Eml4-alk融合基因熒光定量pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種EML4‐ALK融合基因熒光定量PCR檢測的試劑盒，適用于肺腺癌中EML4‐ALK融合基因突變的檢測。本發(fā)明所述的試劑盒包括針對EML4‐ALK融合基因9種融合變體的保守序列特異設(shè)計(jì)的探針及引物以及陽性對照物。該試劑盒能快速、準(zhǔn)確、高敏感度地檢測9種最常見的EML4‐ALK融合基因變體，包括亞型1（E13；A20）、亞型2（E20；A20）、亞型3（E6a/b；A20）、亞型4（E14；A20）、亞型5（E2a/b；A20）、亞型6（E18；A20）、亞型7（E14；A20）7種變異亞型的9種融合變體，從而建立檢測9種最常見EML4‐ALK融合基因變體的實(shí)時熒光定量PCR體系。
【專利說明】EML4-ALK融合基因熒光定量PCR檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種EML4-ALK融合基因熒光定量PCR檢測的試劑盒，適用于肺腺癌中EML4-ALK融合基因突變的檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。近50多年來，世界各國特別是工業(yè)發(fā)達(dá)國家，肺癌的發(fā)病率和病死率均迅速上升。1995年全世界有60萬人死于肺癌，而且每年人數(shù)都在上升，2003年世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的死亡率是110萬/年，發(fā)病率是120萬/年。肺癌的病因至今尚不完全明確，醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)表明肺癌的致病因素主要為吸煙(包括二手煙)，80%的男性肺癌和75%的女性肺癌是由吸煙造成的，此外與石綿、氡、砷、電離輻射、鹵素烯類、多環(huán)性芳香化合物、鎳等工業(yè)致癌物的接觸，種族、家屬史對肺癌的發(fā)病均有影響。
[0003]肺癌分小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，NSCLC包括鱗癌、腺癌、腺鱗癌、大細(xì)胞癌、類癌等。NSCLC占所有肺癌病例的80% — 90%，嚴(yán)重威脅人類健康。NSCLC的治療包括手術(shù)、化療、放療、分子靶向治療及生物免疫治療等多種方法。手術(shù)治療是NSCLC最佳治療方法，但當(dāng)NSCLC發(fā)現(xiàn)時，僅20% — 30%的病例有手術(shù)指征，且術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍高達(dá)50%以上。分子靶向治療以其符合生理、低毒和理論上高效的特點(diǎn)，越來越成為非小細(xì)胞肺癌治療的熱點(diǎn)。祀向治療為肺癌的治療增添了一個新的領(lǐng)域，也為肺癌的治療帶來了新的希望。
[0004]分子靶向治療是一種針對腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程的細(xì)胞信號傳導(dǎo)及其他生物學(xué)途徑的治療手段，其特點(diǎn)是能選擇性地作用于腫瘤細(xì)胞，定向阻斷癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、信號傳導(dǎo)，阻止腫瘤新生血管的生成，破壞癌細(xì)胞的新陳代謝，故特異性高，不良反應(yīng)小，擁有良好的發(fā)展前景。肺癌靶向治療涉及腫瘤細(xì)胞生長的多個重要環(huán)節(jié)，目前研究較為成熟且應(yīng)用于臨床的主要有兩個作用點(diǎn)，`一個是血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)，另一個為表皮生長因子受體(EGFR)。此外，還有最新發(fā)現(xiàn)的棘皮動物微管結(jié)合蛋白4-間變淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein like4, EML4-ALK)融合基因。已有研究提不該融合基因可能存在于肺癌在內(nèi)的多種實(shí)體腫瘤，但以NSCLC的檢出率最聞，同時因其與EGFR突變、K-ras突變的不共存現(xiàn)象以及含有EML4-ALK基因患者的鮮明臨床特征，提示該靶點(diǎn)是肺腺癌特異性較高的分子標(biāo)記物。EML4-ALK的發(fā)現(xiàn)定義了 NSCLC的一個新亞型，堪稱近年來NSCLC研究史上一個里程碑式的事件。編碼EML4的基因位于2號染色體短臂的21號基因座位，而編碼ALK的基因位于2號染色體23號基因座位，兩者在染色體上相隔約1270萬個堿基對，且轉(zhuǎn)錄方向相反?；蛉诤蠒r，EML4基因在染色體上發(fā)生斷裂，形成不同長度的外顯子拼接片段，調(diào)轉(zhuǎn)方向，插人位置相對保守的ALK基因19、20外顯子之間，從而形成長度不等的各種EML4-ALK融合變體，目前，至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 9種變異亞型，分別為亞型I (E13 ；A20)(這種命名法指的是EML4的13號外顯子與ALK的20號外顯子發(fā)生融合)、亞型 2 (E20 ;A20)、亞型 3 (E6a/b ;A20)、亞型 4 (E14 ;A20)、亞型 5 (E2a/b ;A20)、亞型6 (E13 ；A20)(注:亞型6為EML4的第13外顯子加上一個49bp的小片段再與ALK的第20外顯子相連)、亞型7 (E14 ;A20)、亞型8 (E15 ;A20)、亞型9 (E18 ;A20)。最常見的融合變體為亞型I (E13 ;A20)，其次為亞型3 (E6a/b ;A20)，經(jīng)檢測，這兩種變體在EML4-ALK融合基因NSCLC患者的發(fā)生率分別為33%和29%。所有這些融合基因均有生物學(xué)功能，表達(dá)產(chǎn)物為一種嵌合型酪氨酸激酶。EML4-ALK融合變異日前已經(jīng)被鑒定為NSCLC，特別是肺腺癌的一個獨(dú)特的分子亞型，EML4-ALK融合基因陽性患者有其獨(dú)特的臨床病理特征。針對這一靶點(diǎn)的檢測，將有助于篩選EGFR-TKI合適的治療人群并開啟NSCLC靶向治療的新領(lǐng)域。
[0005]目前國際上檢測EML4-ALK融合基因常見的技術(shù)方法有:逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、熒光原位雜交(FISH)、免疫組織化學(xué)(IHC)、RACE-偶聯(lián)PCR測序(RACE-coupledPCR sequencing)。
[0006]RT-PCR是PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形，在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。RT-PCR可能是確認(rèn)NSCLC存在ALK融合基因的一種快速診斷方法，理論上，這種技術(shù)的優(yōu)勢在于其檢測突變轉(zhuǎn)錄本的高敏感性，如發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物則意味著ALK融合基因。但在臨床實(shí)踐中，該技術(shù)面臨諸多挑戰(zhàn):(I)引物多元化，研究需要設(shè)計(jì)多個引物檢測9個變異體和2個非EMIA易位；(2)福爾馬林固定石蠟包埋的組織DNA高度片段化，不利于檢測；(3)PCR結(jié)果常出現(xiàn)假陽性，很難作為常規(guī)臨床檢測方法。
