培養(yǎng)基（玉米漿1%，酵母膏1%，牛肉膏0. 1%，玉米漿0. 3%，葡萄糖2%， K2HPO4O. 5%，MgS〇4.7&0 0. 5%，CaC〇3〇. 2%，陳海水比，pH 7. 0)中，每種培養(yǎng)基做S個 重復(fù)，30°C 20化pm培養(yǎng)6天，得發(fā)酵液。向發(fā)酵液中按1:1的量加乙酸乙醋，超聲波超 聲20min，磁力攬拌20min后，取上層乙酸乙醋有機(jī)相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，稱取粗提物質(zhì) 量后，向獲得殘?jiān)屑覫ml甲醇溶解后取出，蒸干后加適量DMS0,將該粗提物配制為濃度 20mg/ml，作為假諾卡氏菌（Pseudonocardia sp.)GY0556發(fā)酵測試樣品。
[0026] 4、含菌平板的制備：將按照上述步驟2活化2~3次的4株供試細(xì)菌，接種于LB 斜面培養(yǎng)基上，在37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1天，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法，在四株供試細(xì)菌的斜面培養(yǎng) 基試管中分別加入5ml生理鹽水，充分震蕩搖勻，取一滴滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻 片之間的計(jì)數(shù)室內(nèi)，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后稀釋到菌體濃度為1Xl〇7CFU/mU得到4株 供試細(xì)菌的菌懸液；將每個菌株的菌懸液按每100mL培養(yǎng)基中加入Iml菌懸液的比例加入 到50°C左右LB瓊脂培養(yǎng)基中，混勻后，迅速分裝到滅菌后的空平板中，冷卻，制成4株供試 細(xì)菌的含菌平板。
[0027] 5、采用濾紙片法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，每個含菌平板內(nèi)放置3組雙層濾紙（cp=6mm)。 每組濾紙片上加10y1假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556發(fā)酵樣品，每株供試菌株 的含菌平板做3個平行樣，將未接菌的發(fā)酵培養(yǎng)基按同樣的方法處理做陰性對照，然后將 含菌平板置于37°C恒溫培養(yǎng)24h后觀察，測其抑菌圈直徑（f)，測定結(jié)果如表1所示。
[0030]表1中A為假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556用2216E培養(yǎng)基發(fā)酵所得 粗提物樣品，B為菌株GY0556用ACTl培養(yǎng)基發(fā)酵所得粗提物樣品；所述枯草芽胞桿菌、蘇 云金芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均為本實(shí)驗(yàn)室保存。表1中，表示無活性； "+ "表示活性較弱，抑菌圈直徑<l〇mm，"++"表示活性中等，抑菌圈直徑為10-15mm，"+++" 表示活性較強(qiáng)，抑菌圈直徑〉15mm。
[0031]表2為本發(fā)明所述假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556的碳源利用情況。
[0036]表3為本發(fā)明所述假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556的酶學(xué)特性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556,已于2015年4月23日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo. 10737。2. 如權(quán)利要求1所述假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp. )GY0556在改良2216E培養(yǎng)基 上生長，最適生長溫度為30~35°C，最適生長環(huán)境pH值為8~9,最適鹽濃度為0~3%， 為好氧菌。3. 如權(quán)利要求1所述假諾卡氏菌（Pseudonocardiasp.)GY0556在制備抑菌劑中應(yīng)用。
【專利摘要】一株假諾卡氏菌及其應(yīng)用，涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域。所述假諾卡氏菌(Pseudonocardia？sp.)GY0556，保藏中心登記入冊編號：CGMCC？No.10737。假諾卡氏菌(Pseudonocardia？sp.)GY0556為革蘭氏陽性菌，硝酸鹽還原試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、七葉苷、明膠和p-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷水解試驗(yàn)呈陽性，吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)、氧化酶和脲酶試驗(yàn)為陰性。由于具有較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌譜較廣，其代謝產(chǎn)物含有大量的抑菌活性成分，因此假諾卡氏菌(Pseudonocardia？sp.)GY0556可在制備抑菌劑中應(yīng)用。CGMCC No.1073720150423
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/01, A01P3/00
【公開號】CN105296379
【申請?zhí)枴緾N201510357183
【發(fā)明人】張改云, 王李娜, 周淵, 楊艷柳
【申請人】國家海洋局第三海洋研究所, 中國大洋礦產(chǎn)資源研究開發(fā)協(xié)會
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年6月25日