專利名稱：紅色諾卡放線菌細(xì)胞壁骨架制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑，特別是紅色諾卡放線菌細(xì)胞壁骨架制劑，是治療宮頸糜爛患者首選的外用藥物。
使用的微生物用來生產(chǎn)本發(fā)明所述產(chǎn)品的是一種屬于諾卡氏菌所屬的菌株，其具有生產(chǎn)紅色諾卡放線菌細(xì)胞骨架制劑的能力。紅色諾卡放線菌(Nocardia rubra)Nr-8026(以下簡(jiǎn)稱Nr-8026菌株)就具有上述特性，適于生產(chǎn)本發(fā)明所述的產(chǎn)品。該菌株經(jīng)在甘油瓊脂培養(yǎng)基上，33℃培養(yǎng)5天而得，其于2002年2月5日在中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.0712。
Nr-8026菌株的菌學(xué)特征1、菌落形態(tài)特征在甘油瓊脂培養(yǎng)基上，33℃培養(yǎng)48小時(shí)，菌落隆起，呈桔紅色，表面干燥皺起，外觀呈砂粒狀，略有光澤。接種環(huán)接觸易碎。顯微鏡下觀察菌體呈分枝狀有橫隔膜，形成纖細(xì)的菌絲體。整個(gè)菌絲分裂成規(guī)則的柱形短粗細(xì)胞，培養(yǎng)5天菌體成短桿狀和球形。
2、染色性革蘭氏染色陽性，抗酸染色陰性。
3、生化特性取甘油瓊脂斜面培養(yǎng)基上經(jīng)33℃，48小時(shí)培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種于以下各種培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)33℃，24小時(shí)后開始觀察結(jié)果，連續(xù)觀察8天，生化反應(yīng)見下表紅色諾卡放線菌生化反應(yīng)結(jié)果 符合以上標(biāo)準(zhǔn)者可用于生產(chǎn)[注]+陽性產(chǎn)酸-陰性培養(yǎng)與提取方法用紅色諾卡氏菌屬通過常規(guī)的微生物生產(chǎn)方法，可以培養(yǎng)Nr-8026菌株，并經(jīng)傳代、擴(kuò)增、超聲波粉碎，提取獲得該細(xì)胞壁骨架，酶純化、有機(jī)溶劑除脂后，再加入適量的賦形劑后凍干制成。其培養(yǎng)方式既可為固體培養(yǎng)，也可為液體培養(yǎng)。
對(duì)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)源并無特殊的規(guī)定，可使培養(yǎng)基中含有通常用于微生物培養(yǎng)的碳源、氮源及其它營(yíng)養(yǎng)源。其中碳源可為淀粉、糊精、甘露醇、蔗糖、甘露糖、乳糖、山梨醇、麥牙糖、福壽草醇等。氮源可為肉膏、蛋白胨、銨鹽、硝酸鹽以及其它有機(jī)或無機(jī)含氮化合物。至于其它營(yíng)養(yǎng)源則可適當(dāng)添加一些無機(jī)鹽類。例如食鹽、磷酸鹽類。
對(duì)溫度、時(shí)間等培養(yǎng)條件并無嚴(yán)格的限制，以利于使用菌的生長(zhǎng)為準(zhǔn)，并以選擇使其產(chǎn)量最高的條件為好。例如培養(yǎng)基的PH值以接近中性為好，培養(yǎng)溫度宜在22-37℃，當(dāng)然這些培養(yǎng)基的組分、氫離子濃度、培養(yǎng)溫度等均應(yīng)根據(jù)所使用的菌株不同及外部條件等進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)，以獲得最好的效果。
通過常規(guī)培養(yǎng)微生物的方法，將Nr-8026菌株接種在甘油瓊脂基上培養(yǎng)菌種，經(jīng)檢定合格的菌種增菌培養(yǎng)、菌體收集、細(xì)胞粉碎后經(jīng)酶純化、除脂后即為本發(fā)明產(chǎn)品的有效成分細(xì)胞壁骨架，添加藥用微生物制劑所能接受的賦形劑，如右旋糖酐40，灌裝后凍干即為成品。本產(chǎn)品每瓶為0.5ml，其組成與配比如下紅色諾卡放線菌細(xì)胞壁骨架 60μg右旋糖酐4015mg經(jīng)檢測(cè)其質(zhì)量指標(biāo)見下表

