專利名稱：：一種微型仿生支架反應器的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學、生物醫(yī)學與再生醫(yī)學領域，涉及組織工程與人工器官技術，具體涉及一種微型仿生支架反應器。
背景技術：
：目前的藥效與藥理研究基于動物模型、體外原代細胞模型和永生化細胞系模型三種，動物模型存在實驗周期長、效率低，個體差異大以致結果誤差過大，且不利于動物保護等缺陷。此外種屬差異也是動物模型的致命弱點。永生化細胞系雖具有培養(yǎng)簡單且穩(wěn)定，效率高成本低等優(yōu)勢，但永生化細胞系相比原代培養(yǎng)細胞在結構和功能上均有較大區(qū)別，如用于體內(nèi)實驗時，尚存在致瘤性的潛在危險。最近，利用原代細胞模型進行體外藥物研究正日益受到國內(nèi)外學者的重視。它具有所需細胞量少，無種屬和個體差異的優(yōu)點，實驗結果可重復性佳。目前常用的體外細胞模型主要有孔板、培養(yǎng)瓶和平皿培養(yǎng)等二維方式，該方法操作簡單，成本低廉，但缺乏類似體內(nèi)的三維環(huán)境，難以長時間維持細胞活性與功能，無法真正模擬體內(nèi)細胞的生物學功能，因而無法廣泛應用。而三維培養(yǎng)方法如中空纖維生物反應器，雖能長時間維持培養(yǎng)細胞的功能，模擬肝臟環(huán)境，但結構復雜，體積龐大，操作復雜，實驗成本較高。尤其不適于小型化的藥物代謝研究和高通量的藥物篩選。同時實驗室研究細胞培養(yǎng)條件和合成細胞代謝產(chǎn)物，需要一種小型化和價廉、適合進行實驗室條件優(yōu)化和篩選的裝置。這些要求對于工業(yè)化生產(chǎn)用的大型中空纖維反應器顯然無法滿足。為此，操作簡單、成本低廉且易于放大的實驗室細胞培養(yǎng)方法已成為當前細胞模型研究的重點，對臨床細胞治療的前期研究也具有十分重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容為克服現(xiàn)有藥物研究與細胞治療模型的不足，本發(fā)明設計了一個全新的模擬人體肝臟結構的微型仿生支架反應器。本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是本發(fā)明的一種微型仿生支架反應器，包括傳氧硅膠封套，l片以上的三維多孔支架，傳氧硅膠封口；三維多孔支架裝在聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套中，傳氧硅膠封套兩端用傳氧硅膠管封口。所說的微型仿生支架反應器的直徑為5-20mm,長度為10-50mm。所說的傳氧硅膠管封口直徑為l-4mm。所說的三維多孔支架材料是其分子量為5—10萬單位的聚乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)、左旋聚乳酸(PLLA)或藻酸鹽。所說的三維多孔支架為2_10片。所說的三維多孔支架片直徑為4一19mm。所說的三維多孔支架片厚度徑為l一4mm。所說的三維多孔支架的孔徑為50—500nm。所說的三維多孔支架設有特定管腔1-10個，孔徑為200-500nm。所說的特定管腔為孔徑200-500nm的圓形管腔，該管腔是在三維支架中激光打孔而成，無其它材料，主要用于提供內(nèi)皮細胞生長和誘導微血管生成。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明的支架極大地簡化了常用生物反應器的結構與操作。以最大限度模擬了培養(yǎng)細胞的體內(nèi)微環(huán)境。明顯促進培養(yǎng)細胞的生長與代謝，維持培養(yǎng)細胞的長期生物學功能?？蓮V泛應用于各種細胞培養(yǎng)尤其是原代細胞，同時非常適用于進行藥物代謝和篩選研究。圖1為本發(fā)明的實施例的結構示意圖。圖2為本發(fā)明的實施例1的兩組細胞的生長曲線圖。圖3為本發(fā)明的實施例1的白蛋白(ALB)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)結果圖。圖4為本發(fā)明的實施例l的尿素(Urea)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)結果圖。圖5本發(fā)明的實施例2的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測白蛋白(ALB)的結果圖。圖6本發(fā)明的實施例2的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測尿素的結果圖。