專(zhuān)利名稱：N型非病毒載體以及包含其的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因治療藥物領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及非病毒載體及編碼其的融合基因，所述非病毒載體是能夠包裝與攜帶編碼具有殺傷作用的蛋白質(zhì)的表達(dá)型重組體靶向性地導(dǎo)入特定腫瘤細(xì)胞，以使該表達(dá)型重組體在該種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出蛋白質(zhì)，從而殺傷該種腫瘤細(xì)胞而不傷及其它細(xì)胞。本發(fā)明還涉及包含所述非病毒載體和所述表達(dá)型重組體的藥物組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
已知共有上千種抗腫瘤或抗病毒活性的人體異源蛋白，但在付之臨床應(yīng)用時(shí)存在兩個(gè)問(wèn)題一是無(wú)特異性(或靶向性)地對(duì)所有細(xì)胞的殺傷作用導(dǎo)致的嚴(yán)重毒副作用問(wèn)題；二是作為人體異源蛋白質(zhì)，在導(dǎo)入人體血循環(huán)時(shí)出現(xiàn)的嚴(yán)重的免疫原性問(wèn)題。為解決上述問(wèn)題，上個(gè)世紀(jì)80年代曾出現(xiàn)過(guò)利用腫瘤細(xì)胞受體配體基因與綠膿毒素基因II、III功能域編碼基因構(gòu)建的融合基因及其所產(chǎn)生的導(dǎo)向融合蛋白。但臨床研究表明，這種導(dǎo)向蛋白雖能在一定程度上增強(qiáng)了毒素蛋白質(zhì)的導(dǎo)向性與特異性，但不完全。與此同時(shí)，毒素蛋白質(zhì)在這種情況下，其強(qiáng)烈的免疫原性問(wèn)題依然存在。在臨床應(yīng)用時(shí)，雖初期有良好療效，但在4周之后，因抗體形成，發(fā)生中和效應(yīng)而完全失效。雖然通過(guò)多種嘗試來(lái)修飾或封閉毒素的抗原決定簇，如PEG修飾和點(diǎn)突變改造毒素的氨基酸組成，但均因修飾而導(dǎo)致毒素失活，或不能完全消除毒素蛋白的免疫原性，最終還是導(dǎo)致了毒素的失效。因此，尋找一種安全、有效地導(dǎo)入靶細(xì)胞，從而殺滅腫瘤靶細(xì)胞而又避免毒素蛋白對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用與免疫原性的方法是必要的。
基因靶向轉(zhuǎn)移和表達(dá)確?；蛑委煹陌踩裕腔蛑委熤斜仨毷紫瓤紤]的問(wèn)題。將治療基因特異性地轉(zhuǎn)移到腫瘤組織或在腫瘤細(xì)胞中特異表達(dá)，可有效避免對(duì)正常組織的傷害，同時(shí)亦可增加轉(zhuǎn)染效率，實(shí)現(xiàn)基因的靶向性治療。實(shí)現(xiàn)基因的靶向性(限制性)表達(dá)主要有兩種調(diào)控機(jī)制一是所謂的“轉(zhuǎn)錄靶向調(diào)控機(jī)制”，即選用腫瘤相關(guān)抗原(如AFP、CEA)等基因的順式作用元件(如啟動(dòng)因子、增強(qiáng)子)與相應(yīng)的目的基因構(gòu)建成表達(dá)盒，插入基因轉(zhuǎn)移載體，這樣轉(zhuǎn)移基因僅在產(chǎn)生上述腫瘤相關(guān)蛋白的腫瘤中表達(dá)，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷效應(yīng)；二是所謂的“轉(zhuǎn)基因表達(dá)的外源調(diào)控機(jī)制”，即利用可受某種因素誘導(dǎo)表達(dá)基因的順式作用元件，與相應(yīng)的目的基因構(gòu)建成表達(dá)盒，插入基因轉(zhuǎn)移載體，這樣，轉(zhuǎn)移基因在體內(nèi)表達(dá)與否直接受相應(yīng)誘導(dǎo)因素的調(diào)控。
多數(shù)腺癌細(xì)胞的表面會(huì)特異性地表達(dá)促性腺激素釋放肽(GnRH)受體，使用可以與其特異性結(jié)合的配體GnRH作為靶向蛋白，將有殺傷作用的綠膿桿菌毒素(PE)以GnRH-PE融合蛋白形式導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，可望殺傷腫瘤細(xì)胞。這一設(shè)計(jì)基本解決了毒素導(dǎo)向殺傷腫瘤細(xì)胞的問(wèn)題，但因一些正常細(xì)胞表面也表達(dá)GnRH受體，以致也還可能把毒素導(dǎo)入部分正常細(xì)胞而出現(xiàn)毒副作用問(wèn)題，與此同時(shí)，綠膿桿菌毒素對(duì)于人體來(lái)說(shuō)是一種異源蛋白，將會(huì)產(chǎn)生免疫原性。
針對(duì)應(yīng)用毒素治療腫瘤中存在的這些障礙，本領(lǐng)域需要在完全避免毒素蛋白免疫原性和毒副作用的同時(shí)，保留毒素蛋白活性從而特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的新的靶向治療藥物及相關(guān)載體。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面，本發(fā)明提供了一種非病毒載體，其本質(zhì)是一種靶向性融合蛋白，所述融合蛋白由受體配體多肽、TNF87多肽、核定位序列多肽與富含陽(yáng)性氨基酸的多肽組成。在本發(fā)明這一方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的非病毒載體由受體配體多肽、TNF87多肽及富含陽(yáng)性氨基酸的多肽組成。根據(jù)本發(fā)明，所述富含陽(yáng)性氨基酸的多肽是DNA結(jié)合蛋白SON或其片段；所述TNF87多肽是腫瘤壞死因子(TNF)突變后序列；所述核定位序列多肽是TAP；所述受體配體多肽是所述非病毒載體中的受體配體多肽是能夠與GnRH受體特異性結(jié)合的GnRH或其相關(guān)片段、類(lèi)似物或突變體。由于使用GnRH作為導(dǎo)向分子，所以本發(fā)明人將本發(fā)明的非病毒載體稱為N型非病毒載體。
優(yōu)選地，通過(guò)基因工程方法在體外重組獲得融合基因，并在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)該融合基因而獲得本發(fā)明的非病毒載體(融合蛋白)。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的非病毒載體的融合基因。
在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的非病毒載體和一種表達(dá)型DNA重組體的復(fù)合物的藥物組合物，以用于靶向性惡性腫瘤的基因治療，所述表達(dá)型重組體包含表達(dá)對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)的基因。
根據(jù)本發(fā)明，所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌毒素、白喉毒素、商陸、蓖麻毒素，或其他一切對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的來(lái)自人體、動(dòng)植物或者微生物的蛋白，或者是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類(lèi)似物，以及人工合成的具有殺傷細(xì)胞活性的蛋白質(zhì)或多肽及其相應(yīng)的編碼基因。優(yōu)選地，其中所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌毒素，或者是其第二和第三結(jié)構(gòu)域；更優(yōu)選地，所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)是綠膿桿菌毒素的第三結(jié)構(gòu)域或其突變體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述突變體為綠膿桿菌第III功能域突變體(C段的REDLK突變成KDEL)，稱為PEIIImut。它能夠產(chǎn)生殺傷力更強(qiáng)的毒素蛋白，其氨基酸序列SEQ ID NO.9所示。
本發(fā)明將毒素蛋白質(zhì)靶向?qū)爰?xì)胞的方式改為將毒素蛋白編碼基因靶向?qū)爰?xì)胞的治療方法，在完全避免毒素蛋白免疫原性和毒副作用的同時(shí)，保留毒素蛋白活性從而特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明設(shè)計(jì)使得所述非病毒載體與只能在缺氧腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的毒素基因表達(dá)型重組體構(gòu)成復(fù)合藥，從而靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。利用非病毒載體將編碼對(duì)細(xì)胞有強(qiáng)烈殺傷作用的并受缺氧條件驅(qū)動(dòng)的PEIIImut(綠膿毒素第三區(qū)段的突變基因片段)以表達(dá)型重組體的形式靶向?qū)肽[瘤細(xì)胞，致使PEIIImut僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，從而殺滅該細(xì)胞。同時(shí)，在這種利用腫瘤細(xì)胞是缺氧細(xì)胞的特點(diǎn)，以缺氧條件作為基因可控表達(dá)的控制條件的情況下，即使表達(dá)型重組體被導(dǎo)入正常細(xì)胞，因該細(xì)胞為有氧細(xì)胞，則毒素基因PEIIImut不能表達(dá)，細(xì)胞也不致于被殺傷。這樣，既避免了毒素蛋白的免疫原性，也避免了對(duì)任何正常細(xì)胞的殺傷作用，即毒副作用。這一設(shè)計(jì)引導(dǎo)出了”個(gè)體化診斷與個(gè)體化治療”的必要性，因此這一藥物組合物的適應(yīng)癥主要是肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、垂體瘤等。這是本發(fā)明的一個(gè)主要特征。


