專利名稱：：一種耐有機(jī)溶劑蛋白酶及其產(chǎn)生菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌株以及該耐有機(jī)溶劑蛋白酶，屬于微生物學(xué)與酶學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：蛋白酶廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品、制藥、制革、診斷試劑、污水處理等領(lǐng)域。1984年，Klibanov等人發(fā)現(xiàn)蛋白酶在一些有機(jī)溶劑中保存較長時間仍然具有活性，而且可以催化合成肽鍵的反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了非水酶學(xué)的興起。大量研究表明，有機(jī)溶劑中進(jìn)行酶促反應(yīng)有許多優(yōu)點(diǎn)，如有機(jī)底物的溶解性大大增強(qiáng)、酶的穩(wěn)定性提高、防止微生物污染、產(chǎn)物易純化等。更重要的是，在有機(jī)溶劑中利用蛋白酶催化合成肽，可以避免氨基酸的外消旋作用，不需要對氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行保護(hù)及脫保護(hù)，因此降低成本。研究表明，只有當(dāng)酶分子具有一定的構(gòu)象時，才能表現(xiàn)出催化活力。水直接或間接地參與維持酶分子構(gòu)象的非共價作用力，維持酶的活性構(gòu)象變化所需的"柔性"。因此，有機(jī)溶劑尤其是親水性有機(jī)溶劑對天然來源的蛋白酶分子的催化活性影響很大。為了改善酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性，人們采用各種方法如酶的定向進(jìn)化或化學(xué)修飾、固定化等策略。但是效果并不能滿足實(shí)際催化的需要。耐有機(jī)溶劑極端微生物能在富含有機(jī)溶劑的環(huán)境中生存，因此其所產(chǎn)胞外蛋白酶很有可能具有一定的有機(jī)溶劑耐受性。在已報道的有機(jī)溶劑耐受性微生物中以革蘭氏陰性菌為主,僅有少量文獻(xiàn)報道了具有有機(jī)溶劑耐受性的革蘭氏陽性菌如Bacillus(芽孢桿菌屬)，Rhodococcus(紅球菌屬)和Arthrobacter(節(jié)桿菌屬)等。目前已報道的產(chǎn)溶劑穩(wěn)定性蛋白酶的微生物多為Pseudomonas(假單胞菌屬)菌株。國內(nèi)關(guān)于耐有機(jī)溶劑微生物產(chǎn)蛋白酶的相關(guān)報道并不多。其中也未見Serratiamarcescens產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有優(yōu)良有機(jī)溶劑耐受性能的蛋白酶及其產(chǎn)生菌株o本發(fā)明提供一種具有有機(jī)溶劑耐受性的沙雷氏菌屬菌株，命名為Sermri/^rcm^似MH6，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心(湖北省武漢市武漢大學(xué))，保藏日期2008年11月7日，其保藏登記號為CCTCCNO:M208205。菌株mfl;r^^wMH6為耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌。篩選過程如下初篩采用不同濃度環(huán)己垸、DMF、DMSO等有機(jī)溶劑為篩選壓力從油污土樣中篩選獲得耐有機(jī)溶劑極端微生物。然后，采用牛奶瓊脂平板培養(yǎng)基，從上述耐有機(jī)溶劑極端微生物中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌株，共獲得6株蛋白酶高產(chǎn)菌。復(fù)篩通過檢測各菌株產(chǎn)蛋白酶能力及所產(chǎn)蛋白酶的有機(jī)溶劑耐受性，從初篩菌中選取具有優(yōu)良有機(jī)溶劑耐受性能的蛋白酶的產(chǎn)生菌。菌株MH6產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)，活力高達(dá)1204U/mL;該菌株的粗酶液具有優(yōu)良有機(jī)溶劑耐受性能因此，最終選擇菌株MH6作為耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌。菌株MH6經(jīng)過BIOLOG自動細(xì)菌鑒定儀鑒定和16SrDNA序列分析，表明該菌株屬于沙雷氏菌屬，為SeAT加'"膨/resre"51，并命名Ser融'awarcesc卿MH6。菌株&m^awarcescemMH6為革蘭氏陰性短桿菌株，無芽孢，周生鞭毛，菌落為紅色，大小為1nmxl.50.7x1.0nm。在LB培養(yǎng)基中生長24小時后，菌落大小為1.52.5mm。