專(zhuān)利名稱(chēng)：白色諾卡氏菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種具有NO合成酶抑制作用的微生物。
背景技術(shù)：
研究表明，NO在神經(jīng)、免疫、心血管等多個(gè)系統(tǒng)中具有廣泛而復(fù)雜的生理和病理作用。它是不穩(wěn)定彌散性自由基通過(guò)大量的化學(xué)反應(yīng)而發(fā)揮其生理作用，廣泛影響信息傳遞過(guò)程、能量代謝和DNA的合成。例如腦缺血，NO會(huì)大量增加。過(guò)量的NO反過(guò)來(lái)會(huì)抑制DNA的合成，損傷細(xì)胞。因此，抑制NO合成酶，是醫(yī)治神經(jīng)、免疫、心血管疾病的重要環(huán)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種其發(fā)酵液具有抑制NO合成酶作用的微生物——白色諾卡氏菌。
本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌命名為白色諾卡氏菌Nocardia alba YIM30243，保藏編號(hào)為CCTCC NOM203017。
本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌系從我國(guó)云南河口采集的土壤樣品中分離得到。現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏單位名稱(chēng)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2003年2月14日，保藏編號(hào)為CCTCC NOM203017。
本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌在大多數(shù)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，氣生菌絲呈黃白至粉紅灰色，基內(nèi)菌絲黃白至黃褐色。氣生菌絲、基內(nèi)菌絲不規(guī)則斷裂。明膠液化、淀粉水解、硝酸還原呈陽(yáng)性，牛奶凝固、胨化呈陰性，不產(chǎn)生硫化氫，不產(chǎn)生黑色素。能利用葡萄糖、甘露糖、木糖、核糖、肌醇、甘露醇、甘氨酸、組氨酸、甲硫氨酸。細(xì)胞壁含有meso-DAP，全細(xì)胞水解物含有半乳糖和阿拉伯糖。
培養(yǎng)條件(一)斜面培養(yǎng)條件培養(yǎng)基葡萄糖4g；酵母膏4g；麥芽膏5g；復(fù)合維生素3.75mg/L；瓊脂15g；蒸餾水水1000ml，pH7.2；培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為1周。
(二)種子培養(yǎng)條件從斜面挑取部分菌絲體接入種子液中，搖瓶培養(yǎng)36小時(shí)。種子培養(yǎng)基糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸鎂0.5g；磷酸銨0.2g；蒸餾水1000ml，pH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。
(三)發(fā)酵培養(yǎng)條件；按10％的接種量接到種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)6天。培養(yǎng)基大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化鈉2.5g；碳酸鈣2g；蒸餾水1000ml，pH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。得到發(fā)酵液。
本發(fā)酵液對(duì)NO合成酶抑制劑篩選活性結(jié)果報(bào)告1.實(shí)驗(yàn)原理本法根據(jù)NOS在催化L-Arg氧化分解L-Cit和NO過(guò)程中同步引起NADPH氧化為NADP+而產(chǎn)生熒光變化。通過(guò)熒光檢測(cè)在反應(yīng)液中NADPH的消耗(激發(fā)光340nm，發(fā)射光440nm)，從而推斷NOS的活性。
2.實(shí)驗(yàn)方法取0.1mg/ml濃度發(fā)酵液樣品，10mM CaCl2，1mM L-Arg，0.5mM NADPH各10ul 加冷酶蛋白60ul(蛋白的制備取豬小腦勻漿，低溫離心，腦重∶緩沖液＝1∶5(g/V)，20000離心10分鐘取上清。Sephadex G25過(guò)濾脫鹽) 低溫快速短暫離心 立即340nm波長(zhǎng)激發(fā)，440nm波長(zhǎng)熒光值測(cè)定(反應(yīng)溫度30℃。反應(yīng)體系中熒光值的降低速率可以間接反映NOS的活性。測(cè)定前振蕩20s混合樣品，逐孔測(cè)定，每孔計(jì)數(shù)10次求平均值。完成1次整板測(cè)定約100秒；連續(xù)測(cè)定13次。根據(jù)每孔獲得的13個(gè)數(shù)據(jù)，計(jì)算熒光值變化斜率作為酶活性。)3.結(jié)果計(jì)算a)在96孔板中8孔作為對(duì)照，其中A1-D1用蒸餾水來(lái)代替樣品，反應(yīng)酶的最大活性；E1-H1分別加入最大濃度NOS抑制劑L-Nω-nitro-arg(LNNA)0.5mM，以該濃度下對(duì)酶活性的抑制率100％；b)樣品的抑制率(樣品的斜率-最大酶活性斜率)/(陽(yáng)性藥物斜率-最大酶活性斜率)×100％c)IC50計(jì)算復(fù)篩程序基本同上，每一個(gè)樣品稀釋成5個(gè)濃度，分別為10，2，0.4，0.08，0.016ug.ml-1。根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算IC50。
本菌株具有抑制NO合成酶的作用，其發(fā)酵液對(duì)NO合成酶的抑制率達(dá)100％，而且藥效持久、穩(wěn)定、無(wú)毒，具有從中開(kāi)發(fā)新型、高效、無(wú)毒的天然藥物的巨大潛力。
本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌已于2003年2月14日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏單位簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC，保藏編號(hào)為M203017，保藏單位地址武漢，珞珈山，武漢大學(xué)內(nèi)，郵政編碼430072。


圖1為本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌在酵母膏-麥芽膏培養(yǎng)基上的顯微鏡照片。
圖2為本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌在酵母膏-麥芽膏培養(yǎng)基上的電鏡照片。
圖3為本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌的培養(yǎng)特征。
圖4為本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌的生理生化特征。
圖5為本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌的碳氮源利用情況。
圖6為本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌和部分相關(guān)菌在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的16SrDNA序列及登錄號(hào)。