圖1為本發(fā)明的藥物組合物的總體設(shè)計(jì)圖。
圖2為構(gòu)建含有融合蛋白GTTS的編碼基因的重組體pLSD-GnRH-TNF87-TAP-SON(GTTS)和pLSD-GnRH-TNF87-SON(GTS)酶切鑒定結(jié)果，其中序號(hào)1～4分別代表1BamHI和NdeI雙切GnRH-TNF87-TAP-SON；2HindIII和EcoR I雙切λDNA分子量標(biāo)記；3BstNI單切pBR322分子量標(biāo)記；4BamHI和NdeI雙切GnRH-TNF87-SON。
圖3為構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-4HRE的酶切鑒定結(jié)果，其中序號(hào)1～8分別代表1HindIII單切λDNA分子量標(biāo)記；2SalI單切pGEM-7Zf-1HRE；31HRE PCR結(jié)果；4HindIII和XbaI雙切pGEM-7Zf-1HRE；5HindIII和XbaI雙切pGEM-7Zf-2HRE；6HindIII和XbaI雙切pGEM-7Zf-4HRE；7SalI單切pGL3-4HRE；8BstNI單切pBR322分子量標(biāo)記。
圖4為構(gòu)建重組質(zhì)粒譜pGL3-4HRE-PEIIImut與pGL3-PEIIImut的酶切鑒定結(jié)果，其中序號(hào)1～8分別代表1HindIII單切λDNA分子量標(biāo)記；2EcoRI和EcoRV雙切pCDNA3.1his-PEIII；3HindIII和XbalI雙切pBSKs-PEIIImut；4HindIII單切pGL3；5HindIII和XbaI雙切pGL3；6SmaI單切pGL3-PEIIImut；7SmaI單切pGL3-4HRE-PEIIImut；8BstNI單切pBR322分子量標(biāo)記。
圖5為重組質(zhì)粒pGL3-4HRE-miniCMV-PEIIImut、pGL3-4HRE-miniCMV-Intron II-PEIIImut的酶切鑒定結(jié)果，其中序號(hào)1～4分別代表1SmaI單切pGL3-4HRE-miniCMV-Intron II-PEIIImut；2SmaI單切pGL3-4HRE-miniCMV-PEIIImut；3HindIII和EcoRI雙切λDNA分子量標(biāo)記；4BstNI單切pBR322分子量標(biāo)記。
圖6重組體pGL3-4HRE的構(gòu)建圖譜。
圖7重組體pGL3-PEIIImut的構(gòu)建圖譜。
圖8重組體pGL3-4HRE-miniCMV-PEIIImut構(gòu)建圖譜。
圖9.GnRH-TNF87-TAP-SON、GnRH-TNF87-SON兩種蛋白誘導(dǎo)結(jié)果，其中序號(hào)1～10分別代表1GnRH-TNF87-SON未誘導(dǎo)；2，3，45GnRH-TNF87-SON誘導(dǎo)；6蛋白標(biāo)記；7GnRH-TNF87-TAP-SON未誘導(dǎo)；8，9，10GnRH-TNF87-TAP-SON誘導(dǎo)。
圖10.DNA與GTTS不同比例電泳結(jié)果，檢測(cè)DNA與蛋白結(jié)合情況，其中序號(hào)1～5分別代表1單純DNA；2DNA與蛋白電荷比為8∶1；3DNA與蛋白電荷比為4∶1；4DNA與蛋白電荷比為2∶1；5DNA與蛋白電荷比為1∶1。
圖11.DNA蛋白復(fù)合物在4℃放置一個(gè)月后電泳結(jié)果，其中序號(hào)1～2分別代表1DNA與蛋白GTTS復(fù)合物；2單純DNA。
圖12.GTTS與含綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pIRES-EGFP復(fù)合物轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。含有報(bào)告基因的質(zhì)粒被吞入細(xì)胞后，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)成綠色熒光蛋白，在熒光顯微鏡下，發(fā)出綠色熒光。
圖13.GTTS與pGL3-HRE4-miniCMV-PEIIImut復(fù)合物在缺氧條件下處理Hela細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖譜。
圖14.有氧條件下2BS細(xì)胞不同給藥組的OD值作圖，其中序號(hào)1～6分別代表1空白對(duì)照；2蛋白；3DNAa；4DNAa+蛋白；5DNAb；6.DNAb+蛋白；其中，DNAa為pGL3-4HRE-miniCMV-PEIIImut；DNAb為pGL3-PEIIImut。
圖15.有氧條件下HEK293細(xì)胞不同給藥組的OD值作圖，其中序號(hào)1～10分別代表1.空白對(duì)照；2蛋白；3DNA(a，8ug/ml)；4DNA(a，8ug/ml)+蛋白；5DNA(a，2ug/ml)+蛋白；6DNA(a，0.5ug/ml)+蛋白；7DNA(b，8ug/ml)；8DNA(b，8ug/ml)+蛋白；9DNA(b，2ug/ml)+蛋白；10DNA(b，0.5ug/ml)+蛋白；其中，DNAa為pGL3-HRE4-miniCMV-PEIIImut；DNAb為pGL3-PEIIImut。
圖16.有氧條件下HepG2細(xì)胞不同給藥組的OD值作圖，其中序號(hào)1～10分別代表1.空白對(duì)照；2蛋白；3DNA(a，8ug/ml)；4DNA(a，8ug/ml)+蛋白；5DNA(a，2ug/ml)+蛋白；6DNA(a，0.5ug/ml)+蛋白；7DNA(b，8ug/ml)；8DNA(b，8ug/ml)+蛋白；9DNA(b，2ug/ml)+蛋白；10DNA(b，0.5ug/ml)+蛋白；其中，DNAa為pGL3-HRE4-miniCMV-PEIIImut；DNAb為pGL3-PEIIImut。
圖17.有氧條件下Hela細(xì)胞不同給藥組的OD值作圖，其中序號(hào)1～10分別代表1.空白對(duì)照；2蛋白；3DNA(a，8ug/ml)；4DNA(a，8ug/ml)+蛋白；5DNA(a，2ug/ml)+蛋白；6DNA(a，0.5ug/ml)+蛋白；7DNA(b，8ug/ml)；8DNA(b，8ug/ml)+蛋白；9DNA(b，2ug/ml)+蛋白；10DNA(b，0.5ug/ml)+蛋白；其中，DNAa為pGL3-HRE4-miniCMV-PEIIImut；DNAb為pGL3-PEIIImut。
圖18.有氧條件下MCF-7細(xì)胞不同給藥組的OD值作圖，其中序號(hào)1～10分別代表1.空白對(duì)照；2蛋白；3DNA(a，8ug/ml)；4DNA(a，8ug/ml)+蛋白；5DNA(a，2ug/ml)+蛋白；6DNA(a，0.5ug/ml)+蛋白；7DNA(b，8ug/ml)；8DNA(b，8ug/ml)+蛋白；9DNA(b，2ug/ml)+蛋白；10DNA(b，0.5ug/ml)+蛋白；其中，DNAa為pGL3-HRE4-miniCMV-PEIIImut；DNAb為pGL3-PEIIImut。
圖19.缺氧條件下2BS細(xì)胞不同給藥組的OD值作圖，其中序號(hào)1～6分別代表1空白對(duì)照；2蛋白；3DNAa；4DNAa+蛋白；5DNAb；6.DNAb+蛋白；其中，DNAa為pGL3-4HRE-miniCMV-PEIIImut；DNAb為pGL3-PEIIImut。
圖20.缺氧條件下HepG2細(xì)胞不同給藥組的OD值作圖，其中序號(hào)1～10分別代表1.空白對(duì)照；2蛋白；3DNA(a，8ug/ml)；4DNA(a，8ug/ml)+蛋白；5DNA(a，2ug/ml)+蛋白；6DNA(a，0.5ug/ml)+蛋白；7DNA(b，8ug/ml)；8DNA(b，8ug/ml)+蛋白；9DNA(b，2ug/ml)+蛋白；10DNA(b，0.5ug/ml)+蛋白；其中，DNAa為pGL3-HRE4-miniCMV-PEIIImut；DNAb為pGL3-PEIIImut。。
圖21.缺氧條件下Hela細(xì)胞不同給藥組的OD值作圖，其中序號(hào)1～10分別代表1.空白對(duì)照；2蛋白；3DNA(a，8ug/ml)；4DNA(a，8ug/ml)+蛋白；5DNA(a，2ug/ml)+蛋白；6DNA(a，0.5ug/ml)+蛋白；7DNA(b，8ug/ml)；8DNA(b，8ug/ml)+蛋白；9DNA(b，2ug/ml)+蛋白；10DNA(b，0.5ug/ml)+蛋白；其中，DNAa為pGL3-HRE4-miniCMV-PEIIImut；DNAb為pGL3-PEIIImut。。
圖22.缺氧條件下MCF-7細(xì)胞不同給藥組的OD值作圖，其中序號(hào)1～10分別代表1.空白對(duì)照；2蛋白；3DNA(a，8ug/ml)；4DNA(a，8ug/ml)+蛋白；5DNA(a，2ug/ml)+蛋白；6DNA(a，0.5ug/ml)+蛋白；7DNA(b，8ug/ml)；8DNA(b，8ug/ml)+蛋白；9DNA(b，2ug/ml)+蛋白；10DNA(b，0.5ug/ml)+蛋白；其中，DNAa為pGL3-HRE4-miniCMV-PEIIImut；DNAb為pGL3-PEIIImut。。