該菌株生長溫度范圍為2045°C，最適生長溫度為35。C，生長pH為59，最適pH為8.0，在有氧條件下生長。本發(fā)明對菌株Se/rart'awa/x^cmyMH6產(chǎn)生的耐有機(jī)溶劑蛋白酶進(jìn)行了純化(1)硫酸銨沉淀法初步純化耐有機(jī)溶劑蛋白酶。將粗酶液置于冰浴中，加入50%飽和度的(NH4)2S04沉淀雜蛋白，然后向上清液中加入(NH4)2S04至飽和度60%，獲得沉淀。經(jīng)檢測，沉淀中的蛋白酶活力回收達(dá)到69.1%。(2)離子交換層析法進(jìn)一步純化耐有機(jī)溶劑蛋白酶。通過SDS-PAGE電泳分析，表明經(jīng)過兩步純化，該蛋白酶已經(jīng)達(dá)到電泳純，其亞基分子量約為5254kDa;最終，蛋白酶純化倍數(shù)(表3)為5.98，回收率為19.87%，比活達(dá)到42388.57U/mg。該耐有機(jī)溶劑蛋白酶，基于十二垸基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分子量為452-54KDa。菌株&n"加/a附flrcescewMH6產(chǎn)生的耐有機(jī)溶劑蛋白酶具有良好的有機(jī)溶劑耐受性，在考察的15種有機(jī)溶劑中，多數(shù)有機(jī)溶劑對蛋白酶的酶活力幾乎沒有影響；DMSO、DMF對蛋白酶酶活力有一定影響，但處理24h后相對酶活力仍然保持在60%以上；異丙醇、丙酮、乙醇、乙腈對酶活影響較大，在24h以后，相對酶活力小于10%以下。菌株Se/r油'am"rcesce/wMH6產(chǎn)生的耐有機(jī)溶劑蛋白酶在50。/。(v/v)的長鏈烷烴如十二烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯中比水相中穩(wěn)定。菌株Serraft》附肌，esce";yMH6產(chǎn)生的耐有機(jī)溶劑蛋白酶的最適反應(yīng)pH為8.0-8.5，在pH68.5，能保留最大活力的50%以上；該酶在pH68的范圍具有很好的穩(wěn)定性。該酶的最適反應(yīng)溫度為40-45°C，在30、40和45'C放置一小時后，仍然能保留初始活力的70%以上，較穩(wěn)定。當(dāng)溫度大于等于5(TC時，該酶活力隨著放置時間的變化迅速失活。Ca2+、Mg^和NP離子對該耐有機(jī)溶劑蛋白酶有激活作用，而高濃度的離子溶液對酶活有抑制作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF)對該酶活力有輕微抑制，表面活性劑Tween80、TritonX-100等對蛋白酶活有激活作用，而SDS對該酶活有顯著抑制；巰基乙醇對該蛋白酶活有明顯的抑制作用，表明該蛋白酶結(jié)構(gòu)中有二硫鍵存在。本發(fā)明分離克隆了菌株Ser加'aMH6產(chǎn)生的耐有機(jī)溶劑蛋白酶，所述的耐有機(jī)溶劑蛋白酶具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。該耐有機(jī)溶劑蛋白酶的編碼基因具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。LC/MS/MS(HPLC-massspectrometryanalysis)分析結(jié)果顯示，該耐有機(jī)溶劑蛋白酶屬于Serrariamarcesce"s金屬蛋白酶家族。在NCBI上進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白酶編碼基因與Serr。ria則rcescerametalloproteasegene(Serr加'amarcesceraSM6金屬蛋白酶)同源性為98%。CDS區(qū)域編碼基因?qū)?yīng)的氨基酸比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)相似度為99%，有四個氨基酸不同。本發(fā)明提供的菌株附wc^ce似MH6是能夠耐受有機(jī)溶劑的極端微生物，能夠產(chǎn)生耐有機(jī)溶劑蛋白酶，豐富了極端微生物的種類和耐有機(jī)溶劑蛋白酶的來源。該蛋白酶與其它的天然蛋白酶相比，具有良好的有機(jī)溶劑耐受性，有望應(yīng)用于非水相中多肽的合成及關(guān)于其有機(jī)溶劑耐受機(jī)理的理論研究。圖1是牛奶瓊脂平板篩選照片；圖2是耐有機(jī)溶劑蛋白酶的SDS-PAGE電泳分析，其中1-標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，2-硫酸銨沉淀后蛋白酶液，3-DEAE-S印haroseFF離子交換后蛋白酶液；圖3表示不同有機(jī)溶劑對蛋白酶的影響；圖4表示蛋白酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性；圖5表示耐有機(jī)溶劑蛋白酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性，其中圖5(1)表示耐有機(jī)溶劑蛋白酶的最適反應(yīng)pH，圖5(1)表示耐有機(jī)溶劑蛋白酶的pH穩(wěn)定性；圖6表示耐有機(jī)溶劑蛋白酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性，其中圖6(1)表示耐有機(jī)溶劑蛋白酶的最適反應(yīng)溫度，圖6(2)表示耐有機(jī)溶劑蛋白酶的溫度穩(wěn)定性。