專利名稱：無溶劑系統(tǒng)中固定化全細胞酶催化生產(chǎn)植物甾醇酯的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)植物甾醇酯的方法。
背景技術：
植物甾醇是一種具有生理功能的天然產(chǎn)物。許多文獻報道甾醇起到預防心血管疾病 的作用，因為它能有效降低有害低密度膽固醇(LDL)的水平，但游離甾醇在水和油中的 溶解度小限制了它的應用，植物甾醇在應用中存在以下問題1)結晶形式使其在人體 內(nèi)的溶解性和生物可利用性比較差；2)不溶于水，在油中的溶解度也很小，給應用于 食品工業(yè)帶來困難。由于植物甾醇酯具有良好的脂溶性，所以將植物甾醇與脂肪酸酯化 后轉化成油溶性的植物甾醇酯，能夠解決在食品工業(yè)中應用的限制。另外由于油酸等脂 肪酸本身就具有很好的生理功能，所以脂肪酸的甾醇酯則可兼具兩者的功效，降低血清 膽固醇和甘油三酯效果更佳，能更好地發(fā)揮植物甾醇的生理功能。
目前植物甾醇酯一般采用化學法合成和酶法催化合成兩種方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制作工序簡單、成本低的無溶劑系統(tǒng)中固定化全細胞酶 催化生產(chǎn)植物甾醇酯的方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案是無溶劑系統(tǒng)中固定化全細胞酶催化生產(chǎn) 植物甾醇酯的方法，其特征在于它包括如下步驟
1) 固定化全細胞酶的制備
(1) 將葡枝根霉(Rfuzopus stolonifer)按常規(guī)方法配制成(10)2 (10)4孢子懸浮液，得葡枝根霉(Rfuzopus stolonifer)孢子懸浮液，備用；
(2) 搖瓶培養(yǎng)基配制按各組份所占質量百分比全脂豆粉2.0%，菜籽油0.3 0.6%， 磷酸氫二鉀1.2%，硫酸銨0.3%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鈉0.4%，水95.2 95.5%;選取 全脂豆粉、菜籽油、磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鈉和水混合，得搖瓶培養(yǎng) 基，備用；
(3) 將聚氨酯剪切成3 5mm泡沫顆粒，備用；
(4) 按100ml搖瓶培養(yǎng)基中加1 3ml葡枝根霉(Rfuzopus stolonifer)孢子懸浮液， 100ml搖瓶培養(yǎng)基中加聚氨酯泡沫顆粒0.3 0.5g，將葡枝根霉(Rfuzopus stolonifer)和聚 氨酯在搖瓶培養(yǎng)基中，26 30℃條件下培養(yǎng)40 60h;取出長滿葡枝根霉(Rfuzopus stolonifer)的聚氨酯泡沫顆粒，真空干燥，得固定化全細胞酶，備用；
2) 酯化將油酸、月見草油或食用大豆油中加入甾醇和固定化全細胞酶，加塞后置 于水浴恒溫振蕩器中在溫度40 60℃、轉速100 300r/min的條件下進行酯化反應，反應時間46 50h，得酯化后的反應產(chǎn)物；其中，油酸、月見草油或食用大豆油與甾醇的質量 比為3 7: 1;固定化全細胞酶為下述(1)油酸、月見草油或食用大豆油，(2)甾醇， 二種質量之和的1.0 1.7%;
3)離心分離、干燥將酯化后的反應產(chǎn)物離心分離，離心后的上層液為植物甾醇酯 產(chǎn)品；離心后的固體物冷凍干燥，得固定化全細胞酶，可重復使用。
步驟3)所述的離心分離的條件是2000 4000rpm，離心10 20min。
步驟3)所述的冷凍干燥的條件是-10 0°C， lmbar，干燥時間3 5小時。