圖23.本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)流程圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的總體設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)流程參見(jiàn)圖1和圖23所示。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種非病毒載體，其本質(zhì)是一種靶向性融合蛋白，所述融合蛋白由受體配體多肽、TNF87多肽、核定位序列多肽與富含陽(yáng)性氨基酸的多肽組成。在本發(fā)明這一方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的非病毒載體由受體配體多肽、TNF87多肽及富含陽(yáng)性氨基酸的多肽組成。根據(jù)本發(fā)明，所述富含陽(yáng)性氨基酸的多肽是DNA結(jié)合蛋白SON或其片段；所述TNF87多肽是腫瘤壞死因子(TNF)突變后序列；所述核定位序列多肽是TAP；所述受體配體多肽是所述非病毒載體中的受體配體多肽是能夠與GnRH受體特異性結(jié)合的GnRH或其相關(guān)片段、類(lèi)似物或突變體。由于使用GnRH作為導(dǎo)向分子，所以本發(fā)明人將本發(fā)明的非病毒載體稱為N型非病毒載體。本發(fā)明的非病毒載體對(duì)人體無(wú)免疫原性。
優(yōu)選地，上述受體多肽GnRH的編碼基因是包含大腸桿菌偏愛(ài)密碼子的突變序列，如SEQ ID NO.1所示的序列，或者也可以是其野生型DNA序列。
優(yōu)選地，所述非病毒載體中的TNF87是腫瘤壞死因子(TNF)突變后序列的一個(gè)片段，它促使了融合蛋白的表達(dá)。所述多肽的編碼基因可以是包含大腸桿菌偏愛(ài)密碼子的突變序列，如SEQ ID NO.2所示的序列，或者也可以采用其野生型DNA序列。
優(yōu)選地，所述非病毒載體中含有或不含有核定位序列TAP，均可使表達(dá)型重組體進(jìn)入核內(nèi)表達(dá)。所述編碼TAP的基因可以是包含大腸桿菌偏愛(ài)密碼子的突變序列，如SEQ ID NO.3所示的序列，或者也可以采用其野生型DNA序列。
優(yōu)選地，所述非病毒載體中的富含陽(yáng)性氨基酸的多肽是DNA結(jié)合蛋白SON的第788-859位氨基酸的片段，其氨基酸序列為KVKDTHEKSKKNKNRDKGEKEKKRDSSLRSRSKRSKSSEHKSRKRTSESRSRARKRSSKSKSHRSQTRSR。該片段的編碼DNA序列可以為包含大腸桿菌偏愛(ài)密碼子的突變序列，如SEQ ID NO.4所示的序列，或者也可以采用其野生型DNA序列。
優(yōu)選地，通過(guò)基因工程方法在體外重組獲得融合基因，并在原核與真核細(xì)胞中表達(dá)該融合基因而獲得本發(fā)明的非病毒載體(融合蛋白)。
特別優(yōu)選地，所述非病毒載體是GTTS，即從N端至C端依次由GnRH多肽、TNF87多肽、TAP多肽和DNA結(jié)合蛋白SON的第788-859位氨基酸組成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
特別優(yōu)選地，所述非病毒載體是GTS，即從N端至C端依次由GnRH多肽、TNF87多肽、和DNA結(jié)合蛋白SON的第788-859位氨基酸組成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
選地，通過(guò)基因工程方法在體外重組獲得融合基因，并在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)該融合基因而獲得本發(fā)明的非病毒載體(融合蛋白)。例如在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合基因的DNA序列分別如SEQ ID NO.6所示(編碼GTTS)或其野生型DNA序列和SEQID NO.8所示(編碼GTS)或其野生型DNA序列。它們編碼融合蛋白GTTS和GTS。GTTS從N至C端依次包括GnRH的10個(gè)氨基酸、突變后TNF的87個(gè)氨基酸、核定位序列TAP的42個(gè)氨基酸和人SON的72個(gè)氨基酸，共含51個(gè)賴氨酸和精氨酸，當(dāng)pH＝7時(shí)共帶32個(gè)正電荷。GTS包括GnRH的10個(gè)氨基酸、突變后TNF的87個(gè)氨基酸和人SON的72個(gè)氨基酸，共含41個(gè)賴氨酸和精氨酸，當(dāng)pH＝7時(shí)共帶28個(gè)正電荷。GTTS和GTS的氨基酸序列分別如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合基因分別與溫度誘導(dǎo)表達(dá)型載體pLSD(J.Bacteriology，171(6)1989，3427-3432)重組，分別命名為pLSD-GnRH-TNFmut-TAP-SON和pLSD-GnRH-TNFmut-SON。用上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得可以表達(dá)融合蛋白的工程菌。
在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的非病毒載體和一種表達(dá)型DNA重組體的復(fù)合物的藥物組合物，以用于靶向性惡性腫瘤的基因治療，所述表達(dá)型重組體包含表達(dá)對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)的基因。
所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌毒素、白喉毒素、商陸、蓖麻毒素，或一切其他對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的來(lái)自人體、動(dòng)植物或者微生物的蛋白，或者是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類(lèi)似物，以及人工合成的具有殺細(xì)胞活性的蛋白質(zhì)或多肽，以及相應(yīng)的編碼基因。優(yōu)選地，其中所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌毒素，或者是其第二和第三結(jié)構(gòu)域。
綠膿桿菌毒素(PE)是由綠膿桿菌分泌的一種毒素，其是一種極毒的毒素，僅僅對(duì)小鼠一次靜脈注射0.3微克即可使之在24小時(shí)內(nèi)死亡。對(duì)一個(gè)細(xì)胞來(lái)說(shuō)幾個(gè)分子的毒素的導(dǎo)入即可使這個(gè)細(xì)胞死亡。由于PE這種獨(dú)特的性能，使其作為一種很有前途的毒素被應(yīng)用到艾滋病的基因治療中去。PE具有三個(gè)結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域Ia(AA1-252)為細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域III(AA405-613)為ADP糖基化區(qū)域，結(jié)構(gòu)域II和結(jié)構(gòu)域III又合稱為PE40，而結(jié)構(gòu)域Ib(AA365-404)無(wú)明顯的生物學(xué)功能。為增強(qiáng)毒力，本發(fā)明人將綠膿桿菌毒素第III結(jié)構(gòu)域C端的5個(gè)氨基酸殘基RDELK的密碼子突變?yōu)镵DEL的密碼子，并引入終止密碼子TGATAA而得到重組DNA PEIIImut，其編碼的毒素蛋白的毒力明顯強(qiáng)于原來(lái)的PEIII。為了增加毒素基因PEIIImut在人體內(nèi)表達(dá)的安全性，減少其毒副作用，本發(fā)明另外設(shè)計(jì)了四拷貝的HRE和miniCMV接在毒素基因的上游，以期通過(guò)低氧條件的調(diào)控作用，將毒素基因的表達(dá)限制在缺氧的腫瘤細(xì)胞內(nèi)。
因此，優(yōu)選地，所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)是綠膿桿菌毒素的第三結(jié)構(gòu)域或其突變體，其中所述突變體PEIIImut的氨基酸序列SEQ ID NO.9所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO12所示。
優(yōu)選地，PEIIImut可根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)引入各種表達(dá)載體以用于構(gòu)建表達(dá)型重組體，從而表達(dá)毒素蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)型重組體為基于pGL3而構(gòu)建的表達(dá)型重組體pGL3-PEIIImut或pGL3-4HRE-PEIIImut。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)型重組體為受四拷貝HRE和miniCMV啟動(dòng)子雙重控制下的真核重組表達(dá)型重組體pGL3-HRE4-miniCMV-PEIIImut和pGL3-HRE4-miniCMV-Intron II-PEIIImut。所述HRE基因的DNA序列如SEQ ID NO.10所示。所述miniCMV基因的DNA序列如SEQ ID NO.11所示。
特別優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物包含選自GTTS/pGL3-4HRE-miniCMV-PEIIImut、GTTS/pGL3-4HRE-miniCMV-Intron II-PEIIImut、GTS/pGL3-4HRE-miniCMV-PEIIImut和GTS/pGL3-4HRE-miniCMV-Intron II-PEIIImut、GTTS/pGL3-PEIIImut、GTTS/pGL3-4HRE-PEIIImut、GTS/pGL3-PEIIImut和GTS/pGL3-4HRE-PEIIImut的復(fù)合體。