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一本實(shí)驗(yàn)說明產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶的天然菌株的篩選程序。初篩獲得能夠耐受有機(jī)溶劑并產(chǎn)蛋白酶的菌株。采用不同濃度環(huán)己垸、DMF、DMSO等有機(jī)溶劑為篩選壓力從油污土樣中篩選獲得耐有機(jī)溶劑極端微生物。然后，采用牛奶瓊脂平板培養(yǎng)基從上述耐有機(jī)溶劑極端微生物中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌株。根據(jù)各菌株在牛奶瓊脂平板培養(yǎng)基上形成的菌落與透明圈直徑之比值，初步篩選到6株蛋白酶高產(chǎn)菌(圖l)。由于此6株菌能夠耐受有機(jī)溶劑，其產(chǎn)生的蛋白酶也很有可能具有有機(jī)溶劑耐受性。復(fù)篩通過檢測各菌株產(chǎn)蛋白酶能力及所產(chǎn)蛋白酶的有機(jī)溶劑耐受性，從初篩菌中選取具有優(yōu)良有機(jī)溶劑耐受性能的蛋白酶的產(chǎn)生菌。將初篩獲得的菌株接種到產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，于35'C，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)24h。將發(fā)酵液離心(4°C，9000r/min離心15min)，上清液為粗酶液。檢測各粗酶液的蛋白酶活性，其中菌株MH6產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)，活力高達(dá)1204U/mL。取菌株MH6粗酶液1mL，分別加入等體積的十六烷、十四垸、十二垸、癸垸、乙酸乙酯、正辛烷、丙酮、乙醇、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜(DMSO)等，于30。C、180rpm震蕩處理24h后，以酪蛋白為底物檢測蛋白酶剩余酶活；實(shí)驗(yàn)表明該酶具有優(yōu)良有機(jī)溶劑耐受性能。在DMF中處理后仍能保持60y。以上酶活，尤其在疏水有機(jī)溶劑中處理2411后保持80%以上酶活。因此，最終選擇菌株MH6作為耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌，進(jìn)行后續(xù)研究。牛奶瓊脂平板培養(yǎng)基(MLB):胰蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，脫脂奶粉12g/L，瓊脂18g/L。產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L，(NH4)2S041.8g/L，KH2P040.5g/L，MgSO40.3g/L，CaCl21.0g/L，NaC11.0g/L，甘油5ml/L。蛋白酶活力檢測方法為配制酪蛋白含量為2y。(W/V)的pH為8.0的Tris-HCl緩沖液作為反應(yīng)底物。取lmL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的粗酶液，加入lmL反應(yīng)底物，4(TC保溫10min后加入4mLTCA反應(yīng)終止液(含有0.11M三氯乙酸，0.22M醋酸鈉，0.33M醋酸)。將該反應(yīng)混合物于4。C靜置15min，12000rpm離心25min，取上清液于280nm處檢測紫外吸光值。每一個單位(U)蛋白酶活力定義為，在40'C，pH為8.0的反應(yīng)條件下，每毫升粗酶液每分鐘催化產(chǎn)生liag酪氨酸所需的酶量。實(shí)施例二本實(shí)驗(yàn)說明耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌MH6的生理生化性質(zhì)及其鑒定菌株&mrf/amarcMce似MH6為革蘭氏陰性短桿菌株，無芽孢，周生鞭毛，大小為1pmxl.50.7x1.0pm。在LB培養(yǎng)基中生長24小時后，菌落為紅色，菌落大小為1.52.5rnm。該菌株生長溫度范圍為2045°C，最適生長溫度為35°C，生長pH為59，最適pH為8.0，在有氧條件下生長。其生理生化性質(zhì)見(表l)。