[0007]FISH是用特定熒光標(biāo)記探針與靶DNA進(jìn)行雜交，通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光素標(biāo)記物，在熒光顯微鏡下觀察探針標(biāo)記或位點(diǎn)的技術(shù)。FISH是檢測ALK融合基因更加特異的方法，其優(yōu)勢在于可商業(yè)開發(fā)系列探針，應(yīng)用于肺腺癌檢測ALK融合基因。雖然FISH是檢測肺腺癌ALK融合基因的一種敏感和特異的方法，但也并非萬無一失的，而且不能鑒別不同的EML4-ALK融合基因變體。不同數(shù)量斷裂信號的治療策略以及結(jié)果判讀目前仍無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。
[0008]IHC是指帶顯色劑標(biāo)記 的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測定的一項(xiàng)新技術(shù)。IHC的最大優(yōu)勢是檢測腫瘤特異性抗原的表達(dá)而不丟失能鑒別正常組織和病理組織的細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)特征。對于活檢組織切片使用組織染色來檢測ALK蛋自表達(dá)，結(jié)果可能是微弱和局部的，同時IHC方法總是存在一定的主觀性，對弱陽性結(jié)果的判斷需要進(jìn)一步用FISH等技術(shù)來驗(yàn)證。此外IHC同樣不能鑒定ALK融合患者具體屬于那種變體亞型。
[0009]廣東省肺癌研究所吳一龍教授課題組采用RACE-偶聯(lián)PCR測序技術(shù)檢測分析ALK基因的融合變異，該方法的獨(dú)到之處在于采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)結(jié)合兩輪PCR技術(shù)來富集擴(kuò)增ALK基因的融合變體，敏感性高，不但能檢測EML4與ALK的融合，而且可以檢測到其他任何基因與ALK的融合，還進(jìn)一步通過測序的手段能夠明確融合是來自EML4-ALK多種變體中的具體哪一種。但是，此方法涉及兩輪PCR和測序，步驟繁瑣且耗時，成本昂貴，難以普及推廣。
[0010]最新出現(xiàn)的實(shí)時熒光定量PCR把核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實(shí)時檢測技術(shù)結(jié)合在一起，借助于熒光信號檢測PCR產(chǎn)物，解決了傳統(tǒng)PCR技術(shù)不能定量和擴(kuò)增產(chǎn)物污染的問題，避免了普通定量PCR操作過程中的污染，使其操作簡便、快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，已成為基因表達(dá)定量的強(qiáng)有力的工具，具有敏感性和特異性高、重復(fù)性好及定量范圍廣等特點(diǎn)。定量檢測要求檢測方法敏感、特異、準(zhǔn)確、精確、重復(fù)性好、線性范圍廣，且在各個基因型之間無差異。全自動的熒光定量PCR因其更優(yōu)異的準(zhǔn)確性、精確度和可重復(fù)性，成為最有前景的定量檢測技術(shù)。
[0011]實(shí)時突光定量PCR 技術(shù)(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ_PCR)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，它是一種在PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的突光探針,該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報(bào)告突光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；剛開始時，探針結(jié)合在DNA任一一條單鏈上；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5’端一 3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染性、具實(shí)時性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的在于提供一種EML4-ALK融合基因變體的熒光定量PCR檢測試劑盒，該試劑盒能快速、準(zhǔn)確、高敏感度地檢測9種最常見的EML4-ALK融合基因變體，包括亞型I(E13 ;A20)、亞型 2 (E20 ;A20)、亞型 3 (E6a/b ;A20)、亞型 4 (E14 ;A20)、亞型 5 (E2a/b ；A20)、亞型6 (E18 ;A20)、亞型7 (E14 ;A20)7種變異亞型的9種融合變體，從而建立檢測9種最常見EML4-ALK融合基因變體的實(shí)時熒光定量PCR體系。
[0013]本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:一種快速、準(zhǔn)確檢測EML4-ALK融合基因的熒光定量PCR檢測試劑盒。該試劑盒包括熒光定量反應(yīng)液預(yù)混液(PCR Master Mix)、熒光定量反應(yīng)液A、熒光定量反應(yīng)液B、熒光定量反應(yīng)液C、熒光定量反應(yīng)液D、熒光定量反應(yīng)液E、熒光定量反應(yīng)液F、熒光定量反應(yīng)液G、熒光定量反應(yīng)液H、熒光定量反應(yīng)液I，陽性對照樣品A、陽性對照樣品B、陽性對照樣品C、陽性對照樣品D、陽性對照樣品E、陽性對照樣品F、陽性對照樣品G、陽性對照樣品H、陽性對照樣品`I。
[0014]熒光定量反應(yīng)液A:檢測的是EML4-ALK亞型I (E13 ；A20)融合基因。
[0015]反應(yīng)體系包括:檢測EML4-ALK亞型I (E13 ；A20)融合基因的引物和探針。
[0016]變體1-正向引物:5’ -GAGTCATGCTTATATGGAGCAAAACT-3’ (SEQ ID N0.1)。
[0017]變體1-反向引物:5’ -TCAGCTTGTACTCAGGGCTCTG-3’(SEQ ID N0.2)。
[0018]變體1-熒光探針:5’ -FAM-CCTAAAGTGTACCGCCGGAAGCACC-TAMRA-3’ (SEQ IDN0.3)。
[0019]熒光探針的5 ^端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
[0020]陽性對照樣品A:包含所檢測EML4-ALK亞型I (E13 ；A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒。
[0021]熒光定量反應(yīng)液B:檢測的是EML4-ALK亞型2 (E20 ；A20)融合基因。
[0022]反應(yīng)體系包括:檢測EML4-ALK亞型2 (E20 ；A20)融合基因的引物和探針。
[0023]變體2-正向引物:5’ -AAGTATATAATGTCTAACTCGGGAGACTATGA-3’ (SEQ ID N0.4)0
[0024]變體2-反向引物:5’ -AGCAGTAGTTGGGGTTGTAGTCG-3’(SEQ ID N0.5)。[0025]變體2-熒光探針:5’ -FAM-TTGTACTTGTACCGCCGGAAGCACCA-TAMRA-3’ (SEQ IDN0.6)。