本發(fā)明所設(shè)計(jì)的靶向蛋白非病毒載體可以有效地介導(dǎo)毒素基因進(jìn)入富含特異性受體GnRHR的腫瘤細(xì)胞，并表達(dá)毒素蛋白，從而殺傷腫瘤細(xì)胞，但將會(huì)有比較嚴(yán)重的毒副作用，而只有在缺氧狀態(tài)下，低氧應(yīng)答元件HRE與miniCMV作為“第二開(kāi)關(guān)”具有很好的選擇性，使毒素基因僅在低氧的環(huán)境(腫瘤細(xì)胞)下啟動(dòng)，發(fā)揮準(zhǔn)確特異靶向性殺傷細(xì)胞表面有GnRH受體的惡性腫瘤細(xì)胞。既不殺傷細(xì)胞表面無(wú)GnRH受體的正常細(xì)胞，也不殺傷細(xì)胞表面有GnRH受體的非缺氧正常細(xì)胞。這樣的“雙開(kāi)關(guān)”設(shè)計(jì)，即利用受體配體的關(guān)系的導(dǎo)向設(shè)計(jì)，以及利用缺氧條件作為基因可控表達(dá)設(shè)計(jì)，則實(shí)現(xiàn)了對(duì)一類(lèi)腫瘤準(zhǔn)確的靶向基因治療設(shè)計(jì)。上述設(shè)計(jì)確保了毒素使用的靶向性和安全性。
在本發(fā)明的這種用于靶向性基因治療的藥物的應(yīng)用中，包含PEIIImut的表達(dá)型重組體與融合蛋白中可結(jié)合DNA的組分即人SON緊密結(jié)合，融合蛋白中的導(dǎo)向組分GnRH通過(guò)與腫瘤細(xì)胞表面的GnRH受體結(jié)合而將復(fù)合物導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，核定位序列TAP有助于將毒素重組體導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)成毒素蛋白，從而將腫瘤細(xì)胞殺死。
具體地說(shuō)，由于本發(fā)明的藥物組合物是將毒素基因?qū)隚nRH受體陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，因此，就不需要毒素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域。正是由于這種原因，本發(fā)明的毒素基因PEIIImut中僅含有綠膿桿菌毒素的具有ADP糖基化酶活性的第III結(jié)構(gòu)域的編碼序列。該編碼序列在靶細(xì)胞中表達(dá)出的蛋白可作為殺死靶細(xì)胞的毒素。另外，本發(fā)明人用白喉毒素C端的4個(gè)氨基酸殘基KDEL替代了PE毒素C端的5個(gè)氨基酸殘基REDLK，由此大大增強(qiáng)了毒素的殺死細(xì)胞能力。另外，由于毒素蛋白是在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，這就徹底避免了毒素蛋白的免疫原性問(wèn)題。即使在靶細(xì)胞崩解后，其中的毒素蛋白(量極少)也許可能被機(jī)體免疫識(shí)別捕獲，從而產(chǎn)生抗體，但這些抗體既無(wú)法清除細(xì)胞內(nèi)的毒素蛋白，也不會(huì)和作為毒素蛋白表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA發(fā)生反應(yīng)。事實(shí)上，這類(lèi)被殺滅的細(xì)胞將迅速被機(jī)體的免疫機(jī)制所清除。
本發(fā)明的融合蛋白中利用人體內(nèi)正常存在的DNA結(jié)合蛋白SON分子中的一部分作為結(jié)合DNA的功能區(qū)。所采用的片段含有72個(gè)氨基酸，其中含有大量堿性氨基酸，特別是賴氨酸和精氨酸，該多肽片段在一定pH條件下帶正電荷，能通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合。其自然形態(tài)本身就在真核生物基因組DNA的折疊、濃聚方面有重要的作用。這樣設(shè)計(jì)可以保證DNA分子充分濃聚的基礎(chǔ)上保證了低免疫原性，且可以被靶細(xì)胞內(nèi)吞。
以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例1 構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-4HRE1.1 單拷貝HRE(缺氧反應(yīng)元件)序列的克隆HRE亦稱反式作用DNA序列，它的核心序列是5’-RCGTG-3’。它具有一個(gè)或一個(gè)以上HIF-1結(jié)合位點(diǎn)，HIF-1通過(guò)結(jié)合HRE來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道HRE位于VEGF 5’端轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)第939-985bp共47個(gè)bp，在此根據(jù)GenBank提供的人外周血來(lái)源的VEGF基因序列設(shè)計(jì)引物，為了方便鑒定、進(jìn)一步克隆多拷貝HRE及將這段序列接入載體pGEM-7Zf中，分別在序列的5’端引入KpnI位點(diǎn)及SalI位點(diǎn)，在序列的3’端引入XhoI位點(diǎn)，同時(shí)以設(shè)計(jì)的引物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到長(zhǎng)度為70bp的目的片段。經(jīng)KpnI與XhoI雙切后，連接入克隆載體pGEM-7Zf的KpnI與XhoI位點(diǎn)之間。利用載體具有的，分別位于插入片段兩端的HindIII與XbaI進(jìn)行酶切鑒定。經(jīng)HindIII與XbaI雙酶切分別得到大小為88bp與2956bp的片段，經(jīng)SalI單切得到大小為3044bp的片段(見(jiàn)圖3)。將此有目的片段插入的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pGEM-7Zf-1HRE。測(cè)序結(jié)果顯示所得序列與GenBank提供的序列吻合。
1.2 4拷貝HRE序列的克隆為了能從單拷貝的HRE克隆出雙拷貝HRE及4拷貝的HRE，在設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增單拷貝HRE時(shí)分別在序列兩端引入了一對(duì)同尾酶SalI與XhoI。載體pGEM-7Zf中存在單一的ScaI酶切位點(diǎn)。XhoI及ScaI雙酶切質(zhì)粒pGEM-7Zf-1HRE，得到大小分別為1878bp、1166bp的兩個(gè)片段，其中1878bp的片段中含有HRE 47個(gè)bp的序列，回收此片段。再以SaII及ScaI雙酶切質(zhì)粒pGEM-7Zf-1HRE，得到大小分別為1221bp、1823bp的兩個(gè)片段，其中1221bp的片段中也含有HRE47個(gè)bp的序列，回收此1221bp的片段。連接回收的兩個(gè)片段，由于SalI與XhoI是同位酶，所以連接后酶切位點(diǎn)消失，兩個(gè)ScaI半位點(diǎn)連接后仍然形成單一的ScaI酶切位點(diǎn)。HRE則由單拷貝增為雙拷貝。經(jīng)HindIII與XbaI雙酶切鑒定，得到有大小為141bp的目的片段插入的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名此含有雙拷貝HRE序列的重組質(zhì)粒為pGEM-7Zf-2HRE。
用相同的方法獲得含有4拷貝HRE序列的重組質(zhì)粒。經(jīng)HindIII與XbaI雙酶切鑒定，得到有大小為247bp的目的片段。命名此含有4拷貝HRE序列的重組質(zhì)粒為pGEM-7Zf-4HRE。測(cè)序結(jié)果顯示完全正確。
1.3 重組質(zhì)粒pGL3-4HRE的構(gòu)建用KpnI及Xh0I從質(zhì)粒pGEM-7Zf-4HRE中酶解下4拷貝HRE序列小片段，將此小片段插入到表達(dá)載體pGL3的KpnI與XhoI的位點(diǎn)間。經(jīng)SalI單切(表達(dá)載體中沒(méi)有SalI位點(diǎn))得到大小為3203bp的片段，將此重組質(zhì)粒命名為pGL3-4HRE。
4HRE基因序列CGTCGACCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCCCTCCCATGCACTCGACCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCCCTCCCATGCACTCGACCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCCCTCCCATGCACTCGACCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCCCTCCCATGCAC實(shí)施例2 重組質(zhì)粒pGL3-4HRE-PEIIImut與pGL3-PEIIImut的構(gòu)建用EcoRI與EcoRV雙酶切由本室保存的pcDNA3.1his-PEIII質(zhì)粒，得到大小為649bp的PEIIImut，再通過(guò)這兩個(gè)酶切位點(diǎn)將PEIIImut序列接入過(guò)度載體pBSKs中。經(jīng)EcoRI與EcoRV雙酶切得到大小為649 bp的目的序列。將此插入了目的基因片段的重組體質(zhì)粒命名為pBSKs-PEIIImut。重組質(zhì)粒pBSKs-PEIIImut中PEIIImut序列兩端具有HindIII及XbaI這兩個(gè)酶切位點(diǎn)，通過(guò)HindIII及XbaI雙酶切再次得到大小為687 bp的PEIIImut基因片段，分別插入到重組體質(zhì)粒pGL3-4HRE-SV40及載體pGL3中的HindIII與XbaI位點(diǎn)之間。前者經(jīng)SmaI單切得到大小為4195bp單帶。(載體pGL3所帶的SmaI位點(diǎn)在接入HRE時(shí)已被切去，故只有PEIIImut基因片段中存在單一的SmaI位點(diǎn)。)后者經(jīng)SmaI單切得到大小分別為888bp與3120bp的兩個(gè)片段。(載體pGL3與PEIIImut基因片段中都存在單一的SmaI位點(diǎn)，故SmaI單切能得到兩個(gè)片段)。將此兩種重組質(zhì)粒分別命名為pGL3-4HRE-PEIIImut與pGL3-PEIIImut。測(cè)序結(jié)果完全正確。