LB培養(yǎng)基配方胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC11.0g/L。表1菌株MH6的部分生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注+(陽性)能利用；-(陰性):不能利用。經(jīng)過BIOLOG自動細(xì)菌鑒定儀和16SrDNA序列分析，菌株MH6屬于沙雷氏菌屬，為SeA"raftV3脂rcescera，并命名Serraf/a附arcesce"sMIK?？疾霺errari"mflrce"e/MMH6的溶劑耐受性。500mL三角瓶中MLB培養(yǎng)基的裝液量為40mL，菌株Serrariflwm/r^ceraMH6的接種量為2%(體積百分?jǐn)?shù))。在各培養(yǎng)體系中分別加入不同的有機(jī)溶劑溶劑(11種)，添加量為20%(體積百分?jǐn)?shù))，其中有機(jī)溶劑含量為20%，總體系為50ml，以橡膠塞封口，于37'C，搖床180rpm培養(yǎng)，培養(yǎng)時間24h取樣檢測OD660(表2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株MH6能在含有不同有機(jī)溶劑的培養(yǎng)基中生長(對照中不添加有機(jī)溶劑)，具有一定的有機(jī)溶劑耐受性。LogPo/w大于2.0的有機(jī)溶劑如十二垸，庚垸，環(huán)己烷對MH6的生長影響較?。籐ogPo/w小于2.0的有機(jī)溶劑如異丙醇，乙醇能明顯抑制菌株MH6的生長。表2有機(jī)溶劑對菌株wflrcesce似MH6生長的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注++:生長良好；+:可以生長；一不可以生長。實(shí)施例三本實(shí)驗(yàn)說明菌株SerrW/awa/rescewMH6所產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶的純化程序。菌株Serra"a加arcesce"sMH6在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)28h，將所得的發(fā)酵液離心(卯00rmp，4°C)20min，取上清液作為粗酶液。硫酸銨沉淀法初步純化耐有機(jī)溶劑蛋白酶。將粗酶液置于冰浴中，一邊攪拌一邊緩慢加入(NH4)2SO4至50。/。飽和度，然后離心(9000rmp，4°C)20min，取上清液繼續(xù)加入(NH4)2S04至60%飽和度，再次離心(9000rmp,4°C)20min，將所得沉淀用Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH8.0)溶解。經(jīng)檢測，沉淀中的蛋白酶活力回收率達(dá)到69.1%。離子交換層析法進(jìn)一步純化耐有機(jī)溶劑蛋白酶。DEAEFastFlow離子交換層析柱事先采用Tris-HCl緩沖液(20mmol/L，pH7.5)平衡，將硫酸銨沉淀法所得沉淀的Tris-HCl溶液作為進(jìn)一步純化的樣品，上樣至DEAEFastFlow離子交換層析柱，然后用含鹽(NaCl濃度為1mol/L)的Tris-HCl緩沖液(20mmol/L，pH7.5,)進(jìn)行梯度洗脫，收集具有蛋白酶活性的洗脫液。通過SDS-PAGE電泳分析(圖2)，表明經(jīng)過兩步純化，該蛋白酶已經(jīng)達(dá)到電泳純，其亞基分子量約為5254kDa;最終，蛋白酶純化倍數(shù)(表3)為5.98，回收率為19.87%，比活達(dá)到42388.57U/mg。表3耐有機(jī)溶蛋白酶MH6的純化步驟及結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(60%)DEAEFastFlow148360.3542388.5719.875.98注蛋白質(zhì)濃度采用考馬斯亮蘭法測定實(shí)施例四本實(shí)驗(yàn)說明菌株Serraf/ama/r^ceraMH6所產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)。(1)溶劑耐受性采用實(shí)施例三的方法，獲得耐有機(jī)溶劑蛋白酶。將該蛋白酶稀釋液分別加入等體積有機(jī)溶劑如十六垸、十四烷、環(huán)己垸、DMF、DMSO、丙酮、乙醇，在30°C、180rpm振蕩24h后，檢測殘留蛋白酶活力(圖3)。對照中加入等體積Tris-HCl緩沖液(0.05M，pH8.0)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該蛋白酶具有良好的有機(jī)溶劑耐受性，在考察的15種有機(jī)溶劑中，多數(shù)有機(jī)溶劑對蛋白酶的酶活力幾乎沒有影響；DMSO、DMF對蛋白酶酶活力有一定影響，但處理24h后相對酶活力仍然保持在60%以上；異丙醇、丙酮、乙醇、乙腈對酶活影響較大，在24h以后，相對酶活力小于10%以下。