專利名稱：一種羥基化類胡蘿卜素的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，涉及一種能生產(chǎn)高活性羥基化類胡蘿卜 素的類胡蘿卜素水合酶及合成方法。
背景技術(shù)：
類胡蘿卜素是一類天然色素的總稱，屬于類萜化合物，以異戊二烯殘基為 單元組成，基本結(jié)構(gòu)都是一個(gè)較長(zhǎng)的共軛體系，不易溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，
屬于脂溶性色素。目前已經(jīng)確定結(jié)構(gòu)的類胡蘿卜素達(dá)700種以上，普遍存在于 植物、真菌、藻類和細(xì)菌中，在生物體內(nèi)起著不可替代的作用。隨著研究的深 入，它的醫(yī)療保健作用越來越引起人們的廣泛關(guān)注。類胡蘿卜素不僅是植物體 內(nèi)的功能性分子，在動(dòng)物和人類健康中也發(fā)揮重要作用。越來越多的研究表明， 食用富含類胡蘿卜素的食物可減少與老化有關(guān)的疾病如冠心病、黃斑退化疾 病、白內(nèi)障以及某些癌癥的發(fā)病率。
由于動(dòng)物和人體無法從頭合成類胡蘿卜素，只能從食物中攝取。所以在植 物、微生物中通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)大量的類胡蘿卜色素或者形成新類型的色 素產(chǎn)物顯得尤為重要。類胡蘿卜色素合成起始于異戊二烯焦磷酸(IPP)，然后 與其同分異構(gòu)體二甲丙烯基焦磷酸(DMAPP)合成牴牛兒焦磷酸(GPP)，在 CrtE的存在下GPP與一分子IPP縮合形成十五碳的化合物法呢焦磷酸(FPP); 最后FPP和單個(gè)IPP繼續(xù)縮合并形成二十個(gè)碳的櫳牛兒基犍牛兒基焦磷酸 GGPP。隨后在八氫番茄紅素合成酶CrtB及八氫番茄紅素脫飽和酶作用下生成 鏈孢紅素或番茄紅素。在大部分合成Qe的微生物中，從IPP到番茄紅素合成 途徑中是相同的，隨后的反應(yīng)由于不同的物種擁著不同的修飾酶，實(shí)現(xiàn)不同的 末端修飾，如環(huán)化、羰基化、羥基化、糖基化等等。
耐輻射奇球菌(Ddwococcws ra&o山ram)是一種極端環(huán)境微生物，以對(duì)電離 輻射、紫外射線、干燥和氧化壓力等極端條件表現(xiàn)極強(qiáng)抗性而著稱。它的這種 超強(qiáng)抗性有一部分歸功于其體內(nèi)含有紅色類胡蘿卜素。研究表明，耐輻射奇球 菌類胡蘿卜素的自由基清除能力高于人們熟知的|3-胡蘿卜素等。
主要的技術(shù)文獻(xiàn)有(Armstrong G A (1997)^打打""/及evz.ew o/Mfcra6z.o/ogy 51: 629-659; Tao L & Cheng Q (2004) Afo/G^打om&s 272: 530-7; Tian B,Xu Z， Sun Z, Lin J & Hua Y (2007)別octo 一勿a 1770: 902-11; Xu Z， Tian B, Sun Z, Lin J & Hua Y ( 2007 ) MfcraWo/ogy 153: 1642-52.)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種耐輻射奇球菌類胡蘿卜素水合酶基因tr/C,具 有SEQIDNo.l所述的核苷酸序列，該基因所編碼的多肽具有SEQIDNo.2所 述的氨基酸序列，該序列不同于其他生物來源的crtC，與其他來源^/C的親 緣關(guān)系較低。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有上述基因的重組表達(dá)載體及其構(gòu)建 方法。通過以下步驟實(shí)現(xiàn)以提取的耐輻射奇球菌("""o②cc^ ra&od"ra附Rl， ATCCNo.13939，購自美國(guó)菌種保藏中心)基因組DNA為模板，用Dr91、Dr92 一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，回收和純化片段， 通過T-A克隆，經(jīng)DNA測(cè)序鑒定后亞克隆到質(zhì)粒pRK404中的和^wffl 位點(diǎn)之間，連接后，以氯化鈣沉淀法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5cx，接種于含有四環(huán)素 抗性的瓊脂平皿，挑選陽性菌落，接種于2毫升含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中 過夜，抽提質(zhì)粒，得到表達(dá)載體pRKcrtC。所述PCR法中使用了兩條引物 Dr91 5' AAGCTTGATGATCTCGCCCCCCCTCCTGC 3' Dr92 5' GGATCCGGTAGCCGTCCCACCACGACT 3'。 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述的重組表達(dá)載體在制備羥基化類胡蘿卜