實(shí)施例3 重組質(zhì)粒pGL3-4HRE-miniCMV-PEIIImut和pGL3-4HRE-miniCMV-Intron II-PEIIImut的構(gòu)建因?yàn)镾V40的啟動(dòng)活性很強(qiáng)，無(wú)法選擇只在低氧的腫瘤細(xì)胞中啟動(dòng)，進(jìn)一步改造成miniCMV啟動(dòng)子，使毒素基因只在低氧的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。
在上游加入Bgl II位點(diǎn)AGATCT，在其后加入Sma I(CCCGGG)，便于鑒定，下游加入HindIII(AAGCTT)。根據(jù)發(fā)明人已有的研究，兔IntronII可以增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性。在miniCMV提高特異性的同時(shí)，在其后加入兔IntronII，防止啟動(dòng)子的活性過(guò)低。
實(shí)施例4 含有融合基因GnRH-TNFmut-TAP-SON和GnRH-TNFmut-SON重組體的構(gòu)建將SON片段中的72個(gè)aa完全改變成大腸桿菌嗜好的密碼子，TNF原有157個(gè)氨基酸，改短成87個(gè)氨基酸，對(duì)84、86和87位氨基酸進(jìn)行改造，使其沒(méi)有TNF活性，構(gòu)建GnRH-TNF87-TAP-SON；同時(shí)考慮TAP可能會(huì)影響表達(dá)，構(gòu)建了GnRH-TNF87-SON，分別接入pLSD載體進(jìn)行表達(dá)。(表達(dá)情況見(jiàn)圖9)實(shí)施例5 融合基因GTTS的誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體提取和檢測(cè)5.1 溫度誘導(dǎo)及包涵體的提取5.1.1 大體積培養(yǎng)將工程菌接種于50ml LB培養(yǎng)基，同時(shí)加入終濃度為100mg/ml的氨芐青霉素，32℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜。按2％接種量重新接種于兩瓶分別含有500ml LB/Amp+培養(yǎng)液的2L三角瓶中。在32℃下振搖培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)。然后置于42℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)誘導(dǎo)5h。4000g離心、收集菌體，置于-20℃反復(fù)凍融。
5.1.2 洗滌細(xì)胞6000g×15分鐘離心收集細(xì)菌，稱重濕菌體。
用3％Triton X-100洗滌菌體，攪拌器上攪勻30分鐘，6000g，15分鐘離心收集用量為10ml-50ml緩沖液/1g濕菌體(包括下列各種洗滌緩沖液)。
5.1.3 溶菌酶破細(xì)胞用緩沖液將細(xì)胞懸浮，緩沖液配制50mmol/L Tris.Cl(pH8.5-9.0)，2mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，0.5％ Triton X-100，溶菌酶1mg/ml)。用攪拌器在室溫下攪拌，使得懸浮液因溶菌酶的作用而粘稠。
5.1.4 超聲破細(xì)胞每次超打10秒，間隔15秒，20-50次作用(視菌體濃度而定)，至菌體不再粘稠為止。然后離心收集，6000g×15分鐘。上述操作應(yīng)在冰水中進(jìn)行，為防止炭化，超聲功率不宜過(guò)大，在玻璃燒杯中進(jìn)行較好，超聲波探頭深入液面大于3厘米，距杯底2厘米位好。
5.1.5 5％Triton X-100洗滌用緩沖液徹底懸浮沉淀，攪拌并超聲波處理30次，參見(jiàn)上述步驟2.3。緩沖液為50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，2mmol/L EDTA，5％TritonX-100。離心收集沉淀，6000g，15分鐘。
5.2 蛋白鑒定5.2.1 SDS-PAGE蛋白電泳采用Tris-甘氨酸-SDS-PAGE。使用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，分離膠濃度為15％或12％，濃縮膠為5％或3％。樣品加入3×上樣緩沖液，99℃變性6～10分鐘。離心，取上清上樣。在Tris-甘氨酸電泳緩沖液中先以8mA電泳至樣品進(jìn)入分離膠，再以15mA電泳至溴酚藍(lán)剛泳出分離膠。
試劑 15％分離膠 12％分離膠5％濃縮膠分離膠緩沖液 5.0ml 5.0ml濃縮膠緩沖液 1.5ml30％丙烯酰 8.0ml 10.0ml1.2mlAP 100μl 100μl30μlTEMED10μl 10μl 8μld2H2O 6.9ml 5.0ml 3.5ml5.2.2 蛋白質(zhì)染色5.2.2.1 考馬斯亮藍(lán)染色電泳后用至少5倍于凝膠體積的考馬斯亮藍(lán)染色液浸泡凝膠，室溫下染色4小時(shí)以上，回收染液，凝膠浸泡于脫色液中數(shù)小時(shí)，其間更換幾次脫色液，直至蛋白條帶清晰可見(jiàn)。脫色后，凝膠保存于20％甘油水溶液中。
5.2.2.2 銀染電泳后用至少5倍于凝膠體積的凝膠固定液固定凝膠上的蛋白質(zhì)，室溫下平緩搖動(dòng)2小時(shí)以上，50％乙醇洗兩次，每次平緩搖動(dòng)20分鐘，棄去乙醇，加入新鮮配制的0.02％硫代硫酸鈉溶液浸泡1分鐘，再用10倍體積的去離子水洗三次，棄去最后一次洗滌用水后，將凝膠浸泡于至少5倍體積的銀染液中，室溫下平緩搖動(dòng)30分鐘，棄去銀染液，凝膠兩面用去離子水略加沖洗后，加入新鮮配制的顯色液，待蛋白條帶達(dá)到所需強(qiáng)度時(shí)立即用終止液終止顯色反應(yīng)。
5.2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定試劑盒蛋白濃度測(cè)定(BCA protein Assay Kit)首先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。將BSA原液分別稀釋配制2mg/ml，1.5mg/ml，1.0mg/ml，0.75mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.025mg/ml及0mg/ml濃度的樣品。再將待檢測(cè)的蛋白質(zhì)干粉溶于1ml無(wú)菌水中。取試劑盒中的A液5ml與B液100μl混勻。在9個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品與25μl待測(cè)蛋白溶液中各加入200μl的A、B混合液。輕混勻后將所有樣品置于37℃反應(yīng)30分鐘。然后用酶標(biāo)儀在490nm與630nm的波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度及OD值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蛋白質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)作圖。再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)樣品OD值相應(yīng)的蛋白濃度，測(cè)定范圍為0.01-2.0mg/ml。
實(shí)施例6 從大腸桿菌的包涵體中純化蛋白GnRH-TNF87-TAP-SON1.包涵體按每克20ml比例，用包涵體溶解液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，100mM NaCL，10mM DTT，7M鹽酸胍，PH9.0)溶解包涵體，過(guò)0.45μm孔徑的濾膜。
2.反相柱平衡緩沖液為10％的乙腈；洗脫緩沖液為90％的乙腈。上樣后先用起始緩沖液沖洗柱子，再用20％的洗脫緩沖液洗1個(gè)柱體積，20-60％的洗脫緩沖液洗5個(gè)柱體積，并在60％維持2個(gè)柱體積。用A260及A280監(jiān)測(cè)，收集各洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。然后，合并含有目的蛋白的各管冷凍抽干。
3.離子柱平衡緩沖液為0.1M乙酸鈉，pH約為5.1；洗脫緩沖液為2M氯化鈉+0.1M乙酸鈉。用平衡緩沖液溶解凍干后樣品，用20-80％的梯度洗脫，當(dāng)電導(dǎo)值達(dá)到100mS/cm時(shí)，目的蛋白被洗脫下來(lái)，收集各洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。
4.疏水柱平衡緩沖液為2M氯化鈉+0.1M乙酸鈉；洗脫緩沖液為0.1M乙酸鈉，pH約為5.1。合并目的蛋白峰，0-100％梯度洗脫，當(dāng)電導(dǎo)降到100mS/cm時(shí)，目的蛋白被洗脫下來(lái)，收集各洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。