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于是利用微生物的細(xì)胞壁骨架做為有效成分，制成的生物制劑，該細(xì)胞壁骨架是一種免疫增強(qiáng)劑，它能增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤作用和對(duì)某些病毒和細(xì)菌感染具有保護(hù)作用，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力并被一系列的實(shí)驗(yàn)和醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)所證明，對(duì)適應(yīng)癥取得了令人滿意的療效，治愈率達(dá)88％，總有效率達(dá)100％，對(duì)正常組織無損傷、無毒、安全性好，副作用小，是一種高效、安全、使用簡(jiǎn)便，成本低，取代進(jìn)口的治療宮頸摩爛的外用藥物。
本發(fā)明所使用的紅色諾卡放線菌Nr-8026，于2002年2月5日在北京中關(guān)村，中國(guó)微生物保藏管理中心普通微生中心保藏，登記入冊(cè)編號(hào)CGMCCNo.0712，并經(jīng)檢測(cè)表明所寄存的菌株存活，無失活者。
1、一般藥理試驗(yàn)1)、用相當(dāng)于臨床劑量的20、40、80倍靜脈注射后，對(duì)麻醉貓血壓、呼吸、心率和心電均未產(chǎn)生明顯影響；2)、用相當(dāng)于臨床劑量的1000倍靜脈注射后，對(duì)小鼠的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶功能未產(chǎn)生明顯的影響。
從而可見本發(fā)明的制劑對(duì)動(dòng)物精神、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)均無明顯影響。
2、安全試驗(yàn)(無菌、毒性)1)、無菌試驗(yàn)結(jié)果陰性，證明無菌試驗(yàn)合格；2)、通過小白鼠急性毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組分別以皮下注射及腹腔注射方式給藥，其劑量是人用量的5倍，對(duì)照組以無菌生理鹽水0.5ml/支代替品，連續(xù)觀察7-8天，小鼠狀態(tài)良好，體重均較注射前增加，均無異常，剖檢小鼠各臟器均無異常變化，毒性試驗(yàn)合格。
3、長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)高于臨床劑量30倍，每日一次，連續(xù)陰道給藥三個(gè)月，未發(fā)現(xiàn)狗有毒性作用，心電圖、各項(xiàng)血液生化及血液指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)與給藥前比較均未發(fā)現(xiàn)明顯毒性變化，停藥兩周后，留待觀察的狗各項(xiàng)指標(biāo)亦正常，未見到延遲毒性反應(yīng)，從而表明本發(fā)明的產(chǎn)品在所用劑量，時(shí)間范圍內(nèi)無毒性作用。
4、藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)在生產(chǎn)工藝無改變情況下，藥品在常溫下，放置1、2、3個(gè)月、8個(gè)月、14個(gè)月，21個(gè)月時(shí)，該制劑中含有的丙氨酸、胞壁酸其含量與該產(chǎn)品生產(chǎn)當(dāng)月時(shí)相比無明顯差異，從而說明該條件下，產(chǎn)品的穩(wěn)定性很好；又通過效力試驗(yàn)表明與該三批當(dāng)月時(shí)的吞噬率和吞噬指數(shù)均無明顯變化，表明產(chǎn)品穩(wěn)定性很好，凍干后可常溫保存二年。