[0026]熒光探針的5 ^端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
[0027]陽性對照樣品B:包含所檢測EML4-ALK亞型2 (E20 ；A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒。
[0028]熒光定量反應(yīng)液C:檢測的是EML4-ALK亞型3a (E6a ；A20)融合基因。
[0029]反應(yīng)體系包括:檢測EML4-ALK亞型3a (E6a ；A20)融合基因的引物和探針。
[0030]變體3a-正向引物:5’ -ACCAAAACTGCAGACAAGCATAAAG-3’ (SEQ ID N0.7)。
[0031]變體3a-反向引物:5’ -AGCTTGCTCAGCTTGTACTCAGG-3’(SEQ ID N0.8)。
[0032]變體3a-熒光探針:5’ -FAM-TGTCATCATCAACCAAGTGTACCGCCG-TAMRA-3’ (SEQ IDN0.9)。
[0033]熒光探針的5 ^端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
[0034]陽性對照樣品C: 包含所檢測EML4-ALK亞型3a (E6a ；A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒。
[0035]熒光定量反應(yīng)液D:檢測的是EML4-ALK亞型3b (E6b ；A20)融合基因
[0036]反應(yīng)體系包括:檢測EML4-ALK亞型3b (E6b ；A20)融合基因的引物和探針。
[0037]變體3b-正向引物:5’ -AACACCCAAATTAATACCAAAAGTTACC-3’ (SEQ ID N0.10)。
[0038]變體3b-反向引物:5’ -CAGCTCCTGGTGCTTCCG-3’(SEQ ID N0.11)。
[0039]變體3b-熒光探針:5’ -FAM-AATGTCAACTCGCGAAA-TAMRA-3’ (SEQ ID N0.12)。
[0040]熒光探針的5 ^端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
[0041]陽性對照樣品D:包含所檢測EML4-ALK亞型3b (E6b ；A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒。
[0042]熒光定量反應(yīng)液E:檢測的是EML4-ALK亞型4 (E14 ；A20)融合基因。
[0043]反應(yīng)體系包括:檢測EML4-ALK亞型4 (E14 ；A20)融合基因的引物和探針。
[0044]變體4-正向引物:5’ -AGTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTCA-3’(SEQ ID N0.13)。
[0045]變體4-反向引物:5’ -TTGTCAGATGAGAAATGGGATGTTA-3’ (SEQ ID N0.14)。
[0046]變體4-熒光探針:5’ -FAM-AGCTTGTACTCAGGGCTCATCCAGCATATCTCTA-TAMRA-3’(SEQ IDN0.15)。
[0047]熒光探針的5 ^端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
[0048]陽性對照樣品E:包含所檢測EML4-ALK亞型4 (E14 ；A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒。
[0049]熒光定量反應(yīng)液F:檢測的是EML4-ALK亞型5a (E2a ；A20)融合基因。
[0050]反應(yīng)體系包括:檢測EML4-ALK亞型5a (E2a ；A20)融合基因的引物和探針。
[0051]變體5a-正向引物:5，-GTTTTGAGGCGTCTTGCAATCT-3’ (SEQ ID N0.16)。
[0052]變體5a-反向引物:5’ -GGTTGTAGTCGGTCATGATGGTC-3’(SEQ ID N0.17)。
[0053]變體5a-熒光探針:5’ -FAM-CTCAAGTAAAGTGTACCGCCGGAAGCA-TAMRA-3’ (SEQ IDN0.18)。
[0054]熒光探針的5 ^端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
[0055]陽性對照樣品F:包含所檢測EML4-ALK亞型5a (E2a ；A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒。
[0056]熒光定量反應(yīng)液G:檢測的是EML4-ALK亞型5b (E2b ；A20)融合基因。
[0057]反應(yīng)體系包括:檢測EML4-ALK亞型5b (E2b ；A20)融合基因的引物和探針。
[0058]變體5b-正向引物:5’ -GTGCTTCCGGCGGTACACT-3’ (SEQ ID N0.19)。
[0059]變體5b-反向引物:5’ -TTGAGGCGTCTTGCAATCTCT-3’(SEQ ID N0.20)。
[0060]變體5b-熒光探針:5，-FAM-CCTCCCCTGAGCTCTGAACCTTTACTTGA-TAMRA-3 ’( SEQ IDN0.21)。
[0061]熒光探針的5'端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
[0062]陽性對照樣品G:包含所檢測EML4-ALK亞型亞型5b (E2b ；A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒。
[0063]熒光定量反應(yīng)液H:檢測的是EML4-ALK亞型6 (E18 ；A20)融合基因
[0064]反應(yīng)體系包括:檢測EML4-ALK亞型6 (E18 ；A20)融合基因的引物和探針。
[0065]變體6-正向引物:5’ -GGGTGGTCAGCTGCAACAT-3’(SEQ ID N0.22)。
[0066]變體 6-反向引物:5’ -GAGACTCAGGTGGAGTCATGCTT-3’(SEQ ID N0.23)。
[0067]變體6-熒光探針:5’-FAM-CCACTTCCTTTAGGTCCTTTCCCAGGTGT-TAMRA-3’ (SEQ IDN0.24)。熒光探針的Y端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
[0068]陽性對照樣品H:包含所檢測EML4-ALK亞型6 (E18 ；A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒。
[0069]熒光定量反應(yīng)液1:檢測的是EML4-ALK亞型7 (E14 ；A20)融合基因。
[0070]反應(yīng)體系包括:檢測EML4-ALK亞型7 (E14 ；A20)融合基因的引物和探針。
[0071]變體7-正向引物:5’ -CAGTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTC-3’(SEQ ID N0.25)。
[0072]變體7-反向引物:5’ -TTGTCAGATGAGAAATGGGATGTTAT-3’ (SEQ ID N0.26)。
[0073]變體7-熒光探針:5’ -FAM-TGGCTTGCAGCTCCTGGTGCTCTATT-TAMRA-3’ (SEQ IDN0.27)。