實(shí)施例7 含有毒素基因表達(dá)型重組體的純化1.按Sambrook等人(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)第2版)所述的方法裂解菌體。
2.收集上清，加入1MCaCl2，使其終濃度為0.2M，12,000g/min離心10min。
3.層析捕獲，將澄清的裂解液上Hitrap DEAE陰離子交換柱，此介質(zhì)能強(qiáng)有力結(jié)合核酸；平衡緩沖液為25mM Tris-Cl，1mM EDTA，pH8.0；洗脫緩沖液為25mM Tris-Cl，1mM EDTA，1M NaCl，pH8.0。上樣后先用起始緩沖液沖洗柱子，然后用洗脫緩沖液0-100％進(jìn)行洗脫，約5個(gè)柱體積。當(dāng)電導(dǎo)值達(dá)到35mS/cm時(shí)，DNA和RNA被洗脫下來(lái)，收集各管瓊脂糖電泳檢測(cè)。
4.精制，將收集的核酸組分上第二根高分辨率的陰離子交換柱resourceQ進(jìn)一步純化，除去殘余的RNA、染色體DNA、蛋白及內(nèi)毒素。平衡緩沖液為25mM Tris-Cl，1mM EDTA，pH8.0；洗脫緩沖液為25mM Tris-Cl，1mM EDTA，1M NaCl，pH8.0。洗脫的梯度為20-100％，當(dāng)電導(dǎo)值達(dá)到70mS/cm時(shí)目的峰洗脫下來(lái)，收集各管瓊脂糖電泳檢測(cè)。
實(shí)施例8 靶向基因藥物GTTS與含有毒素基因表達(dá)型重組體復(fù)合物的制備本實(shí)施例所用融合蛋白GTTS既作為靶向蛋白，又作為DNA結(jié)合蛋白。由于SON富含帶正電的賴氨酸，將與帶負(fù)電性的DNA分子結(jié)合，從而使整個(gè)復(fù)合物分子整體電性趨近于中性，在瓊脂糖電泳上表現(xiàn)出電泳遷移率滯后的現(xiàn)象。
將DNA與蛋白溶液按不同比例混合(1∶1，2∶1，4∶1，8∶1)，在0.8％瓊脂糖電泳凝膠上觀察電泳遷移率變化(見(jiàn)圖10)。0.8％瓊脂糖電泳凝膠上可見(jiàn)DNA-蛋白混合液有明顯拖后，其中1∶1混合后的滯留結(jié)果最好。另外，DNA與蛋白復(fù)合物在4℃放置一個(gè)月，0.8％瓊脂糖電泳檢測(cè)，DNA仍幾乎完全滯留在加樣孔中(見(jiàn)圖11)，說(shuō)明形成復(fù)合物后在4℃可以穩(wěn)定保存。
實(shí)施例9 GTTS與報(bào)告基因質(zhì)粒復(fù)合物轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果GTTS與含綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pIRES-EGFP復(fù)合物轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞(見(jiàn)圖12)。
實(shí)施例10 GTTS與兩種毒素重組體構(gòu)成的復(fù)合物殺傷細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果10.1 DNA-蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后MTT法檢測(cè)1.在96孔培養(yǎng)板上孵育細(xì)胞，每孔約1×104細(xì)胞，18-24小時(shí)。
2.棄去培養(yǎng)液，加入不同濃度的DNA-蛋白復(fù)合物200μl，每個(gè)樣品做3復(fù)孔，在有氧或缺氧條件下孵育36小時(shí)。
3.每孔加入10μl 10mg/ml MTT，孵育2-4小時(shí)。
4.加入終止液(20％SDS，50％二甲基甲酰胺)100μl，37℃孵育。
5.酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490nm檢測(cè)OD值。
在有氧條件下，蛋白與pGL3-PEIII對(duì)GnRH陽(yáng)性的細(xì)胞在8ug/ml劑量組與對(duì)照組OD值相比，P＜0.05，均有顯著性差異；對(duì)GnRH陰性對(duì)照細(xì)胞無(wú)殺傷作用，P＞0.05。對(duì)GnRH陽(yáng)性的HEK293(人胚腎細(xì)胞)、HepG2(肝癌細(xì)胞)、Hela(宮頸癌)和MCF-7(乳腺癌)的殺傷率(1-存活率)分別為72.9％、57.9％、54.1％和51.7％。由此證明了GnRH具有很好的導(dǎo)向性。但這一結(jié)果同時(shí)說(shuō)明，這種在有氧條件下出現(xiàn)的強(qiáng)烈的殺傷作用亦可發(fā)生在其表面有GnRH受體的一切非腫瘤的正常細(xì)胞。因此，這個(gè)設(shè)計(jì)方案對(duì)臨床應(yīng)用研究可能有一定的毒副作用。而這一結(jié)果，則可以作為下述設(shè)計(jì)的一個(gè)依據(jù)。非病毒載體GTTS與pGL3-4HRE-miniCMV-PEIII復(fù)合物在有氧條件下，對(duì)GnRH陽(yáng)性細(xì)胞即使在8ug/ml劑量組與對(duì)照組OD值相比，P＞0.05，沒(méi)有顯著性差異。
在缺氧條件下，非病毒載體蛋白與pGL3-PEIII對(duì)GnRH陽(yáng)性的細(xì)胞在8ug/ml劑量組與對(duì)照組的OD值相比，P＜0.05，均有顯著性差異。對(duì)GnRH陽(yáng)性細(xì)胞HepG2、Hela和MCF-7的殺傷率(1-存活率)分別為61.3％、60.1％和53.9％。這一結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，利用SV40啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)在獲得高殺傷率的同時(shí)會(huì)有一定的毒副作用。只有實(shí)現(xiàn)功能基因可控表達(dá)設(shè)計(jì)，才可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的靶向殺傷設(shè)計(jì)。非病毒載體蛋白與pGL3-HRE4-miniCMV-PEIII對(duì)GnRH陽(yáng)性細(xì)胞在8ug/ml劑量組與對(duì)照組OD值相比，P＜0.05，具有顯著性差異。對(duì)HepG2、Hela和MCF-7的殺傷率(1-存活率)分別為57.1％、56.9％和41.7％。
表1.MTT法檢測(cè)有氧情況下GTTS與毒素表達(dá)型重組體復(fù)合物對(duì)各種細(xì)胞的影響(光密度值反映細(xì)胞存活情況)并計(jì)算殺傷率(n＝3，x±SD)

*為與空白對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05，均有顯著性差異；( )內(nèi)的數(shù)值為進(jìn)一步計(jì)算殺傷率的結(jié)果。
DNAa為pGL3-4HRE-miniCMV-PEIIImutDNAb為pGL3-PEIIImut蛋白為GTTS
表2.MTT法檢測(cè)缺氧情況下GTTS與毒素重組體復(fù)合物對(duì)各種細(xì)胞的影響(光密度值反映細(xì)胞存活情況)并計(jì)算殺傷率(n＝3，x±SD)

*為與空白對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05，均有顯著性差異；( )內(nèi)的數(shù)值為進(jìn)一步計(jì)算殺傷率的結(jié)果。
DNAa為pGL3-4HRE-miniCMV-PEIIImutDNAb為pGL3-PEIIImut蛋白為GTTS
序列表<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>N型非病毒載體以及包含其的藥物組合物<130>I20031304CB<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>1caacattggt cttatggtct gcgtccgggt 30<210>2<211>261<212>DNA<213>人工序列<400>2gtaagatcat cttcaagaac cccgagtgac aagcctgtag cccatgttgt agcaaaccct 60caagctgagg ggcagctcca gtggctgaac cgccgggcca atgccctcct ggccaatggc120gtggagctga gagataacca gctggtggtg ccatcagagg gcctgtacct catctactcc180caggtcctct tcaagggcca aggctgcccc tccacccatg tgctcctcac ccacaccatc240agccgcatcg ttgtcttttt a 261<210>3<211>126<212>DNA<213>人工序列<400>3atgtccgacg ctcaggacgg tccgcgtgtt cgttacaacc cgtacaccac ccgtccgaac 60cgtcgtggtg acacctggca cgaccgtgac cgtatccacg ttaccgttcg tcgtgaccgt120gctccg 126<210>4<211>216<212>DNA<213>人工序列<400>4aaagttaaag acactcacga aaaatccaaa aaaaacaaaa accgtgacaa aggtgaaaaa 60