本發(fā)明與化學合成法相比，無溶劑全細胞酶催化合成有2個優(yōu)點1)反應選擇性高， 反應過程中副產(chǎn)物少；2)反應條件溫和，整個生產(chǎn)過程在常溫下進行，可以有效避免多 元不飽和脂肪酸的氧化。本發(fā)明與有機相脂肪酶合成法相比，無溶劑全細胞酶催化合成 有2個優(yōu)點1)采用全細胞，免除了脂肪酶的分離、提取、純化和固定化等復雜工序， 是克服目前脂肪酶生產(chǎn)、應用成本高的有效途徑之一；2)無溶劑體系可以在生產(chǎn)過程中， 不需要任何有機溶劑。這不僅可以在生產(chǎn)工藝中免除了有機溶劑脫除，是一種綠色環(huán)保 的工藝路線。有利于今后的產(chǎn)品開發(fā)；而且不會產(chǎn)生不利于消費者身體健康的殘余有機 溶劑。
產(chǎn)生脂肪酶的生物全細胞作為催化劑(簡稱固定化全細胞酶)，即將產(chǎn)脂肪酶的微生 物細胞固定在聚氨酯泡沫顆粒中，進行發(fā)酵培養(yǎng)后，收集聚氨酯泡沫顆粒，經(jīng)過簡單處 理后即可作為一種生物催化劑，催化脂肪酸、油脂和植物甾醇轉化生成植物甾醇酯。
本發(fā)明的有益效果是
1) 制作簡單本發(fā)明制作工序簡單，不需要復雜設備；將供試菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)后，收集固定菌體進行干燥。
2) 降低成本以固定化全細胞酶催化劑的形式利用脂肪酶，既省去了脂肪酶的分 離提取、純化和固定等工序，也避免在此過程中的酶損失，節(jié)省了大量設備投資、運行 費用，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
3) 技術先進固定化全細胞酶催化劑代替脂肪酶用于轉酯催化劑；本發(fā)明采用大 分子載體，固定后的葡枝根霉細胞容易收集而且具有脂肪酶活性。
4) 多次使用采用固定化全細胞酶催化劑回收率高，可重復使用。
5) 環(huán)保無溶劑，具有很強的環(huán)保概念，且可以解決化學方法難以解決的問題。
具體實施例方式
為了更好地理解本發(fā)明，下面結合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi) 容不僅僅局限于下面的實施例。
實施例1:
無溶劑系統(tǒng)中固定化全細胞酶催化生產(chǎn)植物甾醇酯的方法，它包括如下步驟
1)固定化全細胞酶的制備
(1)將市售的葡枝根霉Rhizopus stolonifer)按常規(guī)方法配制成102孢子懸浮液，
4
得葡枝根霉(i /^o; w"to/o"z:/^)孢子懸浮液，備用；
(2) 搖瓶培養(yǎng)基配制按各組份所占質量百分比全脂豆粉(烘干后粉碎，過30 目)2.0%，菜籽油(市售)0.3%，磷酸氫二鉀1.2%，硫酸銨0.3%,硫酸鎂0.3%，磷酸二氫 鈉0.4%，水95.5%;選取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫 鈉和水混合，得搖瓶培養(yǎng)基，備用；
(3) 將聚氨酯剪切成3mm泡沫顆粒，備用；
(4) 按100ml搖瓶培養(yǎng)基中加lml葡枝根霉(及Wzo;nwWo/om;/^)孢子懸浮液，100ml 搖瓶培養(yǎng)基中加聚氨酯泡沫顆粒0.3g，將葡枝根霉(及/^o/7^Wo/omy^)和聚氨酯在搖瓶 培養(yǎng)基中，26'C條件下培養(yǎng)40h;取出長滿葡枝根霉(i /^o/7";^to/om;/^)的聚氨酯泡沫 顆粒，真空干燥，得固定化全細胞酶(催化劑)，備用；