[0074]熒光探針的5 ^端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
[0075]陽性對照樣品1:包含所檢測EML4-ALK亞型7 (E14 ；A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒。
[0076]本發(fā)明所述的EML4-ALK融合基因熒光定量PCR檢測試劑盒的原理為:采用熒光定量PCR方法對EML4-ALK融合基因進(jìn)行定量檢測。分別針對EML4-ALK融合基因9種融合變體的保守序列特異設(shè)計(jì)TaqMan探針及引物一對，當(dāng)遇到EML4-ALK融合基因相應(yīng)融合變體特定基因序列時，TaqMan探針可與之完全結(jié)合，PCR擴(kuò)增時，熒光報(bào)告基團(tuán)因酶解分離而發(fā)出熒光，能夠?qū)崟r檢測相應(yīng)熒光信號的積累，從而實(shí)現(xiàn)檢測EML4-ALK融合基因含量的目的。
[0077]本發(fā)明提供的9種融合變體的全基因序列雖然是GENBANK已公開的序列，但保守序列的確定卻是需要篩選比對以及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的，選定好保守序列之后，再通過Primerf軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)引物和探針序列，并于NCBI上blast驗(yàn)證其特異性后再經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并優(yōu)化反應(yīng)相關(guān)條件。
[0078]本發(fā)明提供的兩端都標(biāo)有突光發(fā)光基團(tuán)的特異性突光探針，在探針完整時，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5'端報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)而被3'端淬滅基團(tuán)淬滅，所以體系中沒有熒光信號的變化。而一旦它與模板特異性的結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間，隨著引物的延伸，Taq DNA聚合酶在鏈延伸過程中遇到與模板相結(jié)合的探針，其5' -3'外切酶活性就會將探針切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離熒光淬滅基團(tuán)，這樣就破壞了兩熒光基團(tuán)之間的FRET，報(bào)告基團(tuán)所釋放出來的熒光就可以被內(nèi)置在定量檢測儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測到。PCR每經(jīng)過一個循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數(shù)增長的過程，熒光信號的強(qiáng)弱就代表了模板DNA的拷貝數(shù)的多少。因此本發(fā)明不僅可用于簡單的定性檢測，亦可用做樣本具體含量的定量檢測。 [0079]與現(xiàn)有檢測方法比較，本技術(shù)采用熒光定量PCR技術(shù)檢測EML4-ALK融合基因具有以下優(yōu)勢:
[0080]1.檢測靈敏度高，特異性好:本發(fā)明分別針對EML4-ALK融合基因9種變異體設(shè)計(jì)了特異性引物和熒光探針，相關(guān)反應(yīng)液分管進(jìn)行檢測，可以排除各引物間的干擾，比將采用混合反應(yīng)液的情形更能極大地提高檢測特異性和靈敏度，且假陽性低
[0081]2.線性關(guān)系好，可定量檢測，由于熒光信號的強(qiáng)弱與模板擴(kuò)增產(chǎn)物的對數(shù)呈線性關(guān)系，通過熒光信號的檢測對樣品初始模板濃度進(jìn)行定量，誤差??；
[0082]3.操作簡單，自動化程度高，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)對PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增和檢測在閉管的情況下一步完成，不需要開蓋，交叉污染和污染環(huán)境機(jī)會少，因此也就降低了結(jié)果偏差的幾率；
[0083]4.結(jié)果判讀明確、直觀，可對結(jié)果進(jìn)行定量分析。熒光定量PCR法結(jié)果的判讀:在域值線以上有擴(kuò)增曲線的標(biāo)本均為陽性標(biāo)本，結(jié)果判讀非常簡單、直觀；
[0084]5.檢測的樣本量大，一次最多可檢測384例；
[0085]6.安全:整個體系中不包含有毒有害物質(zhì)，對操作員和環(huán)境都無危害；
[0086]7.沒有后處理，不用雜交、電泳、拍照。
[0087]8.本發(fā)明提供的特異性檢測試劑盒能一次性篩查EML4-ALK融合基因9種變異體，快速簡便。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0088]圖1 為 EML4-ALK 亞型 I (E13 ；A20)融合基因的 FQ-PCR 圖。
[0089]圖2為EML4-ALK亞型I (E13 ；A20)融合基因的測序結(jié)果圖。
[0090]圖3 為 EML4-ALK 亞型 2 (E20 ；A20)融合基因的 FQ-PCR 圖。
[0091]圖4為EML4-ALK亞型2 (E20 ；A20)融合基因的測序結(jié)果圖。
[0092]圖5 為 EML4-ALK 亞型 3a (E6a ；A20)融合基因的 FQ-PCR 圖。
[0093]圖6為EML4-ALK亞型3a (E6a ；A20)融合基因的測序結(jié)果圖。
[0094]圖7 為 EML4-ALK 亞型 3b (E6b ；A20)融合基因的 FQ-PCR 圖。
[0095]圖8為EML4-ALK亞型3b (E6b ；A20)融合基因的測序結(jié)果圖。
[0096]圖9 為 EML4-ALK 亞型 4 (E14 ；A20)融合基因的 FQ-PCR 圖。
[0097]圖10為EML4-ALK亞型4 (E14 ；A20)融合基因的測序結(jié)果圖。
[0098]圖11 為 EML4-ALK 亞型 5a (E2a ；A20)融合基因的 FQ-PCR 圖。
[0099]圖12為EML4-ALK亞型5a (E2a ；A20)融合基因的測序結(jié)果圖。
[0100]圖13 為 EML4-ALK 亞型 5b (E2b ；A20)融合基因的 FQ-PCR 圖。
[0101]圖14為EML4-ALK亞型5b (E2b ；A20)融合基因的測序結(jié)果圖。[0102]圖15 為 EML4-ALK 亞型 6 (E18 ；A20)融合基因的 FQ-PCR 圖。
[0103]圖16為EML4-ALK亞型6 (E18 ；A20)融合基因的測序結(jié)果圖。
[0104]圖17 為 EML4-ALK 亞型 7 (E14 ；A20)融合基因的 FQ-PCR 圖。
[0105]圖18為EML4-ALK亞型7 (E14 ；A20)融合基因的測序結(jié)果圖。
[0106]圖19為EML4-ALK融合基因特異性檢測的FQ-PCR圖。
【具體實(shí)施方式】
[0107]樣本說明:下面實(shí)施例中所用陽性樣本收集自中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科臨床病理診斷的EML4-ALK基因融合的蠟塊組織。從蠟塊中提取基因組DNA供以下的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。
