專利名稱：一種結(jié)核分枝桿菌核酸的檢測試劑盒及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)核分枝桿菌核酸的檢測技術(shù)，具體將，涉及一種結(jié)核分枝桿菌核酸的快速檢測試劑盒及其方法，適合對結(jié)核分枝桿菌的定性檢測。
背景技術(shù)：
結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是嚴重危害人類健康的傳染病，是阻礙國家經(jīng)濟和社會發(fā)展的重大問題，是我國重點控制的重大疾病之一，也是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題和社會問題。近年來，全球結(jié)核病疫情的回升，引起了國際社會的高度重視，世界衛(wèi)生組織已將結(jié)核病作為重點控制的傳染病之一，并宣布全球結(jié)核病處于緊急狀態(tài)。世衛(wèi)組織在結(jié)核防治報告中指出，改進檢測工作，可以促進國際結(jié)核病控制努力，并應(yīng)對巨大的市場需求，同時呼吁對以低收入和中等收入國家為目標的新的診斷工具進行工業(yè)投資。目前應(yīng)用于結(jié)核菌診斷的技術(shù)有很多種，這些常規(guī)檢查方法在技術(shù)上雖然比較成熟，但目前尚存在一些問題國際推薦的涂片和培養(yǎng)方法還分別存在特異性差、敏感性低和結(jié)果報出時間太長的不足，國際認可的結(jié)核菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)雖大大提高了培養(yǎng)結(jié)果的報出時間，但由于儀器設(shè)備昂貴，檢測成本太高而較難推廣普及。PCR技術(shù)雖然具備快速、靈敏、 特異等特點，但由于實驗室擴增物污染極易造成假陽性結(jié)果而限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。進口診斷試劑則由于采購供貨周期長，價格昂貴，基層單位難于常規(guī)應(yīng)用。而結(jié)核病高發(fā)區(qū)主要集中于農(nóng)村、邊遠地區(qū)及貧窮落后國家，世衛(wèi)組織調(diào)查認為在全世界結(jié)核病患者或生活在結(jié)核病高危地區(qū)的人當中，大多數(shù)人都很難獲得迅速而準確的檢測。世衛(wèi)組織控制結(jié)核司司長Mario Raviglione博士說“世界迫切需要新的、安全的和可負擔(dān)得起的診斷方法，以簡化病例發(fā)現(xiàn)過程”。因此，開發(fā)簡便、快速、準確、經(jīng)濟，尤其適宜于基層單位推廣使用的結(jié)核分枝桿菌快速診斷試劑成了各國企業(yè)研究的重點。近年來的發(fā)展起來針對結(jié)核分枝桿菌的熒光定量PCR (Fluorescence QuantitativePCR,FQ-PCR)技術(shù)以其靈敏度高，速度快，特異性強等優(yōu)點在結(jié)核分枝桿菌的基因檢測水平上有著廣泛的應(yīng)用，是目前結(jié)核分枝桿菌檢測的主要方法，目前國內(nèi)市場上尚未有關(guān)于結(jié)核分枝桿菌定量檢測試劑盒。FQ-PCR雖然有著簡便，快速，靈敏的優(yōu)勢，但是其檢測需要昂貴的儀器，且容易造成假陽性等問題。200810161998. 8公開了一種結(jié)核分枝桿菌快速檢測系統(tǒng)及其方法，包括結(jié)核菌液體培養(yǎng)基和結(jié)核分枝桿菌檢測試劑條，結(jié)核分枝桿菌檢測試劑條利用膠體金免疫層析技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌特異性抗原MPB64進行特異性檢測。但是該技術(shù)的缺陷為培養(yǎng)過程過長， 需要培養(yǎng)7-14天，不適應(yīng)臨床使用的需要。專利申請200810134583. 1公開了一種交叉引物擴增靶核酸序列的方法，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計6種(3對分別為1對交叉擴整引物、1對剝離引物、1對檢測引物)特異引物，引物尾端交叉互換序列，利用鏈置換DNA聚合酶(如，但不限于，Bst DNA 聚合酶)在恒溫條件即可完成核酸擴增反應(yīng)。不需要模板的變性、多次溫度循環(huán)等過程。