2) 酯化將油酸中加入甾醇和固定化全細胞酶，加塞后置于水浴恒溫振蕩器中在溫 度40'C、轉速100r/min的條件下進行酯化反應，反應時間46h，得酯化后的反應產(chǎn)物； 其中，油酸與甾醇的質量比為3: 1;固定化全細胞酶為下述(1)油酸，(2)甾醇， 二種質量之和的1.0%;
3) 離心分離、干燥將酯化后的反應產(chǎn)物離心分離，4000rpm， 20min，離心后的上 層液為植物甾醇酯產(chǎn)品；離心后的固體物冷凍干燥，-l(TC， lmbar，干燥時間5小時，得 固定化全細胞酶，可重復使用。植物甾醇酯產(chǎn)品經(jīng)氣相色譜測定甾醇的酯化率為62.2%。
實施例2:
無溶劑系統(tǒng)中固定化全細胞酶催化生產(chǎn)植物甾醇酯的方法，它包括如下步驟
1) 固定化全細胞酶的制備
(1) 將市售的葡枝根霉(朋加;^加/o"!;/bO按常規(guī)方法配制成103孢子懸浮液， 得葡枝根霉(朋/zo戶sWo/omy^)孢子懸浮液，備用；
(2) 搖瓶培養(yǎng)基配制按各組份所占質量百分比全脂豆粉(烘干后粉碎，過40 目)2.0%，菜籽油(市售)0.5%，磷酸氫二鉀1.2%，硫酸銨0.3%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫 鈉0.4%，水95.3%;選取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫 鈉和水混合，得搖瓶培養(yǎng)基，備用；
(3) 將聚氨酯剪切成4mm泡沫顆粒，備用；
(4) 按100ml搖瓶培養(yǎng)基中加3ml葡枝根霉(i^/zo;nw Wo/omy^)孢子懸浮液，100ml 搖瓶培養(yǎng)基中加聚氨酯泡沫顆粒0.4g，將葡枝根霉(i WzopwWo/omy^)和聚氨酯在搖瓶 培養(yǎng)基中，28'C條件下培養(yǎng)48h;取出長滿葡枝根霉(及/^印"sWo/om/w)的聚氨酯泡沫 顆粒，真空干燥，得固定化全細胞酶(催化劑)，備用；
2) 酯化將油酸中加入甾醇和固定化全細胞酶，加塞后置于水浴恒溫振蕩器中在溫 度5(TC、轉速200r/min的條件下進行酯化反應，反應時間48h，得酯化后的反應產(chǎn)物； 其中，油酸與甾醇的質量比為5: 1;固定化全細胞酶為下述(1)油酸，(2)甾醇，二 種質量之和的1.5%;
3) 離心分離、干燥將酯化后的反應產(chǎn)物離心分離，2000rpm，離心10min，離心后的上層液為植物甾醇酯產(chǎn)品，離心后的固體物冷凍干燥，0°C， lmbar，干燥時間5小時, 得固定化全細胞酶，可重復使用。
實施例3:
無溶劑系統(tǒng)中固定化全細胞酶催化生產(chǎn)植物甾醇酯的方法，它包括如下步驟
1) 固定化全細胞酶的制備-
(1) 將市售的葡枝根霉(rhizopus stolonifer)按常規(guī)方法配制成103孢子懸浮液， 得葡枝根霉(rhizopus stolonifer)孢子懸浮液，備用；
(2) 搖瓶培養(yǎng)基配制按各組份所占質量百分比全脂豆粉(烘干后粉碎，過30
50目)2.0%，菜籽油(市售)0.5%，磷酸氫二鉀1.2%，硫酸銨0.3%，硫酸鎂0.3%，磷酸二 氫鈉0.4%，水95.3%;選取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二 氫鈉和水混合，得搖瓶培養(yǎng)基，備用；
(3) 將聚氨酯剪切成4mm泡沫顆粒，備用；
(4) 按100ml搖瓶培養(yǎng)基中加2ml葡枝根霉(rhizopus stolonifer)孢子懸浮液，100ml 搖瓶培養(yǎng)基中加聚氨酯泡沫顆粒0.4g，將葡枝根霉(rhizopus stolonifer)和聚氨酯在搖瓶 培養(yǎng)基中，28'C條件下培養(yǎng)48h;取出長滿葡枝根霉(rhizopus stolonifer)的聚氨酯泡沫 顆粒，真空干燥，得固定化全細胞酶(催化劑)，備用；