[0108]實(shí)施例1:EML4-ALK亞型I (E13 ；A20)融合基因的檢測設(shè)計(jì)能特異性檢測EML4-ALK亞型I (E13 ；A20)融合基因的探針及引物一對:
[0109]變體1-正向引物:5’ -GAGTCATGCTTATATGGAGCAAAACT-3’ (SEQ ID N0.1)；
[0110]變體1-反向引物:5’ -TCAGCTTGTACTCAGGGCTCTG-3’ (SEQ ID N0.2)；
[0111]變體1-Taqman-探針:5’ -FAM-CCTAAAGTGTACCGCCGGAAGCACC-TAMRA-3’ (SEQ IDN0.3)；
[0112]然后優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行FQ-PCR的檢測:反應(yīng)體系為15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探針各 0.2μ I (20μ Μ)，樣品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*Taqmanuniversal PCR0
[0113]Master Mix (購自美國應(yīng)用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0114]PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，擴(kuò)增反應(yīng)65個循環(huán)。同時在熒光定量試驗(yàn)中，需要檢測樣品的同時，還需要設(shè)置樣品參考品，以確定試驗(yàn)的有效性，如圖1所示，為EML4-ALK亞型I (E13 ；A20)融合基因陽性樣本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線；另外，將上述實(shí)施例1中的樣品進(jìn)行測序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)施例中由上述熒光定量檢測試驗(yàn)檢測出EML4-ALK亞型I (E13 ；A20)融合基因，如圖2所示,通過測序結(jié)果可以看出確實(shí)在該位點(diǎn)發(fā)生相應(yīng)的基因融合，其與熒光定量檢測試驗(yàn)的結(jié)果完全一致。以此發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的EML4-ALK融合基因熒光定量PCR檢測試劑盒能夠準(zhǔn)確地確定EML4-ALK亞型
I(E13 ；A20)融合基因突變情況。
[0115]實(shí)施例2:EML4-ALK亞型2 (E20 ；A20)融合基因的檢測
[0116]設(shè)計(jì)能特異性檢測EML4-ALK亞型2 (E20 ；A20)融合基因的探針及引物一對:
[0117]變體2-正向引物:5’ -AAGTATATAATGTCTAACTCGGGAGACTATGA-3’ (SEQ ID N0.4)；
[0118]變體2-反向引物:5’ -AGCAGTAGTTGGGGTTGTAGTCG-3’ (SEQ ID N0.5)；
[0119]變體2-Taqman-探針:5，-FAM-TTGTACTTGTACCGCCGGAAGCACCA-TAMRA-3，(SEQ IDN0.6)；
[0120]然后優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行FQ-PCR的檢測:反應(yīng)體系為15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探針各 0.2μ I (20μ Μ)，樣品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*TaqmanuniversalPCR
[0121]Master Mix (購自美國應(yīng)用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0122]PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，擴(kuò)增反應(yīng)65個循環(huán)。同時在熒光定量試驗(yàn)中，需要檢測樣品的同時，還需要設(shè)置樣品參考品，以確定試驗(yàn)的有效性，如圖3所示，為EML4-ALK亞型2 (E20 ；A20)融合基因陽性樣本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線；另外，將上述實(shí)施例2中的樣品進(jìn)行測序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)施例中由上述熒光定量檢測試驗(yàn)檢測出EML4-ALK亞型2 (E20 ；A20)融合基因，如圖4所示,通過測序結(jié)果可以看出確實(shí)在該位點(diǎn)發(fā)生相應(yīng)的基因融合，其與熒光定量檢測試驗(yàn)的結(jié)果完全一致。以此發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的EML4-ALK融合基因熒光定量PCR檢測試劑盒能夠準(zhǔn)確地確定EML4-ALK亞型
2(E20 ；A20)融合基因突變情況。
[0123]實(shí)施例3:EML4-ALK亞型3a (E6a ；A20)融合基因的檢測
[0124]設(shè)計(jì)能特異性檢測EML4-ALK亞型3a (E6a ；A20)融合基因的探針及引物一對:
[0125]變體3a-正向引物:5’ -ACCAAAACTGCAGACAAGCATAAAG-3’ (SEQ ID N0.7)；
[0126]變體3a-反向引物:5’ -AGCTTGCTCAGCTTGTACTCAGG-3’ (SEQ ID N0.8)；
[0127]變體3a-Taqman-探針:5 ’ -FAM-TGTCATCATCAACCAAGTGTACCGCCG-TAMRA-3 ’ (SEQID N0.9)；
[0128]然后優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行FQ-PCR的檢測:反應(yīng)體系為15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探針各 0.2μ I (20μ Μ)，樣品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*Taqmanuniversal PCR [0129]Master Mix (購自美國應(yīng)用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0130]PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，擴(kuò)增反應(yīng)65個循環(huán)。同時在熒光定量試驗(yàn)中，需要檢測樣品的同時，還需要設(shè)置樣品參考品，以確定試驗(yàn)的有效性，如圖5所示，為EML4-ALK亞型3a (E6a ;A20)融合基因陽性樣本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線；另外，將上述實(shí)施例3中的樣品進(jìn)行測序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)施例中由上述熒光定量檢測試驗(yàn)檢測出EML4-ALK亞型3a (E6a ;A20)融合基因，如圖6所示,通過測序結(jié)果可以看出確實(shí)在該位點(diǎn)發(fā)生相應(yīng)的基因融合，其與熒光定量檢測試驗(yàn)的結(jié)果完全一致。以此發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的EML4-ALK融合基因熒光定量PCR檢測試劑盒能夠準(zhǔn)確地確定EML4-ALK亞型3a (E6a;A20)融合基因突變情況。