素中的應(yīng)用，通過所述的重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化表達(dá)實(shí)現(xiàn)
(1) 將重組表達(dá)載體pRKcrtC以氯化^沉淀法轉(zhuǎn)化到能產(chǎn)生鏈孢紅素的大 腸桿菌中，接種于5毫升含有四環(huán)素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜，從而使 所述類胡蘿卜素水合酶基因crtC在大腸桿菌中表達(dá)并合成1 -OH-鏈孢紅素和
U，-(OH)2-鏈孢紅素；
(2) 將所述重組表達(dá)載體pRKcrtC以氯化鈣沉淀法轉(zhuǎn)化到能產(chǎn)生番茄紅素 的大腸桿菌中，接種于5毫升含有四環(huán)素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜，從 而使crtC在大腸桿菌中表達(dá)并合成l-OH-番茹紅素和l,l，-(OH)2-番茄紅素。
本發(fā)明的有益之處本發(fā)明鑒定了一種來源于耐輻射奇球菌的類胡蘿卜素 水合酶基因cWC，該基因編碼的蛋白可以催化在C-l，2或C-l，,2'上發(fā)生水合作 用。該CrtC蛋白序列明顯不同于其他已知的CrtC蛋白，是一種新型的類胡蘿 卜素水合酶。本發(fā)明選擇引入異源基因可以產(chǎn)生鏈孢紅素或番茄紅素的大腸桿 菌作為出發(fā)菌株(含有來源于歐文氏菌的c^基因)，將來源于耐輻射奇球菌的 類胡蘿卜素水合酶基因crtC構(gòu)建到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)基因上述大腸桿菌,實(shí)現(xiàn)l-OH-鏈孢紅素、U，-(OH)2-鏈孢紅素、l-OH-番茄紅素和1,1，-(OH)2-番茄紅素
的生物合成，因此,本發(fā)明提供了一種利用類胡蘿卜素水合酶基因合成羥基化 類胡蘿卜素的方法，與現(xiàn)有的利用類胡蘿卜素羥基化酶CrtZ的合成方法不同之 處在于，CrtZ是在類胡蘿卜素底物的兩端環(huán)結(jié)構(gòu)上加上羥基，而水合酶CrtC是
在底物碳鏈的c-i,2或c-r,2，雙鍵上發(fā)生水合作用，合成含有c-i或c-r羥基
的類胡蘿卜素。


圖1為類胡蘿卜素水合酶基因cWC的PCR凝膠電泳圖。 圖2為重組載體pRKcrtC的酶切鑒定圖。 圖3為類胡蘿卜素水合酶基因crfC功能驗(yàn)證圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，這些實(shí)施例應(yīng)被理解為 僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例l:
類胡蘿卜素水合酶基因crtC的克隆
根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中耐輻射奇球菌(De/"ococcws ra&odwrara Rl， ATCC No.13939,購自美國(guó)菌種保藏中心)cWC的序列設(shè)計(jì)引物
Dr91 5' AAGCTTGATGATCTCGCCCCCCCTCCTGC 3'
Dr92 5' GGATCCGGTAGCCGTCCCACCACGACT 3'
以提取的耐輻射奇球菌基因組DNA為模板，用上述引物和Takara公司的 LATaq酶進(jìn)行PCR。 PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳(結(jié)果參見圖1，圖中M 為分子量標(biāo)記，1為PCR產(chǎn)物)。用Takara公司凝膠回收試劑盒回收DNA?；?收產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下，與Takara公司T載體pMD18 T vector進(jìn) 行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌并在氨芐青霉素平板上篩選陽性克隆。隨機(jī)挑 取平板上的菌落，并用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，并做PCR和酶切(Hindin, Bamffl)鑒定。含有大小正確片段的質(zhì)粒去測(cè)序，驗(yàn)證序列的正確性。
實(shí)施例2:
類胡蘿卜素水合酶基因c^C重組表達(dá)載體的構(gòu)建