專利申請200610003似91公開了一種核酸薄膜層析快速檢測方法及其試紙條及其用途。該專利申請公開了一種特異性核酸序列的檢測方法，該方法將一種特異性抗體A 吸附于有色顆粒，在顆粒表面形成抗體包被；將另一種特異性抗體-無色抗B抗體固定于膜上形成檢測線；待測核酸進行擴增時，將所使用的探針或是引物用A抗原或B抗原標記，形成擴增物、探針、引物、抗原A、抗原B的復(fù)合物，將該復(fù)合物與吸附有色顆粒的抗體A結(jié)合， 得到的該有色顆粒復(fù)合物在溶液中通過毛細血管現(xiàn)象眼纖維膜向上流動只抗體B檢測條時，與線條上的抗體B結(jié)合，從而滯留在檢測線上，形成肉眼可見的有色線條。專利申請2006101096204公開了一種全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置及方法，該專利申請使用了專利申請2006100034 . 1的試紙條，達到了全封閉檢測的效果。本發(fā)明利用專利申請2006100034 . 1和專利申請200610109620. 4所公開的核酸薄膜層析快速檢測方法及其試紙條、全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置及方法，提出了一種針對結(jié)核分枝桿菌核酸的快速檢測方法，以及針對結(jié)核分枝桿菌的定性檢測的試劑
品.ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提出一種利用無儀器核酸提取方法、交叉引物核酸恒溫擴增以及封閉式核酸擴增物快速檢測結(jié)核分枝桿菌的試劑盒。本發(fā)明的另一發(fā)明目的在于提出利用這種試劑盒檢測結(jié)核分支桿菌的方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明之目的，采用如下技術(shù)方案。本發(fā)明提出一種利用核酸恒溫擴增檢測結(jié)核分枝桿菌的試劑盒，所述試劑盒包括(I)DNA提取液和裝置；(2)結(jié)核分枝桿菌核酸恒溫擴增反應(yīng)液；(3)陽性對照為含有結(jié)核分枝桿菌IS6110基因的DNA片段；(4)陰性對照為無菌雙蒸水；其中，所述結(jié)核分枝桿菌核酸恒溫擴增反應(yīng)液的組成為
權(quán)利要求
1. 一種利用核酸恒溫擴增檢測結(jié)核分枝桿菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括(1)無儀器DNA提取試劑盒；(2)結(jié)核分枝桿菌核酸恒溫擴增反應(yīng)液；(3)陽性對照為含有結(jié)核分枝桿菌IS6110基因的DNA片段；(4)陰性對照為無菌雙蒸水；其中，所述結(jié)核分枝桿菌核酸恒溫擴增反應(yīng)液的組成為正向外圍引物0. 01 0. 05 umol ；反向外圍引物0. 01 0. 05 umol ；正向交叉引物0. 01 0. 05 umol ；反向交叉引物0. 01 0. 05 umol ；正向探針0. 1 0. 5 μ mol ；反向探針0. 1 0. 5 μ mol ；MgSO43 6mmol ；dNTPs溶液0. 2 0. 4mmol ；Bst DNA聚合酶6 IOU ；IOXThermol buffer2μ 1 ；無菌雙蒸水補足到16 μ 1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，其特征在于，結(jié)核分枝桿菌核酸恒溫擴增反應(yīng)液的組成為正向外圍引物0. 03 0. 05 μ mol ；反向外圍引物0. 03 0. 05 μ mol ；正向交叉引物0. 03 0. 05 μ mol ；反向交叉引物0. 03 0. 05 μ mol ；正向探針0. 3 0. 5 μ mol ；反向探針0. 3 0. 5 μ mol ；MgSO45 6mmol ；dNTPs溶液0. 3 0. 4mmol ；Bst DNA聚合酶8 IOU ；IOXThermol buffer2μ 1 ；無菌雙蒸水補足到16 μ 1。所述結(jié)核分枝桿菌核酸恒溫擴增反應(yīng)液的組成優(yōu)選為正向外圍引物0. 05 μ mol ；反向外圍引物0. 05 μ mol ；正向交叉引物0. 05 μ mol ；反向交叉引物0. 05 μ mol ；正向探針0. 5 μ mol ；反向探針0. 5 μ mol ；MgSO46mmol ；dNTPs溶液0. 4mmol ；Bst DNA聚合酶10U ；IOXThermol buffer2μ 1 ；無菌雙蒸水補足到16 μ 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的無儀器DNA提取試劑盒選自無儀器核酸提取試劑盒，所述的無儀器微量核酸提取試劑盒包括微核酸提取裝置、抽吸裝置、細胞裂解液、清洗液及洗脫液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的微量核酸提取裝置包括管狀主體(1)，管狀主體一端設(shè)有用于與抽吸裝置連接的接頭O)，另一端為插頭(3)，用于與核酸結(jié)合的濾芯裝置(4)安裝于管狀主體或插頭內(nèi)。