[0131]實(shí)施例4:EML4-ALK亞型3b (E6b ；A20)融合基因的檢測
[0132]設(shè)計(jì)能特異性檢測EML4-ALK亞型3b (E6b ；A20)融合基因的探針及引物一對:
[0133]變體3b-正向引物:5’ -AACACCCAAATTAATACCAAAAGTTACC-3’ (SEQ ID N0.10)；
[0134]變體3b-反向引物:5’ -CAGCTCCTGGTGCTTCCG-3’ (SEQ ID N0.11)；
[0135]變體3b-Taqman-探針:5，-FAM-AATGTCAACTCGCGAAA-TAMRA-3’ (SEQ ID N0.12)；
[0136]然后優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行FQ-PCR的檢測:反應(yīng)體系為15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探針各 0.2μ I (20μ Μ)，樣品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*TaqmanuniversalPCR
[0137]Master Mix (購自美國應(yīng)用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0138]PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，擴(kuò)增反應(yīng)65個循環(huán)。同時在熒光定量試驗(yàn)中，需要檢測樣品的同時，還需要設(shè)置樣品參考品，以確定試驗(yàn)的有效性，如圖7所示，為EML4-ALK亞型3b (E6b ;A20)融合基因陽性樣本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線；另外，將上述實(shí)施例4中的樣品進(jìn)行測序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)施例中由上述熒光定量檢測試驗(yàn)檢測出EML4-ALK亞型3b (E6b ;A20)融合基因，如圖8所示,通過測序結(jié)果可以看出確實(shí)在該位點(diǎn)發(fā)生相應(yīng)的基因融合，其與熒光定量檢測試驗(yàn)的結(jié)果完全一致。以此發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的EML4-ALK融合基因熒光定量PCR檢測試劑盒能夠準(zhǔn)確地確定EML4-ALK亞型3b (E6b ；A20)融合基因突變情況。
[0139]實(shí)施例5:EML4-ALK亞型4 (E14 ；A20)融合基因的檢測
[0140]設(shè)計(jì)能特異性檢測EML4-ALK亞型4 (E14 ；A20)融合基因的探針及引物一對:
[0141]變體4-正向引物:5’ -AGTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTCA-3’ (SEQ ID N0.13)；
[0142]變體4-反向引物:5’ -TTGTCAGATGAGAAATGGGATGTTA-3’ (SEQ ID N0.14)；
[0143]變體4-Taqman-探針:5，-FAM-AGCTTGTACTCAGGGCTCATCCAGCATATCTCTA-TAMRA-3 ’(SEQ ID N0.15)；
[0144]然后優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行FQ-PCR的檢測:反應(yīng)體系為15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探針各 0.2μ I (20μ Μ)，樣品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*TaqmanuniversalPCR
[0145]Master Mix (購自美國應(yīng)用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0146]PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，擴(kuò)增反應(yīng)65個循環(huán)。同時在熒光定量試驗(yàn)中，需要檢測樣品的同時，還需要設(shè)置樣品參考品，以確定試驗(yàn)的有效性，如圖9所示，為EML4-ALK亞型4 (E14 ；A20)融合基因陽性樣本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線；另外，將上述實(shí)施例5中的樣品進(jìn)行測序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)施例中由上述熒光定量檢測試驗(yàn)檢測出EML4-ALK亞型4 (E14 ;A20)融合基因，如圖10所示,通過測序結(jié)果可以看出確實(shí)在該位點(diǎn)發(fā)生相應(yīng)的基因融合，其與熒光定量檢測試驗(yàn)的結(jié)果完全一致。以此發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的EML4-ALK融合基因熒光定量PCR檢測試劑盒能夠準(zhǔn)確地確定EML4-ALK亞型4 (E14 ；A20)融合基因突變情況。
[0147]實(shí)施例6:EML4-ALK亞型5a (E2a ；A20)融合基因的檢測
[0148]設(shè)計(jì)能特異性檢測EML4-ALK亞型5a (E2a ；A20)融合基因的探針及引物一對:
[0149]變體5a-正向引物:5’ -GTTTTGAGGCGTCTTGCAATCT-3’ (SEQ ID N0.16)；
[0150]變體5a-反向引物:5’ -GGTTGTAGTCGGTCATGATGGTC-3’ (SEQ ID N0.17)；
[0151]變體5a-Taqman-探針:5，-FAM-CTCAAGTAAAGTGTACCGCCGGAAGCA-TAMRA-3 ’ (SEQID N0.18)；
[0152]然后優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行FQ-PCR的檢測:反應(yīng)體系為15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探針各 0.2μ I (20μ Μ)，樣品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*TaqmanuniversalPCR