cWC重組表達(dá)載體的構(gòu)建按常規(guī)方法進(jìn)行。上述含有cWC基因的T載體 經(jīng)過歷》dll和^w2ffl雙酶切出的目的片斷，在T4連接酶作用下，與上述兩 種酶切的表達(dá)載體pRK404進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌并在含有四環(huán)素 抗性平板上篩選陽性克隆。隨機(jī)挑取平板上的菌落，并用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，并做PCR和酶切(i7/"dn， 5"附HI)鑒定(參見圖2，圖中M為為分子 量標(biāo)記，l為酶切產(chǎn)物)。經(jīng)過驗(yàn)證，含有cWC基因的重組表達(dá)載體pRKcrtC構(gòu) 建完成，并成功轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中形成含有重組表達(dá)載體pRKcrtC的重組大腸 桿菌。
實(shí)施例3:
類胡蘿卜素水合酶c^C在宿主生物中的表達(dá)和產(chǎn)物檢驗(yàn)
3.1在能夠產(chǎn)生鏈孢紅素的大腸桿菌菌株中表達(dá)cwC并分析類胡蘿卜素產(chǎn)
物
含有質(zhì)粒pACCRTEBlRe的大腸桿菌能形成鏈孢紅素。將成功構(gòu)建的重組 表達(dá)載體pRKcrtC轉(zhuǎn)化進(jìn)入包含上述質(zhì)粒的大腸桿菌，并在含有氯霉素和四環(huán) 素的板上篩選陽性克隆。隨機(jī)挑取平板上的菌落，并用堿裂解法小量提取質(zhì) 粒，并做PCR鑒定。經(jīng)過驗(yàn)證正確的克隆，轉(zhuǎn)接到100ml的錐形培養(yǎng)瓶中， 30。C發(fā)酵培養(yǎng)36小時(shí)。其中當(dāng)OD值達(dá)到0.5時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG使其終濃 度為0.5mM。發(fā)酵液經(jīng)過離心后，沉淀的菌體用預(yù)冷的丙酮和甲醇(V/V,7:2) 提取類胡蘿卜色素。提取的色素產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析,液相條件如下流動(dòng)相， 甲醇/乙腈/異丙醇(5: 4: 1);流速，1 ml/min; C18柱。分析結(jié)果顯示，重組 載體pRKcrtC能在大腸桿菌中表達(dá)，在產(chǎn)生鏈孢紅素的大腸桿菌中，crtC基因 能催化鏈孢紅素產(chǎn)生l-OH-鏈孢紅素、1，1，-(OH)2-鏈孢紅素，結(jié)果參見圖3A， 其中A為轉(zhuǎn)化含有鏈孢紅素的大腸桿菌后提取色素產(chǎn)物的HPLC圖(470nm)， 產(chǎn)物1為l,l，- (OH) 2-鏈孢紅素，2為l-OH-鏈孢紅素，3為鏈孢紅素。
3.2在能夠產(chǎn)生番茄紅素的大腸桿菌菌株中表達(dá)^tC并分析類胡蘿卜素產(chǎn)
物
含有質(zhì)粒pACCRTEBlEe的大腸桿菌能形成番茄紅素。將成功構(gòu)建的重組 表達(dá)載體pRKcrtC轉(zhuǎn)化進(jìn)入包含上述質(zhì)粒的大腸桿菌，并在含有氯霉素和四環(huán) 素的平板上篩選陽性克隆。隨機(jī)挑取平板上的菌落，并用堿裂解法小量提取質(zhì) 粒，并做PCR鑒定。經(jīng)過驗(yàn)證正確的克隆，轉(zhuǎn)接到100ml的錐形培養(yǎng)瓶中， 30。C發(fā)酵培養(yǎng)36小時(shí)。其中當(dāng)OD值達(dá)到0.5時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG使其終濃 度為0.5mM。發(fā)酵液經(jīng)過離心后，沉淀的菌體用預(yù)冷的丙酮和甲醇(V/V，7:2) 提取類胡蘿卜色素。提取的色素產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，液相條件如下流動(dòng)相， 甲醇/乙腈/異丙醇(5: 4: 1);流速，1 ml/min; C18柱。分析結(jié)果顯示，重組 載體pRKcrtC能在大腸桿菌中表達(dá)，在產(chǎn)生番茄紅素的大腸桿菌中，crtC基因 能催化番茄紅素產(chǎn)生l-OH-番茄紅素、1，r-(OH)2-番茄紅素，結(jié)果參見圖3B，其中B為轉(zhuǎn)化含有番茄紅素的大腸桿菌后提取色素產(chǎn)物的HPLC圖(470nm)， 產(chǎn)物4為1，1，- (OH) 2-番茄紅素，5為l-OH-番茄紅素，6為番茄紅素。本發(fā)明涉及的序列
<110>浙江大學(xué)
〈120> —種羥基化類胡蘿卜素的合成方法 <160> 4 <210> 1 〈211〉 939 <212> DNA
〈213〉耐輻射奇球菌(Zfei"。c。cc〃s rao^Wora"51 Rl) 〈400〉 1
cccccctcct gcgctggggg ctggccgccg
ttgatctcgc ctgggggcgc ctgccgctct accctgcggc gcgctctccg gggctgctca ggctggggcc ctgctcggca cccaccgtgc gggctgcaac gtgggcctcg ctgtgggccg gcctggggca g鄉(xiāng)gcttst gggctggtgc ggagcgctgc