5、免疫力試驗(yàn)表明免疫吞噬雞紅細(xì)胞能力很強(qiáng)，其吞噬率為59-74.4％，吞噬指數(shù)0.6---0.9而右旋糖酐40其吞噬率和吞噬指數(shù)較生理鹽水都低，從而說明本發(fā)明的產(chǎn)品免疫吞噬能力很強(qiáng)，而右旋糖酐40、生理鹽水無此作用。
2、 宮頸有糜爛，已除外癌變者。
3、 月經(jīng)規(guī)律周期不少于25天者。
4、 能堅(jiān)持完成療程者。
5、 受試期間不用其他治療方法。(二)受試對(duì)象排除條件1、 陰道細(xì)胞學(xué)涂片檢查結(jié)果為IIB以上者。
2、 宮頸有癌變者。
3、 有各種陰道炎或急性、亞急性盆腔炎者。
4、 產(chǎn)后3個(gè)月以內(nèi)。
5、 多種藥物有過敏史者。(三)受試對(duì)象例數(shù)總共75例，按2∶1隨機(jī)表分配在試驗(yàn)組上50例，對(duì)照組25例。(四)使用的藥物和方法1、試驗(yàn)組藥物為紅色諾卡放線菌細(xì)胞壁骨架制劑(以下簡(jiǎn)稱諾卡擦劑)，規(guī)格為每安瓶?jī)?nèi)含細(xì)胞壁骨架(以下簡(jiǎn)稱Nr-CWS)60μg凍干粉，為申請(qǐng)人單位的研制品，批號(hào)950321。
使用方法除去宮頸表面分泌物后，用2.0ml生理鹽水溶解諾卡擦劑60μg凍干粉后，用藥物浸濕無菌帶尾繩棉球置于宮頸糜爛處，24小時(shí)后由患者自行取出。每周上藥2次，共6次。2、對(duì)照組藥物為愛寶療濃縮液，每克含愛寶療360mg，為德國(guó)BYK公司產(chǎn)品，批號(hào)J940475。
使用方法首先用1∶5稀釋液沖洗宮頸，用紗布?jí)K清除宮頸粘液及陰道內(nèi)分泌物，然后將浸透濃縮液的棉花塊緊貼糜爛處三分鐘后即取出，此時(shí)糜爛面全已變白。上述治療每周二次，共6次。
試驗(yàn)組和對(duì)照組均于月經(jīng)干凈后2-3天開始治療。(五)宮頸糜爛診斷標(biāo)準(zhǔn)1、分度輕度糜爛面小于整個(gè)宮頸面積的1/3。中度糜爛面占整個(gè)宮頸面積的1/3-2/3。重度糜爛面占整個(gè)宮頸面積的2/3以上。2、分型按糜爛深淺程度分為單純型糜爛表面平滑。顆粒型糜爛表面呈乳頭狀突起，不平。(六)觀察事項(xiàng)1、用藥前(1)常規(guī)詢問病史，做婦科檢查。(2)陰道分泌物檢查清潔度，分為I、II、III度，查滴蟲霉菌。(3)做陰道細(xì)胞學(xué)涂片檢查，除外癌變。(4)目測(cè)宮頸糜爛面積，按診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分度，分型。(5)查血、尿常規(guī)，肝功能(GPT或ALT)腎功能(BUN、Cr)。(6)安排專人進(jìn)行治療和觀察，以便統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。2、用藥期間(1)治療期間建議患者避免性生活。(2)詢問藥物的全身和局部的不良反應(yīng)情況。(3)每次上藥前注意觀察外陰、陰道局部的不良反應(yīng)，白帶變化(性狀和量)。宮頸糜爛局部變化(范圍和深度)。3、治療后下次月經(jīng)后來復(fù)查，繼續(xù)詢問癥狀，觀察宮頸糜爛局部變化(包括面積和深淺)，陰道分泌物量和性狀變化，并進(jìn)行療效判定。最后一次上藥后，重復(fù)治療前陰道的細(xì)胞學(xué)檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查(血、尿常規(guī)，肝、腎功能)。(七)療效判定標(biāo)準(zhǔn)痊愈糜爛面消失，宮頸光滑，癥狀消失。有效上下唇糜爛面直徑縮小2mm，變淺，癥狀減輕。無效自覺癥狀和體征無改變。惡化；糜爛面擴(kuò)大，變深，癥狀加重。(八)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)一方案，統(tǒng)一表格，統(tǒng)一數(shù)據(jù)處理。統(tǒng)計(jì)方法為X2檢驗(yàn)。