gaaaaaaaac gtgactcttc cctgcgttct cgttccaaac gttccaaatc ttctgaacac120aaatcccgta aacgtacttc cgaatctcgt tctcgtgctc gtaaacgttc ctctaaatcc180aaatctcacc gttctcagac ccgttcccgt tcccgt 216<210>5<211>218<212>PRT<213>人工序列<400>5Met Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Arg Ser1 5 10 15Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn20 25 30Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala35 40 45Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro50 55 60Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln65 70 75 80Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile85 90 95Val Val Phe Leu Tyr Val Met Ser Asp Ala Gln Asp Gly Pro Arg Val100 105 110Arg Tyr Asn Pro Tyr Thr Thr Arg Pro Asn Arg Arg Gly Asp Thr Trp115 120 125His Asp Arg Asp Arg Ile His Val Thr Val Arg Arg Asp Arg Ala Pro130 135 140Gly Thr Lys Val Lys Asp Thr His Glu Lys Ser Lys Lys Asn Lys Asn145 150 155 160Arg Asp Lys Gly Glu Lys Glu Lys Lys Arg Asp Ser Ser Leu Arg Ser165 170 175Arg Ser Lys Arg Ser Lys Ser Ser Glu His Lys Ser Arg Lys Arg Thr
180 185 190Ser Glu Ser Arg Ser Arg Ala Arg Lys Arg Ser Ser Lys Ser Lys Ser195 200 205His Arg Ser Gln Thr Arg Ser Arg Ser Arg210 215<210>6<211>660<212>DNA<213>人工序列<400>6atgcaacatt ggtcttatgg tctgcgtccg ggtgaattcg taagatcatc ttcaagaacc 60ccgagtgaca agcctgtagc ccatgttgta gcaaaccctc aagctgaggg gcagctccag120tggctgaacc gccgggccaa tgccctcctg gccaatggcg tggagctgag agataaccag180ctggtggtgc catcagaggg cctgtacctc atctactccc aggtcctctt caagggccaa240ggctgcccct ccacccatgt gctcctcacc cacaccatca gccgcatcgt tgtcttttta300tacgtaatgt ccgacgctca ggacggtccg cgtgttcgtt acaacccgta caccacccgt360ccgaaccgtc gtggtgacac ctggcacgac cgtgaccgta tccacgttac cgttcgtcgt420gaccgtgctc cgggtaccaa agttaaagac actcacgaaa aatccaaaaa aaacaaaaac480cgtgacaaag gtgaaaaaga aaaaaaacgt gactcttccc tgcgttctcg ttccaaacgt540tccaaatctt ctgaacacaa atcccgtaaa cgtacttccg aatctcgttc tcgtgctcgt600aaacgttcct ctaaatccaa atctcaccgt tctcagaccc gttcccgttc ccgttgataa660<210>7<211>174<212>PRT<213>人工序列<400>7Met Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu phe Val Arg Ser1 5 10 15Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn20 25 30Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala35 40 45
Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro50 55 60Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln65 70 75 80Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile85 90 95Val Val Phe Leu Gly Thr Lys Val Lys Asp Thr His Glu Lys Ser Lys100 105 110Lys Asn Lys Asn Arg Asp Lys Gly Glu Lys Glu Lys Lys Arg Asp Ser115 120 125Ser Leu Arg Ser Arg Ser Lys Arg Ser Lys Ser Ser Glu His Lys Ser130 135 140Arg Lys Arg Thr Ser Glu Ser Arg Ser Arg Ala Arg Lys Arg Ser Ser145 150 155 160Lys Ser Lys Ser His Arg Ser Gln Thr Arg Ser Arg Ser Arg165 170<210>8<211>528<212>DNA<213>人工序列<400>8atgcaacatt ggtcttatgg tctgcgtccg ggtgaattcg taagatcatc ttcaagaacc 60ccgagtgaca agcctgtagc ccatgttgta gcaaaccctc aagctgaggg gcagctccag120tggctgaacc gccgggccaa tgccctcctg gccaatggcg tggagctgag agataaccag180ctggtggtgc catcagaggg cctgtacctc atctactccc aggtcctctt caagggccaa240ggctgcccct ccacccatgt gctcctcacc cacaccatca gccgcatcgt tgtcttttta300ggtaccaaag ttaaagacac tcacgaaaaa tccaaaaaaa acaaaaaccg tgacaaaggt360gaaaaagaaa aaaaacgtga ctcttccctg cgttctcgtt ccaaacgttc caaatcttct420gaacacaaat cccgtaaacg tacttccgaa tctcgttctc gtgctcgtaa acgttcctct480aaatccaaat ctcaccgttc tcagacccgt tcccgttccc gttgataa 528<210>9<211>213
<213>人工序列<400>9Met Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln1 5 10 15Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu20 25 30Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala35 40 45Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp50 55 60Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp pro Ala Leu Ala Tyr65 70 75 80Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn85 90 95Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe100 105 110Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val115 120 125Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr130 135 140Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro145 150 155 160Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro165 170 175Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu180 185 190Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Asp Pro195 200 205Pro Lys Asp Glu Leu210