微量核酸提取裝置的管狀主體與插頭為一體或由管狀主體與插頭兩個部件連接而成，其中，所述插頭為錐狀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的正向外圍引物選自SEQ ID NO 1所示序列的至少10個核苷酸序列，優(yōu)選SEQ ID NO 1所示序列的至少 13個核苷酸序列，更優(yōu)選SEQ ID NO 1所示序列的至少15個核苷酸序列；所述的反向外圍引物選自SEQ ID NO :2所示序列的至少10個核苷酸序列，優(yōu)選SEQ ID NO 2所示序列的至少13個核苷酸序列，更優(yōu)選SEQ ID NO 2所示序列的至少15個核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的正向探針選自5，端標記有Biotin的SEQ ID NO 3所示序列的至少10個核苷酸序列；優(yōu)選5，端標記有Biotin的SEQ ID NO 3所示序列的至少13個核苷酸序列，更優(yōu)選5，端標記有Biotin 的SEQ ID NO 3所示序列的至少15個核苷酸序列；所述的反向探針選自3，端標記有FitC的SEQ ID NO :4所示的至少10個核苷酸序列； 優(yōu)選3，端標記有FitC的SEQ ID NO 4所示的至少13個核苷酸序列，更優(yōu)選3，端標記有 FitC的SEQ ID NO 4所示的至少15個核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，其特征在于所述正向交叉引物選自選自SEQ ID NO :5所示序列的至少10個核苷酸序列，優(yōu)選SEQ ID NO 5所示序列的至少13個核苷酸序列，更優(yōu)選SEQ ID NO 5所示序列的至少15個核苷酸序列；所述反向交叉引物選自選自SEQ ID NO :6所示序列的至少10個核苷酸序列，優(yōu)選SEQ ID NO 6所示序列的至少13個核苷酸序列，更優(yōu)選SEQ ID NO 6所示序列的至少15個核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的 IOXThermolbuffer 含有摩爾濃度為 2OmM 的 Tris_HCl、10mM 的 KClUOmM 的(NH4)2SO4JmM 的MgSO4以及質(zhì)量濃度為0. 的Triton X-100，pH 8. 8。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，其特征在于所述的結(jié)核分枝桿菌陽性對照含有如SEQ ID NO 7所示的、長198bp的結(jié)核分枝桿菌IS6110基因序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9任一所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，其特征在于所述的結(jié)核分枝桿菌陽性對照中的結(jié)核分枝桿菌DNA，制備方法包括下列步驟(1)利用兩條外圍引物SEQID NO 1和SEQ ID NO 2進行PCR擴增獲得目的基因；(2)對步驟(1)得到的PCR擴增產(chǎn)物進行純化；(3)將步驟(2)得到的純化后的擴增產(chǎn)物通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒構(gòu)建完整的含有目的基因SEQ ID NO 7所示的質(zhì)粒序列；(4)將所抽提的質(zhì)粒定量并稀釋至IO6拷貝/μ 1，-20°C保存。
11.權(quán)利要求1所述的試劑盒的檢測結(jié)核分枝桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟a)用DNA提取試劑盒從待檢測的標本中提取DNA；b)將步驟a)提取得到的DNA作為模板加入到裝有恒溫擴增反應(yīng)液的PCR管中，在60 65°C下擴增反應(yīng)60 65分鐘，優(yōu)選63°C下擴增反應(yīng)60分鐘；對照PCR管中分別加入標準陽性模板和標準陰性模板；c)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸防污染檢測裝置中進行檢測，15分鐘以后判讀結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用核酸恒溫擴增檢測結(jié)核分枝桿菌的快速檢測技術(shù)，以及定性檢測的試劑盒。該試劑盒包含無儀器DNA提取試劑盒、結(jié)核分枝桿菌核酸恒溫擴增反應(yīng)液、防污染核酸擴增物檢測裝置、結(jié)核分枝桿菌陽性對照、結(jié)核分枝桿菌陰性對照。本發(fā)明的檢測試劑盒特異性高、靈敏度高；反應(yīng)速度快，單個樣本從樣本處理到完成檢測，僅需1～1.5小時；可同時滿足中通量和低通量的樣品檢測，特別適合現(xiàn)場檢測以及基層醫(yī)院使用，且整個反應(yīng)過程只需一個恒溫儀器。
文檔編號C12Q1/04GK102373273SQ20101026398
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者尤其敏, 徐高連, 王宏瑩, 胡林, 鐘華燕 申請人:杭州優(yōu)思達生物技術(shù)有限公司