圖7為本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌及部分相關(guān)菌株依據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例從我國(guó)云南河口采集的土壤樣品，在實(shí)驗(yàn)室中按下列條件培養(yǎng)，即可獲得本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌。
(一)菌株培養(yǎng)條件1.斜面培養(yǎng)條件培養(yǎng)基葡萄糖4g；酵母膏4g；麥芽膏5g；復(fù)合維生素3.75mg/L；瓊脂15g；蒸餾水水1000ml，pH7.2；培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為1周。
2.種子培養(yǎng)條件從斜面挑取部分菌絲體接入種子液中，搖瓶培養(yǎng)36小時(shí)。種子培養(yǎng)基糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸鎂0.5g；磷酸銨0.2g；蒸餾水1000ml，pH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。
按以下發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)，即可獲得發(fā)酵液按10％的接種量接到種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)6天。培養(yǎng)基大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化鈉2.5g；碳酸鈣2g；蒸餾水1000ml，pH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。
本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌的16S rDNA部分序列如下CGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCCTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGTACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCANGGAATGCATGTTCTGTGGTGGAAAGATTTATCGGTACAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCCAGCGACG
CCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCCCTTTCGACAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGTAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTTGTAGGCGGTCTGTCGCGTCTTCTGTGAAAACTTGGGGCTCAACCTTAAGCTTGCAGGGGATACGGGCAGACTAGAGTACTTCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGAAGTAACTGACGCTGAGAAGCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGGAAACCTGCAGAGATGTAGGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTATGTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTTGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCC
權(quán)利要求
1.一種白色諾卡氏菌，其特征在于命名為白色諾卡氏菌Nocardiaalba YIM 30243，現(xiàn)在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2003年2月14日，保藏單位名稱(chēng)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NOM203017。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的諾卡氏菌，其特征在于該菌種的16SrDNA部分序列如下GGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCCTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGTACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCANGGAATGCATGTTCTGTGGTGGAAAGATTTATCGGTACAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCCCTTTCGACAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGTAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTTGTAGGCGGTCTGTCGCGTCTTCTGTGAAAACTTGGGGCTCAACCTTAAGCTTGCAGGGGATACGGGCAGACTAGAGTACTTCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGAAGTAACTGACGCTGAGAAGCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGGAAACCTGCAGAGATGTAGGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTATGTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTTGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCC
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是涉及一種具有NO(一氧化氮)合成酶抑制作用的微生物，本發(fā)明特征在于命名為白色諾卡氏菌Nocardia alba YIM 30243，現(xiàn)保存在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2003年2月14日，保藏單位名稱(chēng)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NOM203017。本發(fā)明具有抑制NO合成酶的活性，其發(fā)酵液對(duì)NO合成酶的抑制率在100％，效果穩(wěn)定而持久，具有從中開(kāi)發(fā)出新型、高效、無(wú)毒天然藥物的巨大潛力。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1542126SQ0312407
公開(kāi)日2004年11月3日 申請(qǐng)日期2003年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月29日
發(fā)明者李文均, 姜怡, 文孟良, 李銘剛, 徐麗華, 姜成林 申請(qǐng)人:云南省微生物研究所