(2)溶劑穩(wěn)定性通常，疏水有機(jī)溶劑不直接與酶接觸，所以抑制酶活力能力較親水性有機(jī)溶劑小，本研究中考査了幾種疏水有機(jī)溶劑對蛋白酶的穩(wěn)定性的影響。如圖4所示，此蛋白酶在50Q/。(v/v)的長鏈烷烴如十二烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯中比水相(control中添加的是緩沖液)中穩(wěn)定。(3)耐有機(jī)溶劑蛋白酶最適反應(yīng)pH值和pH穩(wěn)定性以不同pH值的酪蛋白為底物，檢測菌株Semrf/fl附wc"ce似MH6所產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶的最適反應(yīng)pH。由圖5(1)可見，該耐有機(jī)溶劑蛋白酶的最適反應(yīng)pH為8.0-8.5，反應(yīng)pH為68.5時，蛋白酶活力能保留最大活力的50%以上(以pH8.0條件下的蛋白酶活力為100%)。向該耐有機(jī)溶劑蛋白酶中加入不同pH(pH介于69)的緩沖溶液，于40°C保溫lh后，檢測蛋白酶活力(以初始蛋白酶活力為對照)，以考察pH對該耐有機(jī)溶劑蛋白酶穩(wěn)定性的影響。由圖5(2)可知，該蛋白酶在pH68的范圍具有10很好的穩(wěn)定性。(4)最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性在Tris-HCl緩沖體系(0.05M,pH8.0)下，檢測菌株Serra"'a/warcMcemMH6所產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶的最適反應(yīng)溫度。從圖6(1)可以看出，該酶最適反應(yīng)溫度為40"45。C。將菌株&rraft'a附arce化e似MH6所產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶在30°C、40°C、45°C、50°C、55'C下分別放置1h以后，測定殘留蛋白酶活力，以考察溫度對該蛋白酶穩(wěn)定性的影響(圖6(2))。該蛋白酶在30、40和45。C水浴中處理后，仍然能保留初始活力的70%以上，較穩(wěn)定。當(dāng)溫度大于等于50"C時，該酶活力隨著放置時間的變化迅速失活。(5)金屬離子對蛋白酶活力的影響向該耐有機(jī)溶劑蛋白酶中加入不同濃度的EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)和1,10-Phenathroline(鄰菲羅林)，4。C下放置30min后，檢測殘留蛋白酶活力(表4(l))。結(jié)果顯示，隨著EDTA濃度的增加，抑制作用逐漸加強(qiáng)，10mM的EDTA對酶活有明顯的抑制作用；lmM的l，lO-Phenathroline幾乎完全抑制該酶活力。向該耐有機(jī)溶劑蛋白酶中，加入各種金屬離子，考察金屬離子對其酶活力的影響。操作過程如下向該耐有機(jī)溶劑蛋白酶中加入EDTA除去溶液中的微量離子，使其終濃度分別為為1mmolL"和5mmo1L"，于4t:下放置30min后，分別添加Ca2+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、Cn2+、Fe2+、Co2+、砲2+等二價金屬離子(對應(yīng)于EDTA濃度，各金屬離子終濃度為分別為1mmolL—1和5mmolU1)，于4°C下放置30min后，檢測蛋白酶活力。對照中不加入任何金屬離子。由表4(2)可見，1mmolL'1的Ca2+、Mg2+、Ni"離子對該蛋白酶有激活作用，而高濃度的離子溶液對酶活有抑制作用。表4(1)金屬離子鰲合劑對蛋白酶活力的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>11.250.6表4(2)金屬離子對蛋白酶活力的影響^^屬禹^F濃度(mM)殘留蛋白酶活力(％)金屬離子濃度(mM)殘留蛋白酶活力(％)Ni2+1116.1Ca2+1113.0115.272.0Ba2+1107.4Cu2+142.179.0516.8Mg2+1110.7Mn2+1107.290.244.3Zn2+167.7Co2+1101.859.1562.4(6)表面活性劑及抑制劑對蛋白酶活性的影響向該耐有機(jī)溶劑蛋白酶中，分別加入不同濃度的表面活性劑和抑制劑，在25'C放置10min后，檢測蛋白酶活力，考察其對該酶活力的影響。對照中不添加任何抑制劑和表面活性劑。由表5可見，絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF)對該酶活力有輕微抑制，表面活性劑Tween80、TritonX-100等對蛋白酶活有激活作用，而SDS對該酶活有顯著抑制；巰基乙醇對該蛋白酶活有明顯的抑制作用，表明該蛋白酶結(jié)構(gòu)中有二硫鍵存在。