tgctggcgct ccggggtgtt ggcgctggca tggccctcaa gcaccggggc aggccgcgca gccggacggg tcacggtgcc tcgcgggcgg aaccgctgat gggcgccggt tgaagcgtct cgccgtcctt tggtggggcg tcgcgcgcgg
ggccgagcag tgcgctggcg acggctgctc gattccggtg gctgttcgtc gctcgccgcc ggttcctttt gcttatcgtg gcgcccctgg gacggcgcag gcagaacttt ggcgccgggg ctcgctcgcc gctggcggaa ggtgcggcgt
tccgcaggct ggggacgcgc gctgagacgc ccgctgtggc gccggactga ctcgcctgcc gggcagteict ccgctgggct ctggcggggc aactactggc ctcggctggt ctttttgatg tacttcaccg gcgggggtcei gccagttga
ctggcctcgg gggctctgat tggggtcagc cgccgtggtt cgcaggggtt gctacgccgc tcgccgggct cctacgccac ggttcgcctt tgctcatcac
gCtgg3gCg3
gggcggtggg ccaaag3g旭 aggctttttt cactcgccgt
cctcgccttt 60 tgcgctgggg 120 gttcggggcc 180 ggggtggctc 240 tgcgctgctg 300 gcagcgggcg 360 gggcgtggaa 420 cgcccccgcg 480 taccctcgcc 540 gtgctgggac 600 cccccacccg 660 cacggcgatt 720 gcagaaggct 780 tctgccgggc 840 gatggggctg 900 939
<210〉 2 <211〉 312 〈212〉 PRT
<213>耐輻身寸奇球菌(Zte/"ococcus Tao^Wwra/w Rl) 〈400〉 2
Met lie Ser Pro Pro Leu Leu Arg Trp Gly Leu Ala Ala Ala Gly Leu Gly Leu Ala Phe Leu Gly Ala Leu Leu 15 10 15 20 25
Ala Leu Ala Glu Gin Ser Ala Gly Tip Ala Leu lie Ala Leu Gly Leu Pro Leu Ser Gly Val Phe Ala Leu Ala
30 35 40 45 50
Gly Asp Ala Leu Gly Ser Ala Phe Gly Ala Thr Leu Arg Arg Arg Trp Gin Arg Leu Leu Ala Glu Thr Pro Pro
55 60 65 70 75
Trp Leu Gly Trp Leu Ala Leu Ser Val Ala Leu Lys He Pro Val Pro Leu Trp Pro Gin Gly Phe Ala Leu Leu
80 85 90 95 100
Gly Leu Leu Ser Thr Gly Ala Leu Phe Val Ala Gly Leu Ser Tyr Ala Ala Gin Arg Ala Gly Trp Gly Gin Ala
105 110 115 120 125
Ala Gin Leu Ala Ala Leu Ala Cys Leu Ala Gly Leu Gly Val Glu Leu Leu Gly Ser Arg Thr Gly Val Pro Phe
130 135 140 145 150Gly Gin Tyr Ser Tyr Ala Thr Ala Pro Ala Pro Thr Val Leu Thr Val Pro Leu He Val Pro Leu Gly Trp Phe
155 160 165 170 175
Ala Phe Thr Leu Ala Gly Leu Gin Leu Ala Gly Gly Arg Pro Trp Leu Ala Gly Leu Leu He Thr Cys Trp Asp
180 185 190 195 200
Val Gly Leu Glu Pro Leu Met Thr Ala Gin Asn Tyr Trp Arg Trp Ser Asp Pro His Pro Leu Trp Ala Gly Ala
205 210 215 220 225
Pro Val Gin Asn Phe Leu Gly Trp Trp Ala Val Gly Thr Ala lie Ala Trp Gly Met Lys Arg Leu Ala Pro Gly 230 235 240 245 250
Leu Phe Asp Ala Lys Glu Lys Gin Lys Ala Glu Gly Leu Ser Pro Ser Phe Ser Leu Ala Tyr Phe Thr Glu Ala