2) 酯化將月見草油中加入甾醇和固定化全細胞酶，加塞后置于水浴恒溫振蕩器中 在溫度50'C、轉速200r/min (轉/分鐘)的條件下進行酯化反應，反應時間48h，得酯化
后的反應產(chǎn)物；其中，月見草油與甾醇的質量比為5: 1;固定化全細胞酶為下述(1) 月見草油，(2)甾醇，二種質量之和的1.5%;
3) 離心分離、干燥將酯化后的反應產(chǎn)物離心分離，3000rpm，離心15min，離心后 的上層液為植物甾醇酯產(chǎn)品；離心后的固體物冷凍干燥，0'C， lmbar，干燥時間3小時， 得固定化全細胞酶，可重復使用。植物甾醇酯產(chǎn)品經(jīng)氣相色譜測定甾醇的酯化率為55.5%。
實施例4:
無溶劑系統(tǒng)中固定化全細胞酶催化生產(chǎn)植物甾醇酯的方法，它包括如下步驟 1)固定化全細胞酶的制備
(1) 將市售的葡枝根霉(rhizopus stolonifer)按常規(guī)方法配制成104孢子懸浮液， 得葡枝根霉(rhizopus stolonifer)孢子懸浮液，備用；
(2) 搖瓶培養(yǎng)基配制按各組份所占質量百分比全脂豆粉(烘干后粉碎，過50 目)2.0%，菜籽油(市售)0.6%，磷酸氫二鉀1.2%，硫酸銨0.3%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫 鈉0.4%，水95.2%;選取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫 鈉和水混合，得搖瓶培養(yǎng)基，備用；
(3) 將聚氨酯剪切成5mm泡沫顆粒，備用；
(4) 按100ml搖瓶培養(yǎng)基中加3ml葡枝根霉(rhizopus stolonifer)孢子懸浮液，100ml 搖瓶培養(yǎng)基中加聚氨酯泡沫顆粒0.5g，將葡枝根霉(rhizopus stolonifer)。和聚氨酯在搖瓶 培養(yǎng)基中，30'C條件下培養(yǎng)60h;取出長滿葡枝根霉(rhizopus stolonifer)的聚氨酯泡
沫顆粒，真空干燥，得固定化全細胞酶(催化劑)，備用；
2) 酯化將月見草油中加入甾醇和固定化全細胞酶，加塞后置于水浴恒溫振蕩器中 在溫度6(TC、轉速300r/min的條件下進行酯化反應，反應時間50h，得酯化后的反應產(chǎn)物；其中，月見草油與甾醇的質量比為7: 1;固定化全細胞酶為下述(1)月見草油， (2)甾醇，二種質量之和的1.7%;
3) 離心分離、干燥將酯化后的反應產(chǎn)物離心分離，4000rpm，離心20min，離心后 的上層液為植物甾醇酯產(chǎn)品；離心后的固體物冷凍干燥，0°C， lmbar，干燥時間4小時， 得固定化全細胞酶，可重復使用。
實施例5:
無溶劑系統(tǒng)中固定化全細胞酶催化生產(chǎn)植物甾醇酯的方法，其特征在于它包括如下 步驟
1) 固定化全細胞酶的制備
(1) 將市售的葡枝根霉(朋/zo戸s加/omy^)按常規(guī)方法配制成104孢子懸浮液， 得葡枝根霉(及Wzo/ ^Wo/om;/^)孢子懸浮液，備用；
(2) 搖瓶培養(yǎng)基配制按各組份所占質量百分比全脂豆粉(烘干后粉碎，過50目)2.0%，菜籽油(市售)0.6%，磷酸氫二鉀1.2%，硫酸銨0.3%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫 鈉0.4%,水95.2%;選取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫 鈉和水混合，得搖瓶培養(yǎng)基，備用；