結(jié)果1、基本情況比較門診宮頸糜爛患者按隨機(jī)表50例應(yīng)用諾卡擦劑治療為試驗(yàn)組，25例應(yīng)用愛寶療治療為對(duì)照組。兩組受試對(duì)象的年齡、初潮年齡、孕次、產(chǎn)次等基本情況見表1。表1受試對(duì)象的年齡、初潮年齡、孕次、產(chǎn)次的比較年齡 初潮孕次產(chǎn)次例數(shù) 均值標(biāo)準(zhǔn)差 均值標(biāo)準(zhǔn)差 均值 標(biāo)準(zhǔn)差 均值 標(biāo)準(zhǔn)差實(shí)驗(yàn)組 50 35.886.88 14.140.951.240.480.94 0.24對(duì)照組 25 34.445.87 14.160.941.160.371.00兩組間P＝0.3737 P＝0.9315 P＝0.4349P＝0.2205差異的顯著性兩組間年齡最小24歲，最大45歲，由上表可見兩組受試對(duì)象基本情況無顯著性差異，具有可比性(P＞0.005)。
2、臨床表現(xiàn)2.1兩組患者宮頸糜爛分度，分型情況見表2、表3。表2 兩組患者宮頸糜爛分度、分型比較用藥前 第三次復(fù)查輕度中度 重度正常輕度 中度重度試驗(yàn)組21 24 5 44 6對(duì)照組8 10 7 19 5 1試驗(yàn)組用藥前與第三次復(fù)查的顯著性檢驗(yàn)(精確概率)(P＜0.01)。對(duì)照組同試驗(yàn)組相似(P＜0.01)。詳見表11，下同。
由上表可見試驗(yàn)組輕度占42％，中度占48％，重度占10％，對(duì)照組輕度占32％，中度占40％，重度占24％。治療后試驗(yàn)組宮頸正常占88％，輕度占12％，對(duì)照組宮頸正常占76％，輕度占20％，中度占4％，從糜爛度所占有的百分比上看試驗(yàn)組療效優(yōu)于對(duì)照組。表3宮頸糜爛分型的對(duì)比用藥前第三次復(fù)查單純型 顆粒型 乳頭型正常單純型 顆粒型 乳頭型試驗(yàn)組 30 17 3 442 3 1對(duì)照組 10 11 4 192 2 2注宮頸糜爛分度及分型兩表中“正?！币豁?xiàng)是針對(duì)療效中填入“0”而設(shè)計(jì)的。試驗(yàn)組用藥前與第三次復(fù)查的顯著性檢驗(yàn)(精確概率)(P＜0.01)。對(duì)照組與試驗(yàn)組相似(P＜0.01)。
由表3可見(1)治療前試驗(yàn)組單純型占60％，顆粒型占34％，乳頭型占6％。對(duì)照組單純型占40％，顆粒型占44％，乳頭型占16％。治療后試驗(yàn)組單純型占4％，顆粒型占6％，乳頭型占2％，正常者為88％。對(duì)照組單純型占4％，顆粒型占4％，乳頭型占8％，正常占76％。試驗(yàn)組療效優(yōu)于對(duì)照組。
2.2用藥前后白帶量、白帶性狀見表4、表5表4白帶量的對(duì)比用藥前 第一次復(fù)查 第二次復(fù)查 第三次復(fù)查正常 稍多 很多 正常 稍多 很多 正常 稍多 很多 正常 稍多 很多試驗(yàn)組 27 212 454 1 50 50對(duì)照組 13 7 5 186 1 21 4 23 2