[0153]Master Mix (購自美國應(yīng)用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0154]PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，擴(kuò)增反應(yīng)65個循環(huán)。同時在熒光定量試驗(yàn)中，需要檢測樣品的同時，還需要設(shè)置樣品參考品，以確定試驗(yàn)的有效性，如圖11所示，為EML4-ALK亞型5a (E2a ；A20)融合基因陽性樣本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線；另外，將上述實(shí)施例6中的樣品進(jìn)行測序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)施例中由上述熒光定量檢測試驗(yàn)檢測出EML4-ALK亞型5a (E2a ；A20)融合基因，如圖12所示,通過測序結(jié)果可以看出確實(shí)在該位點(diǎn)發(fā)生相應(yīng)的基因融合，其與熒光定量檢測試驗(yàn)的結(jié)果完全一致。以此發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的EML4-ALK融合基因熒光定量PCR檢測試劑盒能夠準(zhǔn)確地確定EML4-ALK亞型5a (E2a;A20)融合基因突變情況。
[0155]實(shí)施例7:EML4-ALK亞型5b (E2b ；A20)融合基因的檢測[0156]設(shè)計(jì)能特異性檢測EML4-ALK亞型5b (E2b ；A20)融合基因的探針及引物一對: [0157]變體5b-正向引物:5，-GTGCTTCCGGCGGTACACT-3’ (SEQ ID N0.19)；
[0158]變體5b-反向引物:5’ -TTGAGGCGTCTTGCAATCTCT-3’ (SEQ ID N0.20)；
[0159]變體5b-Taqman-探針:5，-FAM-CCTCCCCTGAGCTCTGAACCTTTACTTGA-TAMRA-3，(SEQID N0.21)；
[0160]然后優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行FQ-PCR的檢測:反應(yīng)體系為15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探針各 0.2μ I (20μ Μ)，樣品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*TaqmanuniversalPCR
[0161]Master Mix (購自美國應(yīng)用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0162]PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，擴(kuò)增反應(yīng)65個循環(huán)。同時在熒光定量試驗(yàn)中，需要檢測樣品的同時，還需要設(shè)置樣品參考品，以確定試驗(yàn)的有效性，如圖13所示，為EML4-ALK亞型5b (E2b ；A20)融合基因陽性樣本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線；另外，將上述實(shí)施例7中的樣品進(jìn)行測序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)施例中由上述熒光定量檢測試驗(yàn)檢測出EML4-ALK亞型5b (E2b ；A20)融合基因，如圖14所示，通過測序結(jié)果可以看出確實(shí)在該位點(diǎn)發(fā)生相應(yīng)的基因融合，其與熒光定量檢測試驗(yàn)的結(jié)果完全一致。以此發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的EML4-ALK融合基因熒光定量PCR檢測試劑盒能夠準(zhǔn)確地確定EML4-ALK亞型5b (E2b ；A20)融合基因突變情況。
[0163]實(shí)施例8:EML4-ALK亞型6 (E18 ；A20)融合基因的檢測
[0164]設(shè)計(jì)能特異性檢測EML4-ALK亞型6 (E18 ；A20)融合基因的探針及引物一對:
[0165]變體6-正向引物:5’ -GGGTGGTCAGCTGCAACAT-3’ (SEQ ID N0.22)；
[0166]變體6-反向引物:5’ -GAGACTCAGGTGGAGTCATGCTT-3’ (SEQ ID N0.23)；
[0167]變體6-Taqman-探針:5，-FAM-CCACTTCCTTTAGGTCCTTTCCCAGGTGT-TAMRA-3，(SEQID N0.24)；
[0168]然后優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行FQ-PCR的檢測:反應(yīng)體系為15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探針各 0.2μ I (20μ Μ)，樣品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*TaqmanuniversalPCR
[0169]Master Mix (購自美國應(yīng)用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0170]PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，擴(kuò)增反應(yīng)65個循環(huán)。同時在熒光定量試驗(yàn)中，需要檢測樣品的同時，還需要設(shè)置樣品參考品，以確定試驗(yàn)的有效性，如圖15所示，為EML4-ALK亞型6 (E18 ;A20)融合基因陽性樣本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線；另外，將上述實(shí)施例8中的樣品進(jìn)行測序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)施例中由上述熒光定量檢測試驗(yàn)檢測出EML4-ALK亞型6 (E18 ;A20)融合基因，如圖16所示,通過測序結(jié)果可以看出確實(shí)在該位點(diǎn)發(fā)生相應(yīng)的基因融合，其與熒光定量檢測試驗(yàn)的結(jié)果完全一致。以此發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的EML4-ALK融合基因熒光定量PCR檢測試劑盒能夠準(zhǔn)確地確定EML4-ALK亞型6 (E18 ；A20)融合基因突變情況。
[0171]實(shí)施例9:EML4-ALK亞型7 (E14 ；A20)融合基因的檢測
[0172]設(shè)計(jì)能特異性檢測EML4-ALK亞型7 (E14 ；A20)融合基因的探針及引物一對:
[0173]變體7-正向引物:5’ -CAGTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTC-3’ (SEQ ID N0.25)；
[0174]Variant7-反向引物:5’-TTGTCAGATGAGAAATGGGATGTTAT-3’ (SEQ ID N0.26)；[0175]變體7-Taqman-探針:5，-FAM-TGGCTTGCAGCTCCTGGTGCTCTATT-TAMRA-3 ’ (SEQ IDN0.27)；