(3) 將聚氨酯剪切成5mm泡沫顆粒，備用；
(4) 按100ml搖瓶培養(yǎng)基中加3ml葡枝根霉(i /n'zo戸;y Wo/om/er)孢子懸浮液，100ml 搖瓶培養(yǎng)基中加聚氨酯泡沫顆粒0.5g，將葡枝根霉(朋加pMWo/om;/^)和聚氨酯在搖瓶 培養(yǎng)基中，3(TC條件下培養(yǎng)60h;取出長滿葡枝根霉(i Wzo;7M Wo/om/er)的聚氨酯泡 沫顆粒，真空干燥，得固定化全細胞酶(催化劑)，備用；
2) 酯化將食用大豆油中加入甾醇和固定化全細胞酶，加塞后置于水浴恒溫振蕩器 中在溫度60"C、轉速300r/min的條件下進行酯化反應，反應時間50h，得酯化后的反應產(chǎn)物；其中，食用大豆油與甾醇的質量比為7: 1;固定化全細胞酶為下述(1)食用大豆油，(2)甾醇，二種質量之和的1.7%;
3) 離心分離、干燥將酯化后的反應產(chǎn)物離心分離，4000rpm，離心20min，離心后 的上層液為植物甾醇酯產(chǎn)品；離心后的固體物冷凍干燥，-l(TC， lmbar，干燥時間5小時， 得固定化全細胞酶，可重復使用。植物甾醇酯產(chǎn)品經(jīng)氣相色譜測定甾醇的酯化率為39.0%。
實施例6:
無溶劑系統(tǒng)中固定化全細胞酶催化生產(chǎn)植物甾醇酯的方法，它包括如下步驟
1)固定化全細胞酶的制備
(1) 將市售的葡枝根霉(i Wzo/7M Wo/om/")按常規(guī)方法配制成103孢子懸浮液， 得葡枝根霉(及/^叩^ Wo/om/e。孢子懸浮液，備用；
(2) 搖瓶培養(yǎng)基配制按各組份所占質量百分比全脂豆粉(烘干后粉碎，過40目)2.0%，菜籽油(市售)0.4%，磷酸氫二鉀1.2%，硫酸銨0.3%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫 鈉0.4%，水95.4%;選取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫 鈉和水混合，得搖瓶培養(yǎng)基，備用；
(3) 將聚氨酯剪切成4mm泡沫顆粒，備用;
(4) 按100ml搖瓶培養(yǎng)基中加2ml葡枝根霉(Rhizopus slolonifer)孢子懸浮液，100ml 搖瓶培養(yǎng)基中加聚氨酯泡沬顆粒0.4g，將葡枝根霉(Rhizopus slolonifer)和聚氨酯在搖瓶 培養(yǎng)基中，28t:條件下培養(yǎng)48h;取出長滿葡枝根霉(Rhizopus slolonifer)的聚氨酯泡沫 顆粒，真空干燥，得固定化全細胞酶(催化劑)，備用；
2) 酯化將食用大豆油中加入甾醇和固定化全細胞酶，加塞后置于水浴恒溫振蕩器 中在溫度48'C、轉速200r/min的條件下進行酯化反應，反應時間48h，得酯化后的反應
產(chǎn)物；其中，食用大豆油與甾醇的質量比為5: 1;固定化全細胞酶為下述(1)食用大 豆油，(2)甾醇，二種質量之和的1.5%;
3) 離心分離、干燥將酯化后的反應產(chǎn)物離心分離，3000rpm，離心15min，離心后 的上層液為植物甾醇酯產(chǎn)品；離心后的固體物冷凍干燥，0°C， lmbar，干燥時間5小時， 得固定化全細胞酶，可重復使用。
權利要求