試驗(yàn)組用藥后與第三次復(fù)查的顯著性檢驗(yàn)(精確概率)(P＜0.01)。對(duì)照組與試驗(yàn)組相似(P＜0.01)。由上表可見(1)治療前試驗(yàn)組中白帶量正常者占54％，稍多占42％，很多占4％。對(duì)照組正常占52％，稍多占28％，很多占20％。(2)治療后白帶量正常占100％，無稍多或很多。對(duì)照組正常占92％，稍多占8％。試驗(yàn)組或?qū)φ战M在治療前后白帶量有非常顯著差異(P＜0.01)，兩組中白帶量所占百分比看，試驗(yàn)組對(duì)白帶量的改善上優(yōu)于對(duì)照組(第二次復(fù)查試驗(yàn)組正常者占100％，第一次復(fù)查正常者占90％，而對(duì)照組正常者分別為72％、82％)。表5白帶性狀的對(duì)比用藥前 第一次復(fù)查 第二次復(fù)查第三次復(fù)查正常 膿性正常 膿性 正常 膿性正常 膿性試驗(yàn)組 446 482 491 491對(duì)照組 187 232 25 25試驗(yàn)組用藥前與第三次復(fù)查的顯著性檢驗(yàn)(精確概率)(P＜0.01)。對(duì)照組與試驗(yàn)組相似(P＜0.01)。
由表5看(1)治療前試驗(yàn)組白帶正常占88％，膿性占12％，對(duì)照組白帶正常占72％，膿性占24％。治療后試驗(yàn)組白帶正常占98％，膿性占2％，對(duì)照組白帶正常占100％。由此可見，兩組在治療前后白帶性狀改善上均存顯著差異(P＜0.01)。試驗(yàn)組在改善白帶性狀上正常者為98％，對(duì)照組為100％，兩者無差異(P＞0.05)。白帶量和性狀常為患者主訴癥狀，估計(jì)與此有關(guān)。
2.3陰道清潔度，宮頸涂片，巴氏分級(jí)見表6表6陰道清潔度，宮頸涂片，巴氏分級(jí)陰道清潔度 巴氏分級(jí)用藥前第三次復(fù)查用藥前 第三次復(fù)查I度 II度 III度 I度 II度 III度 I度 II度 III度 I度 II度 III度試驗(yàn)組 2228 473 3020491對(duì)照組 1411 232 131225經(jīng)統(tǒng)計(jì)兩組間陰道清潔度和宮頸涂片巴氏分級(jí)，在治療前生P值均小于0.01，差異均非常顯著。提示藥物的安全性和實(shí)用價(jià)值。
3、療效評(píng)定見表7表7療效評(píng)定痊愈 有效 無效試驗(yàn)組 44 60對(duì)照組 19 60
從表7可見試驗(yàn)組治愈率占88％，有效率占12％，總有效率100％，對(duì)照組痊愈率占72％，有效率占28％，總有效率為100％，經(jīng)X2統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)兩者判別不顯著。
4、安全性和不良反應(yīng)見表8表8不良反應(yīng)總例 有 無試驗(yàn)組 500 50對(duì)照組 250 25試驗(yàn)組50例，對(duì)照組25例，均無一例出現(xiàn)副反應(yīng)，提示諾卡擦劑應(yīng)用于臨床的安全、可靠性。4、治療前后實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢查結(jié)果見表9、表105、表9治療前后實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢查結(jié)果

表10試驗(yàn)組與對(duì)照組治療前后各項(xiàng)指標(biāo)差異的顯著性檢驗(yàn)Hb RBC WBC BUN Cr治療前P＝0.0704P＝0.3963P＝0.6048P＝0.8684P＝0.0071治療后P＝0.122 P＝0.964 P＝0.7019P＝0.5754P＝0.7377用藥前后各項(xiàng)指標(biāo)的觀察75例受試者用藥前后測(cè)血紅細(xì)胞，紅細(xì)胞已計(jì)數(shù)，白細(xì)胞已計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)氨酶，血尿素氨，血肌肝，變化如表9所示，兩組中各項(xiàng)指標(biāo)相比較，大部分指標(biāo)統(tǒng)計(jì)差異無顯著性(P＞0.05)，少數(shù)指標(biāo)差別雖有顯著性，但其均值均在正常范圍內(nèi)。結(jié)果詳見表9、表10。結(jié)果說明試驗(yàn)組與對(duì)照組所用的藥物均是安全的。