具體實施例方式以下通過實施例進一步對本發(fā)明進行描述如附圖l所示，本發(fā)明包括包括傳氧硅膠封套l，l片以上的三維多孔支架2，傳氧硅膠管封口3;三維多孔支架2裝在傳氧硅膠封套1中，傳氧硅膠封套1兩端用傳氧硅膠管封口3。具體實施例1(微型仿生支架反應器和單層貼壁法培養(yǎng)大鼠肝細胞的比較)傳氧硅膠封套1長15mm，三維多孔支架2材料為PLGA，PLGA分子量為7萬單位。多孔支架2直徑9mm,厚度為3mm,孔徑為100—200nm，設有特定管腔6—8個，孔徑為400nm，4片多孔支架2組疊而成。傳氧硅膠管封口3直徑為2mm。特定管腔是在三維支架中激光打孔而成，無其它材料，主要用于提供內(nèi)皮細胞生長和誘導微血管生成。將常規(guī)分離得到的活性高于90%到的大鼠原代肝細胞以107CellS/ml密度接種至含15%FBS的DMEM(購自Irwitrogen公司)的培養(yǎng)基中，用注射器將細胞注入PLGA三維多孔支架中，每片支架的細胞量為106cellS，在常溫下以1000g的離心力離心5分鐘，使細胞均勻分散至支架。在37。C、5%C02條件下培養(yǎng)過夜使細胞粘附于多孔支架，然后在無菌條件下將含有細胞的4片多孔支架層層疊起，裝入傳氧硅膠封套后，在37°"5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)。每間隔2—3天置換新鮮培養(yǎng)基，共分化培養(yǎng)2周。將同批分離的大鼠肝細胞以106cellS/ml接種至培養(yǎng)瓶進行單層貼壁培養(yǎng)，每瓶細胞量為10Vells，培養(yǎng)條件與上述相同。各重復3組，每隔2天分別收集微型仿生支架反應器內(nèi)和單層貼壁培養(yǎng)的細胞、細胞支架復合體及培養(yǎng)液上清，檢測肝細胞代謝功能和分析生長曲線。結果如下圖2-4:圖2表示了兩組細胞的生長曲線結果結果顯示，人工肝臟組大鼠原代肝細胞成活時間達60天，而對照組僅存活28天。圖3表示白蛋白(ALB)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)結果結果顯示人工肝臟組分泌的白蛋白明顯高于對照組。圖4表示尿素(Urea)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)結果結果顯示人工肝臟組合成的尿素明顯高于對照組。由圖2—4表明，相比普通單層貼壁培養(yǎng)法，利用微型仿生支架反應器進行肝細胞培養(yǎng)可明顯延長原代肝細胞的體外培養(yǎng)時間，培養(yǎng)肝細胞的代謝功能也明顯高于對照組。說明了本發(fā)明所具有的明顯優(yōu)勢。具體實施例2(微型仿生支架反應器和單層貼壁法分化大鼠骨髓間質干細胞(BMSCs)至肝細胞的比較)傳氧硅膠封套1長15mm，三維多孔支架2材料為PLGA，PLGA分子量為7萬單位。多孔支架2直徑9mm，厚度為3mm，孔徑為100—200nm，設有特定管腔6—8個，孔徑為400mn，4片多孔支架2組疊而成。傳氧硅膠管封口3直徑為2mm。將實驗室常規(guī)分離到活性高于90%的大鼠BMSCs按107cellS/ml密度接種至含肝細胞生長因子的IMDM(購自Irwitrogen公司)培養(yǎng)基中，用注射器將細胞注入PLGA三維多孔支架中，每片支架的細胞量為106cellS，在常溫下以1000g的離心力離心5分鐘，使細胞均勻分散至支架。在37。C、5。/。C02條件下培養(yǎng)過夜使細胞粘附于多孔支架，然后在無菌條件下將含有細胞的4片多孔支架層層疊起，裝入傳氧硅膠封套后，在37。C、5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)。每間隔一天置換新鮮培養(yǎng)基，共分化培養(yǎng)3周。將同批分離的BMSCs以106cells/ml接種至培養(yǎng)瓶進行單層貼壁培養(yǎng)，每瓶細胞量為106cells，培養(yǎng)條件與上述相同。各重復3組，每隔一周分別收集人工肝臟內(nèi)和單層貼壁培養(yǎng)的細胞、細胞支架復合體及培養(yǎng)液上清，檢測肝細胞的特異性功能基因及表達產(chǎn)物，比較兩組分化成肝細胞的時間與分化肝細胞的功能。結果如下圖5-6:圖6圖5表示了酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的結果結果顯示微型仿生支架反應器組在一周后即檢測到ALB和尿素，而對照組在第二周檢測到，且微型仿生支架反應器組明顯高于對照。