1.無溶劑系統(tǒng)中固定化全細胞酶催化生產(chǎn)植物甾醇酯的方法，其特征在于它包括如下步驟1)固定化全細胞酶的制備(1)將葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)按常規(guī)方法配制成102～104孢子懸浮液，得葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子懸浮液，備用；(2)搖瓶培養(yǎng)基配制按各組份所占質量百分比全脂豆粉2.0％，菜籽油0.3～0.6％，磷酸氫二鉀1.2％，硫酸銨0.3％，硫酸鎂0.3％，磷酸二氫鈉0.4％，水95.2～95.5％；選取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鈉和水混合，得搖瓶培養(yǎng)基，備用；(3)將聚氨酯剪切成3～5mm泡沫顆粒，備用；(4)按100ml搖瓶培養(yǎng)基中加1～3ml葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子懸浮液，100ml搖瓶培養(yǎng)基中加聚氨酯泡沫顆粒0.3～0.5g，將葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)和聚氨酯在搖瓶培養(yǎng)基中，26～30℃條件下培養(yǎng)40～60h；取出長滿葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)的聚氨酯泡沫顆粒，真空干燥，得固定化全細胞酶，備用；2)酯化將油酸、月見草油或食用大豆油中加入甾醇和固定化全細胞酶，置于水浴恒溫振蕩器中在溫度40～60℃、轉速100～300r/min的條件下進行酯化反應，反應時間46～50h，得酯化后的反應產(chǎn)物；其中，油酸、月見草油或食用大豆油與甾醇的質量比為3～7∶1；固定化全細胞酶為下述(1)油酸、月見草油或食用大豆油，(2)甾醇，二種質量之和的1.0～1.7％；3)離心分離、干燥將酯化后的反應產(chǎn)物離心分離，離心后的上層液為植物甾醇酯產(chǎn)品；離心后的固體物冷凍干燥，得固定化全細胞酶催化劑。
2. 根據(jù)權利要求1所述的無溶劑系統(tǒng)中固定化全細胞酶催化生產(chǎn)植物甾醇酯的方法， 其特征在于步驟3)所述的離心分離的條件是2000 4000rpm，離心10 20min。
3. 根據(jù)權利要求1所述的無溶劑系統(tǒng)中固定化全細胞酶催化生產(chǎn)植物甾醇酯的方法， 其特征在于步驟3)所述的冷凍干燥的條件是-10 0°C， lmbar，干燥時間3 5小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)植物甾醇酯的方法。無溶劑系統(tǒng)中固定化全細胞酶催化生產(chǎn)植物甾醇酯的方法，其特征在于它包括如下步驟1)固定化全細胞酶的制備；2)酯化將油酸、月見草油或食用大豆油中加入甾醇和固定化全細胞酶，置于水浴恒溫振蕩器中在溫度40～60℃、轉速100～300r/min的條件下進行酯化反應，反應時間46～50h，得酯化后的反應產(chǎn)物；其中，油酸、月見草油或食用大豆油與甾醇的質量比為3～7∶1；固定化全細胞酶為下述(1)油酸、月見草油或食用大豆油，(2)甾醇，二種質量之和的1.0～1.7％；3)離心分離、干燥將酯化后的反應產(chǎn)物離心分離，離心后的上層液為植物甾醇酯產(chǎn)品。本發(fā)明工藝制作簡單、成本低、多次使用、環(huán)保并可適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P33/00GK101200754SQ20071016865
公開日2008年6月18日 申請日期2007年12月7日 優(yōu)先權日2007年12月7日
發(fā)明者劉昌盛, 張銀波, 江木蘭, 胡小加, 董緒燕, 洪 陳, 芳 魏, 黃鳳洪 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所