6、 用藥前后各項(xiàng)指標(biāo)的卡方顯著性檢驗(yàn)見表11
白帶過 宮頸糜 宮頸糜 白帶量 白帶性 陰道清 巴氏分多 爛分度 爛分型 狀 潔度級(jí)實(shí)驗(yàn)組用藥前與第三次復(fù)查差 P＜0.05 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01 P＞0.05 P＜0.01 P＜0.01異的顯著性檢驗(yàn)(精確概率法)對(duì)照組用藥前與第三次復(fù)查差 P＜0.05 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01異的顯著性檢驗(yàn)(精確概率法)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組用藥前差異的 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05顯著性檢驗(yàn)(精確概率法)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組第三次復(fù)查差 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05異的顯著性檢驗(yàn)(精確概率法)討論從本試驗(yàn)的結(jié)果來看，兩種藥品均有顯著的療效，尤其是試驗(yàn)組治療宮頸糜爛更是取得了令人滿意的療效，治愈率達(dá)88％，總有效率達(dá)100％，兩者均能使陰道分泌物減少和性狀改善。兩種藥物的副作用反應(yīng)均很小，對(duì)局部無明顯刺激癥狀，不損傷正常組織，安全性好，兩者均為高效安全使用簡(jiǎn)便的治療宮頸糜爛的外用藥。同時(shí)給藥方式合理，帶尾棉球緊貼于糜爛面作用充分，并自行取下較方便，患者十分樂于接受。
因此，我們認(rèn)為諾卡擦劑是為宮頸糜爛治療提供了新的途徑，又具有防癌作用的良藥，值得推廣。
對(duì)于面積大的顆粒型、乳頭型宮頸糜爛，一個(gè)療程不能完全治愈者，可考慮使用2-3個(gè)療程，以取得更好的治療效果。
權(quán)利要求
1.一種紅色諾卡放線菌細(xì)胞壁骨架制劑，其特征是先培養(yǎng)紅色諾卡放線菌CGMCCNo.0712，再以增菌培養(yǎng)、菌體收集、細(xì)胞粉碎、酶純化除脂后的所得物，經(jīng)配制灌裝凍干而成，每瓶為0.5ml，其組成與配比如下紅色諾卡放線菌細(xì)胞壁骨架 60μg右旋糖酐40 15mg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物制劑，特別是紅色諾卡放線菌細(xì)胞壁骨架制劑。先培養(yǎng)紅色諾卡放線菌CGMCCNo.0712，再經(jīng)增菌培養(yǎng)、菌體收集、細(xì)胞粉碎、酶純化除脂后的所得物，經(jīng)配制灌裝凍干而成，其中含有紅色諾卡放線菌細(xì)胞壁骨架和右旋糖酐40，兩者的含量按配方的配比。通過一系列的試驗(yàn)和臨床結(jié)果表明，本發(fā)明的制劑對(duì)適應(yīng)癥的療效顯著，治愈率達(dá)88％，總有效率達(dá)100％，對(duì)正常組織無損傷、無毒，安全性好，副作用小，使用簡(jiǎn)便，成本低，取代進(jìn)口是治療宮頸糜爛的首選外用藥物。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1443542SQ02109258
公開日2003年9月24日 申請(qǐng)日期2002年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月8日
發(fā)明者張策, 張軼, 李軍 申請(qǐng)人:沈陽勝寶康生物制藥有限公司