由圖6表明，相比普通單層貼壁分化培養(yǎng)法，利用微型仿生支架反應器進行肝細胞分化可明顯縮短分化時間，分化肝細胞的代謝功能明顯比前者強。說明了本發(fā)明所具有的明顯優(yōu)勢。具體實施例3(微型仿生支架反應器用于藥物代謝的研究)傳氧硅膠材料封套1長15mm，三維多孔支架2材料為PLGA，PLGA分子量為7萬單位。多孔支架2直徑9mm,厚度為3mm,孔徑為100—200nm，設有特定管腔6—8個，孔徑為400nm，4片多孔支架2組疊而成。傳氧硅膠管封口3直徑為2mm。將常規(guī)實驗室分離到活性高于90%的大鼠肝細胞按10^dls/ml密度接種至含15。/。FBS的DMEM(購自Irwitrogen公司)的培養(yǎng)基中，利用注射器注射至微型仿生支架反應器內(nèi)的PLGA三維多孔支架中，每片支架的細胞量為106cellS，在常溫下以1000g的離心力離心5分鐘，使細胞均勻分散至支架。在37°C、5%(:02條件下培養(yǎng)過夜使細胞粘附于多孔支架，然后在無菌條件下將含有細胞的4片多孔支架層層疊起，裝入傳氧硅膠封套后，在37。C、5%C02條件下培養(yǎng)。將同批分離的大鼠肝細胞以106Cells/ml接種至培養(yǎng)瓶進行單層貼壁培養(yǎng)，每瓶細胞量為106Cells，培養(yǎng)條件與上述相同。各重復3組，培養(yǎng)48小時后，各組加入5pg/ml的安定溶液，收集加入安定后0分鐘(即加入安定藥液后立即收集)與經(jīng)過2小時的藥物代謝的細胞培養(yǎng)上清，用HPLC法測細胞培養(yǎng)上清中安定的含量，結果如表l.<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表1結果表明，微型仿生支架反應器組代謝安定的能力明顯強于單層貼壁培養(yǎng)組，說明肝細胞在微型彷生支架內(nèi)的生物學功能明顯生長環(huán)境明顯好于常規(guī)單層貼壁培養(yǎng)法。說明了本發(fā)明比常規(guī)貼壁培養(yǎng)法更適用于藥物代謝研究。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。權利要求1、一種微型仿生支架反應器，其特征在于包括傳氧硅膠封套，1片以上的三維多孔支架，傳氧硅膠封口；三維多孔支架裝在聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套中，傳氧硅膠封套兩端用傳氧硅膠管封口。2、根據(jù)權利要求1所述的一種微型仿生支架反應器，其特征在于微型仿生支架反應器的直徑為5-20mm,長度為10-50mm。3、根據(jù)權利要求1所述的一種微型仿生支架反應器，其特征在于所說的傳氧硅膠管封口直徑為l-4mm。4、根據(jù)權利要求1所述的一種微型仿生支架反應器，其特征在于所說的三維多孔支架的材料為其分子量為5—10萬單位的聚乳酸/乙醇酸共聚物、左旋聚乳酸或藻酸鹽。5、根據(jù)權利要求1所述的一種微型仿生支架反應器，其特征在于所說的三維多孔支架為2—10片。6、根據(jù)權利要求1所述的一種微型仿生支架反應器，其特征在于所說的三維多孔支架片直徑為4一19mm，厚度徑為l一4mm，孔徑為50—500nm。7、根據(jù)權利要求1所述的一種微型仿生支架反應器，其特征在于所說的三維多孔支架設有特定管腔1-10個，孔徑為200-500nm。8、根據(jù)權利要求7所述的一種微型仿生支架反應器，其特征在于所說的特定管腔為孔徑200-500nm的圓形管腔，該管腔是在三維支架中激光打孔而成。全文摘要本發(fā)明公開了一種微型仿生支架反應器，包括傳氧硅膠封套，1片以上的三維多孔支架，傳氧硅膠封口；三維多孔支架裝在聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套中，傳氧硅膠封套兩端用傳氧硅膠管封口。本發(fā)明的有益之處在于本發(fā)明的支架極大地簡化了常用生物反應器的結構與操作。以最大限度模擬了培養(yǎng)細胞的體內(nèi)微環(huán)境。明顯促進培養(yǎng)細胞的生長與代謝，維持培養(yǎng)細胞的長期生物學功能?？蓮V泛應用于各種細胞培養(yǎng)尤其是原代細胞，同時非常適用于進行藥物代謝和篩選研究。文檔編號C12M3/00GK101423798SQ20081016261公開日2009年5月6日申請日期2008年12月4日優(yōu)先權日2008年12月4日發(fā)明者君李,李蘭娟申請人:浙江大學