[0176]然后優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行FQ-PCR的檢測:反應(yīng)體系為15 μ 1，正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探針各 0.2μ I (20μ Μ)，樣品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*TaqmanuniversalPCR
[0177]Master Mix (購自美國應(yīng)用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0178]PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，擴(kuò)增反應(yīng)65個循環(huán)。同時在熒光定量試驗(yàn)中，需要檢測樣品的同時，還需要設(shè)置樣品參考品，以確定試驗(yàn)的有效性，如圖17所示，為EML4-ALK亞型7 (E14 ;A20)融合基因陽性樣本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線；另外，將上述實(shí)施例9中的樣品進(jìn)行測序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)施例中由上述熒光定量檢測試驗(yàn)檢測出EML4-ALK亞型7 (E14 ;A20)融合基因，如圖18所示,通過測序結(jié)果可以看出確實(shí)在該位點(diǎn)發(fā)生相應(yīng)的基因融合，其與熒光定量檢測試驗(yàn)的結(jié)果完全一致。以此發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的EML4-ALK融合基因熒光定量PCR檢測試劑盒能夠準(zhǔn)確地確定EML4-ALK亞型7 (E14 ；A20)融合基因突變情況。
[0179]實(shí)施例10:特異性檢測實(shí)驗(yàn)
[0180]采用本試劑盒分別檢測以下幾種融合基因:RET_KIF5B融合基因、ROSl融合基因、EML4-ALK融合基因。
[0181]檢測結(jié)果為:EML4_ALK融合基因?qū)?yīng)檢測孔有特異性熒光定量PCR擴(kuò)增曲線，融合類型為亞型1，檢測結(jié)果為陽性；其余兩個均無特異性擴(kuò)增曲線，檢測結(jié)果為陰性(見圖19)。
[0182]由上可知:FQ_PCR法不僅是快速、高效、靈敏的檢測方法，而且其結(jié)果的判讀非常明確、直觀，結(jié)果亦是可靠、特異的。
【權(quán)利要求】
1.一種EML4-ALK融合基因熒光定量PCR檢測試劑盒，包括熒光定量反應(yīng)液預(yù)混液、熒光定量反應(yīng)液、陽性對照樣品，其特征在于: 所述熒光定量反應(yīng)液包括:熒光定量反應(yīng)液A、熒光定量反應(yīng)液B、熒光定量反應(yīng)液C、熒光定量反應(yīng)液D、熒光定量反應(yīng)液E、熒光定量反應(yīng)液F、熒光定量反應(yīng)液G、熒光定量反應(yīng)液H、熒光定量反應(yīng)液I ; 其中，所述熒光定量反應(yīng)液A包括:檢測EML4-ALK亞型I (E13 ；A20)融合基因的序列為SEQ ID N0.1的正向引物、序列為SEQ ID N0.2的反向引物和序列為SEQ ID N0.3的探針；所述熒光定量反應(yīng)液B包括:檢測EML4-ALK亞型2 (E20 ;A20)融合基因的序列為SEQID N0.4的正向引物、序列為SEQ ID N0.5的反向引物和序列為SEQ ID N0.6的探針；所述熒光定量反應(yīng)液C包括:檢測EML4-ALK亞型3a(E6a ;A20)融合基因的序列為SEQID N0.7的正向引物、序列為SEQ ID N0.8的反向引物和序列為SEQ ID N0.9的探針；所述熒光定量反應(yīng)液D包括:檢測EML4-ALK亞型3b(E6b ;A20)融合基因的序列為SEQID N0.10的正向引物、序列為SEQ ID N0.11的反向引物和序列為SEQ ID N0.12的探針；所述熒光定量反應(yīng)液E包括:檢測EML4-ALK亞型4 (E14 ;A20)融合基因的序列為SEQID N0.13的正向引物、序列為SEQ ID N0.14的反向引物和序列為SEQ ID N0.15的探針；所述熒光定量反應(yīng)液F包括:檢測EML4-ALK亞型5a(E2a ;A20)融合基因的序列為SEQID N0.16的正向引物、序列為SEQ ID N0.17的反向引物和序列為SEQ ID N0.18的探針；所述熒光定量反應(yīng)液G包括:檢測EML4-ALK亞型5b(E2b ;A20)融合基因的序列為SEQID N0.19的正向引物、序列為SEQ ID N0.20的反向引物和序列為SEQ ID N0.21的探針；所述熒光定量反應(yīng)液H包括:檢測EML4-ALK亞型6 (E18 ;A20)融合基因的序列為SEQID N0.22的正向引物、序列為SEQ ID N0.23的反向引物和序列為SEQ ID N0.24的探針；所述熒光定量反應(yīng)液I包括:檢測EML4-ALK亞型7 (E14 ;A20)融合基因的序列為SEQID N0.25的正向引物、序列為SEQ ID N0.26的反向引物和序列為SEQ ID N0.27的探針；所述陽性對照樣品包括:陽性對照樣品A、陽性對照樣品B、陽性對照樣品C、陽性對照樣品D、陽性對照樣品E、陽性對照樣品F、陽性對照樣品G、陽性對照樣品H、陽性對照樣品I ; 其中，所述陽性對照樣品A包含所檢測EML4-ALK亞型I (E13 ;A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒； 所述陽性對照樣品B包含所檢測EML4-ALK亞型2(E20 ;A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒; 所述陽性對照樣品C包含所檢測EML4-ALK亞型3a (E6a ；A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒； 所述陽性對照樣品D包含所檢測EML4-ALK亞型3b (E6b ；A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒； 所述陽性對照樣品E包含所檢測EML4-ALK亞型4(E14 ;A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒; 所述陽性對照樣品F包含所檢測EML4-ALK亞型5a(E2a ；A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒；所述陽性對照樣品G包含所檢測EML4-ALK亞型亞型5b (E2b ;A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒； 所述陽性對照樣品H包含所檢測EML4-ALK亞型6(E18 ;A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒; 所述陽性對照樣品I包含所檢測EML4-ALK亞型7(E14 ;A20)融合基因基因組片斷DNA質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述探針均為熒光探針，5 ^端標(biāo)記FAM熒光報(bào).告基團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103468813SQ201310426392
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】邵琦 申請人:廣州達(dá)健生物科技有限公司