表5變性劑和表面活性劑的影響變性劑/表濃度殘留蛋白酶變性劑/表面活濃度殘留蛋白面活性劑(mM)活力(％)性劑(W/V)酶活力(％)PMSF195.1glutathione193.755.2CTAB0.1%0.8DTT161.7Tween800.1o/o102.312<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注PMSF二苯基氟磷酸，glutathione還原型的谷胱甘肽，DTT二硫蘇糖醇，Urea尿素，Mercaptoethanol巰基乙醇，SDS十二烷基磺酸鈉，L-CysteineL-半胱氨酸，CTAB十二烷基三甲基溴化銨。實(shí)施例五本實(shí)驗(yàn)說明粘質(zhì)沙雷氏菌&zrc^a附^rewem"MH6所產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶的LC/MS/MS分析以及其編碼基因的分離克隆程序。純化后的耐有機(jī)溶劑蛋白酶經(jīng)SDS-PAGE電泳分析后，切出含有目的蛋白的單一條帶。將該目的蛋白經(jīng)過胰蛋白酶水解后獲得中間肽段，(片段l)GNGIQINGK，(片段2)FSSTNVAGDTGLSK，(片段3)TGDTVYGFNSNTGR和(片段4)SFSDVGGLK，委托國家生物醫(yī)學(xué)分析中心(NBCA)進(jìn)行LC/MS/MS序列分析。將所得的片段信息通過NCBI蛋白酶數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果顯示四條肽段序列與粘質(zhì)沙雷氏菌&mzrifl廳rcescen5SM6金屬蛋白酶氨基酸相應(yīng)序列相同，因此根據(jù)該金屬蛋白酶的序列設(shè)計引物來擴(kuò)增目的蛋白的基因序列。采用酚一氯仿法抽提菌體總DNA。根據(jù)粘質(zhì)沙雷氏菌SeAr加fo！/narcesceraSM6金屬蛋白酶基因序列，設(shè)計簡并引物(PF:GTGGCTTACGGGGAGGTTAT;PR:TCCGTTGCTGTGTTACACGA)，擴(kuò)增該耐有機(jī)溶劑蛋白酶的編碼序列。PCR反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性5min;94。C變性lmin;55。C退火2min;72'C延伸2min;循環(huán)30輪后，72'C保溫10min。根據(jù)該反應(yīng)條件，擴(kuò)增到了約1.6kb的PCR片段。根據(jù)測定此蛋白的分子量，推斷此酶蛋白的編碼基因長度不超過1.5kb。將此片段連接到pMD18-T載體，進(jìn)行序列測定。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)克隆的基因序列包括了之前LCMS/MS分析得到的肽段序列。在NCBI上進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白酶編碼基因與Serrcrifl！附arcesceismetalloproteasegene(5fernaria附arcesce/zsSM6金屬蛋白酶)同源性為98%。CDS區(qū)域編碼基因?qū)?yīng)的氨基酸比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)相似度為99%，有四個氨基酸不同。該蛋白酶片段含信號肽序列17個氨基酸，編碼成熟蛋白酶的氨基酸個數(shù)為487。序列表<110>南京工業(yè)大學(xué)<120>—種耐有機(jī)溶劑蛋白酶及其產(chǎn)生菌林<130>njut2009<160>4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>1515<212>DNA<213>SerratiamarcescensMH6<220><221〉CDS<222>(1).(1512)<220><221>sig—peptide<222〉(l)..(51)<220><221>mat—peptide<222>(100)..()<400>1atgtctatctgtctgattgatatcaatcaggtaatgagtggaatcgaa48MetSerlieCysLeulieAsplieAsnGinValMetSerGlylieGlu-30-25-20ccaatgcaatctactaaaaaggcaattgaaattactgaatecagectt96ProMetGinSerThrLysLysAlalieGlulieThrGluSerSerUu-15-10-5gcggccgcggcaaccggctacgatgetgtagatgacctgctgcattat144AlaAlaAlaAlaThrGlyTyrAspAlaValAspAspLeuLeuHisTyr-l151015catgageggggtaacgggattcagattaatggcaaggatteaUttct192HisGluArgGlyAsnGlylieGinlieAsnGlyLysAspSerPheSer202530aacgagcaagetgggUgtttattacccgcgagaaccaaacctggaac240AsnGluGinAlaGlyLeuPhelieThrArgGluAsnGinThrTrpAsn354045ggttacaaggtatttggccagccggtcaaattaaccttctecttcccg288GlyTyrLysValPheGlyGinProValLysUuThrPheSerPhePro505560gactataagttctcttecaccaacgtcgccggcgataccgggctgage336AspTyrLysPheSerSerThrAsnValAlaGlyAspThrGlyLeuSer657075aagttcagegcggaacagcagcagcaggetaagctgtegctgcagtec384LysPheSerAlaGluGinGinGinGinAlaLysLeuSerLeuGinSer80859095tgggccgacgtcgccaatateaccttcaccgaagtggcggccggtcaa432TrpAlaAspValAlaAsnlieThrPheThrGluValAlaAlaGlyGin100105110aaggccaatateaccttcggcaattacagecagggtcgtcccggccac480LysAlaAsnlieThrPheGlyAsnTyrSerGinGlyArgProGlyHis115120125tatgattatggtacccaggcctacgccUcctgccgaacaccatttgg528TyrAspTyrGlyThrGinAlaTyrAlaPheLeuProAsnThrlieTrp130135140cagggccaggatttgggcggccagacctggtacaacgtcaaccaatec576GinGlyGinAspLeuGlyGlyGinThrTrpTyrAsnValAsnGinSer145150155aacgtgaagc"ccggcgaccgaagactacggccgccagacgttcacc624AsnValLysHisProAlaThrGluAspTyrGlyArgGinThrPheThr160165170175catgagattggccatgcgctgggcctgagecacccgggcgactacaac672HisGlulieGlyHisAlaUuGlyLeuSerHisProGlyAspTyrAsn180185190gccggtgagggcaacccgacctataacgacgtcaccUtgcggaagat720AlaGlyGluGlyAsnProThrTyrAsnAspValThrTyrAlaGluAsp195200205acccgccagttcagectgatgagetactggagtgaaaccaataccggt768ThrArgGinPheSerLeuMetSerTyrTrpSerGluThrAsnThrGly210215220ggcgacaacggcggtcactatgccgcggetccgctgctggatgacatt816GlyAspAsnGlyGlyHisTyrAlaAlaAlaProLeuLeuAspAsplie225230235gccgccattcagcatctgtatggcgccaacctgtegacccgcaccggc864AlaAlalieGinHisLeuTyrGlyAlaAsnLeuSerThrArgThrGly240245250255gacaccgtgtacggctttaactecaataccggtcgtgacttcetcage912AspThrValTyrGlyPheAsnSerAsnThrGlyArgAspPheLeuSer260265270accaccageaattegcagaaagtgatetttgcggcctgggatgcgggt960ThrThrSerAsnSerGinLysValliePheAlaAlaTrpAspAlaGly275280285ggcaacgataccttcgacttctecggttataccgetaaccagcgcate1008GlyAsnAspThrPheAspPheSerGlyTyrThrAlaAsnGinArglie290295300aacctgaatgagaaategttctecgacgtgggcggcctgaagggcaac1056AsnLeuAsnGluLysSerPheSerAspValGlyGlyLeuLysGlyAsn305310315gtctegategccgccggtgtgaccattgagaacgccactggcggttec1104ValSerlieAlaAlaGlyValThrlieGluAsnAlaThrGlyGlySer320325330335ggcaacgacgtgategtcggcaacgcggccaacaacgtgctgaaaggc1152GlyAsnAspVallieValGlyAsnAlaAlaAsnAsnValLeuLysGly340345350