255 260 265 270 275
Phe Phe Leu Pro Gly Gly Leu Val Leu Val Gly Arg Leu Ala Glu Ala Gly Val Thr Leu Ala Val Met Gly Leu
280 285 290 295 300
Gly Ala Leu Leu Ala Arg Gly Val Arg Arg Ala Ser 305 310
〈210〉 3 <211〉 29 〈212〉腿 〈213〉人工序列 <220〉
〈223〉用于克隆crtC基因的引物Dr91 <400〉 3
MGCTTGATGATCTCGCCCCCCCTCCTGC 29
<210> 4 <211> 27 <212〉 DNA <213〉人工序列 〈220〉
〈223〉用于克隆crtC基因的引物Dr92 <400〉 4
GGATCCGGTAGCCGTCCCACCACGACT 2權(quán)利要求
1. 一種來自耐輻射奇球菌的類胡蘿卜素水合酶基因crtC，其特征在于具有SEQ ID No.1所述的核苷酸序列，該基因所編碼的多肽具有SEQ ID No.2所述的氨基酸序列，所述序列與其他來源crtC的親緣關(guān)系較低。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基因的重組表達(dá)載體pRKcrtC的構(gòu)建方法，其特 征在于通過以下步驟實(shí)現(xiàn)以提取的耐輻射奇球菌基因組DNA為模板，用 Dr91、 Dr92—對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，回收和 純化片段，通過T-A克隆，經(jīng)DNA測(cè)序鑒定后亞克隆到質(zhì)粒pRK404中的 /f/"^in和Samffl位點(diǎn)之間，連接后，以氯化鈣沉淀法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a， 接種于含有四環(huán)素抗性的瓊脂平皿，挑選陽性菌落，接種于2毫升含有氨芐的 LB液體培養(yǎng)基中過夜，抽提質(zhì)粒，得到表達(dá)載體pRKcrtC。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于所述PCR法中使用了兩條引物-Dr91 5' AAGCTTGATGATCTCGCCCCCCCTCCTGC 3' Dr92 5' GGATCCGGTAGCCGTCCCACCACGACT 3'。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體在制備羥基化類胡蘿卜素中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于通過以下步驟 實(shí)現(xiàn)的(1) 將重組表達(dá)載體pRKcrtC以氯化鈣沉淀法轉(zhuǎn)化到能產(chǎn)生鏈孢紅素的大 腸桿菌中，接種于5毫升含有四環(huán)素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜，從而使 所述類胡蘿卜素水合酶基因crtC在大腸桿菌中表達(dá)并合成l-OH-鏈孢紅素和 U，-(0H)2-鏈孢紅素；(2) 將所述重組表達(dá)載體pRKcrtC以氯化鈣沉淀法轉(zhuǎn)化到能產(chǎn)生番茄紅素 的大腸桿菌中，接種于5毫升含有四環(huán)素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜，從 而使crtC在大腸桿菌中表達(dá)并合成l-OH-番茄紅素和l,r-(OH)2-番茄紅素。
全文摘要
本發(fā)明提供一種耐輻射奇球菌類胡蘿卜素水合酶基因crtC，具有SEQ IDNo.1所述的核苷酸序列，該基因所編碼的多肽具有SEQ ID No.2所述的氨基酸序列，該序列不同于其他生物來源的crtC，與其他來源crtC的親緣關(guān)系較低。通過構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體和轉(zhuǎn)基因大腸桿菌，在含有鏈孢紅素或番茄紅素的大腸桿菌中表達(dá)crtC基因，能產(chǎn)生羥基化類胡蘿卜素產(chǎn)物。本發(fā)明的類胡蘿卜素水合酶基因crtC為通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)高抗氧化活性的羥基化類胡蘿卜素產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/52GK101451142SQ200810162819
公開日2009年6月10日 申請(qǐng)日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者華躍進(jìn), 孫宗濤, 沈紹傳, 兵 田 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)