<210>10<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>10ccacagtgca tacgtgggct ccaacaggtc ctcttccctc ccatgca 47<210>11<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>11ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc 60<210>12<211>639<212>DNA<213>人工序列<400>12atgctcggcg acggcggcga cgtcagcttc agcacccgcg gcacgcagaa ctggacggtg 60gagcggctgc tccaggcgca ccgccaactg gaggagcgcg gctatgtgtt cgtcggctac120cacggcacct tcctcgaagc ggcgcaaagc atcgtcttcg gcggggtgcg cgcgcgcaac180caggacctcg acgcgatctg gcgcggtttc tatatcgccg gcgatccggc gctggcctac240ggctacgccc aggaccagga acccgacgca cgcggccgga tccgcaacgg tgccctgctg300cgggtctatg tgccgcgctc gagcctgccg ggcttctacc gcaccagcct gaccctggcc360gcgccggagg cggcgggcga ggtcgaacgg ctgatcggcc atccgctgcc gctgcgcctg420gacgccatca ccggccccga ggaggaaggc gggcgcctgg agaccattct cggctggccg480ctggccgagc gcaccgtggt gattccctcg gcgatcccca ccgacccgcg caacgtcggc540ggcgacctcg acccgtccag catccccgac aaggaacagg cgatcagcgc cctgccggac600tacgccagcc agcccggcaa accgccgaag gacgaactg 639
權(quán)利要求
1.一種非病毒載體，其為從N端至C端依次包含一種受體配體多肽、TNF87多肽、核定位序列多肽與一種富含陽(yáng)性氨基酸的多肽的靶向性融合蛋白，其中所述受體配體多肽為促性腺激素釋放肽GnRH或其相關(guān)片段、類(lèi)似物或突變體；所述TNF87多肽是腫瘤壞死因子突變后序列的一個(gè)片段，所述核定位序列多肽是TAP，所述富含陽(yáng)性氨基酸的多肽是DNA結(jié)合蛋白SON或其片段。
2.如權(quán)利要求1所述的非病毒載體，其為GnRH-TNF87-TAP-SON(GTTS)，其從N端至C端依次為促性腺激素釋放肽GnRH、TNF87多肽、核定位序列多肽TAP和DNA結(jié)合蛋白SON的第788-859位氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.一種非病毒載體，其為從N端至C端依次包含一種受體配體多肽、TNF87多肽與一種富含陽(yáng)性氨基酸的多肽的靶向性融合蛋白，其中所述受體配體多肽為促性腺激素釋放肽GnRH或其相關(guān)片段、類(lèi)似物或突變體；所述TNF87多肽是腫瘤壞死因子突變后序列的一個(gè)片段，所述富含陽(yáng)性氨基酸的多肽是DNA結(jié)合蛋白SON或其片段。
4.如權(quán)利要求3所述的非病毒載體，其為GnRH-TNF87-SON(GTS)，其從N端至C端依次為促性腺激素釋放肽GnRH、TNF87多肽和DNA結(jié)合蛋白SON的第788-859位氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
5.一種融合基因，其編碼權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的非病毒載體。
6.如權(quán)利要求5的融合基因，其編碼權(quán)利要求2的非病毒載體GnRH-TNF87-TAP-SON(GTTS)，具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求5的融合基因，其編碼權(quán)利要求4的非病毒載體GnRH-TNF87-SON(GTS)，具有SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
8.包含權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的融合基因的重組體。
9.如權(quán)利要求8所述的重組體，其為pLSD-GnRH-TNF87-TAP-SON。
10.如權(quán)利要求8所述的重組體，其為pLSD-GnRH-TNF87-SON。
11.由權(quán)利要求8的重組體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
12.生產(chǎn)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的非病毒載體的方法，包括在合適表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，并分離和純化由所述宿主細(xì)胞表達(dá)的所述非病毒載體。
13.一種用于靶向性腫瘤基因治療的藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的非病毒載體以及一種表達(dá)型重組體的復(fù)合物，所述表達(dá)型重組體包含一種表達(dá)對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)的基因。
14.如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌毒素、白喉毒素、商陸、蓖麻毒素，或其他一切對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的來(lái)自人體、動(dòng)植物或者微生物的蛋白，或者是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類(lèi)似物；以及根據(jù)人工合成的對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)或多肽。
15.如權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其中所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌毒素，或者是其第二或第三功能結(jié)構(gòu)域。
16.如權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其中所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)是綠膿桿菌毒素的第三功能結(jié)構(gòu)域或其突變體，所述突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.9，核苷酸序列如SEQ ID NO12所示。
17.如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述表達(dá)型重組體為基于pGL3而構(gòu)建的表達(dá)型重組體pGL3-PEIIImut或pGL3-4HRE-PEIIImut。
18.如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述表達(dá)型重組體為受四拷貝HRE和miniCMV啟動(dòng)子雙重控制的真核重組表達(dá)型重組體pGL3-4HRE-miniCMV-PEIIImut或pGL3-4HRE-miniCMV-IntronII-PEIIImut；其中HRE基因的DNA序列如SEQ ID NO.10所示；其中miniCMV基因的DNA序列如SEQ ID NO.11所示。
19.如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其選自GTTS/pGL3-4HRE-miniCMV-PEIIImut、GTTS/pGL3-4HRE-miniCMV-Intron II-PEIIImut、GTS/pGL3-4HRE-miniCMV-PEIIImut和GTS/pGL3-4HRE-miniCMV-Intron II-PEIIImut、GTTS/pGL3-PEIIImut、GTTS/pGL3-4HRE-PEIIImut、GTS/pGL3-PEIIImut和GTS/pGL3-4HRE-PEIIImut。
20.權(quán)利要求13-19任一項(xiàng)的藥物組合物作為對(duì)惡性腫瘤的準(zhǔn)確靶向藥物的應(yīng)用。
21.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中所述惡性腫瘤為對(duì)GnRH受體陽(yáng)性的肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、垂體瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及非病毒載體及編碼其的融合基因，所述非病毒載體將能夠在體內(nèi)可控表達(dá)對(duì)細(xì)胞具有殺傷作用的蛋白質(zhì)的表達(dá)型重組體靶向性地導(dǎo)入GnRH受體陽(yáng)性的缺氧腫瘤細(xì)胞，以使該表達(dá)型重組體在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出蛋白，從而準(zhǔn)確殺傷清除所述的細(xì)胞，而不傷及正常細(xì)胞。本發(fā)明還涉及包含所述非病毒載體和所述表達(dá)型重組體的藥物組合物及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1566347SQ03123940
公開(kāi)日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月11日
發(fā)明者盧圣棟, 楊奎, 李濤, 杜延平, 陳偉京, 路金芝 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所