ggcgcgggtaacgacgtgctgttcggcggcggcggggcggatgaactg120016GlyAlaGlyAsnAspValLeuPheGlyGlyGlyGlyAlaAspGluLeu355360365tggggcggtgccggcaaagacatetttgtgttctctgccgccagegat1248TrpGlyGlyAlaGlyLysAspliePheValPheSerAlaAlaSerAsp370375380tctgcaccgggtgettecgactggatecgcgacttccaaaaagggate1296SerAlaProGlyAlaSerAspTrplieArgAspPheGinLysGlylie385390395gacaagategacctgtegttcttcaataaagaagcgaatageagtgat1344AspLyslieAspLeuSerPhePheAsnLysGluAlaAsnSerSerAsp糊405410415ttcatecacttcgtcgatcacttcageggcacggccggtgaggcgctg1392PhelieHisPheValAspHisPheSerGlyThrAlaGlyGluAlaLeu420425430ctgagetacaacgcgtecageaatgtgaccgatttgteggtgaacate1440LeuSerTyrAsnAlaSerSerAsnValThrAspLeuSerValAsnlie435440445ggcgggcatcaggcgccggacttcctggtgaaaategtcggccaggta1488GlyGlyHisGinAlaProAspPheLeuValLyslieValGlyGinVal450455460gacgtcgccacggactttategtgtaa1515AspValAlaThrAspPhelieVal465470<210>2<211>504<212>PRT<213>SerratiamarcescensMH6<400>2MetSerlieCysLeulieAsplieAsnGinValMetSerGlylieGlu—30-25—20ProMetGinSerThrLysLysAlalieGlulieThrGluSerSerLeu—15-10AlaAlaAlaAlaThrGlyTyrAspAlaValAspAspLeuLeuHisTyr一l151015HisGluArgGlyAsnGlylieGinlieAsnGlyLysAspSerPheSer202530AsnGluGinAlaGlyLeuPhelieThrArgGluAsnGinThrTrpAsn354045GlyTyrLysValPheGlyGinProValLysLeuThrPheSerPhePro505560AspTyrLysPheSerSerThrAsnValAlaGlyAspThrGlyLeuSer657075LysPheSerAlaGluGinGinGinGinAlaLysLeuSerLeuGinSer80859095TrpAlaAspValAlaAsnlieThrPheThrGluValAlaAlaGlyGin100105110LysAlaAsnlieThrPheGlyAsnTyrSerGinGlyArgProGlyHis115120125TyrAspTyrGlyThrGinAlaTyrAlaPheLeuProAsnThrlieTrp130135140GinGlyGinAspLeuGlyGlyGinThrTrpTyrAsnValAsnGinSer145150155AsnValLysHisProAlaThrGluAspTyrGlyArgGinThrPheThr18160165170175HisGlulieGlyHisAlaLeuGlyLeuSerHisProGlyAspTyrAsn180185190AlaGlyGluGlyAsnProThrTyrAsnAspValThrTyrAlaGluAsp195200205ThrArgGinPheSerLeuMetSerTyrTrpSerGluThrAsnThrGly210215220GlyAspAsnGlyGlyHisTyrAlaAlaAlaProLeuLeuAspAsplie225230235AlaAlalieGinHisLeuTyrGlyAlaAsnLeuSerThrArgThrGly240245250255AspThrValTyrGlyPheAsnSerAsnThrGlyArgAspPheLeuSer260265270ThrThrSerAsnSerGinLysValliePheAlaAlaTrpAspAlaGly275280285GlyAsnAspThrPheAspPheSerGlyTyrThrAlaAsnGinArglie290295300AsnLeuAsnGluLysSerPheSerAspValGlyGlyLeuLysGlyAsn305310315ValSerlieAlaAlaGlyValThrlieGluAsnAlaThrGlyGlySer320325330335GlyAsnAspVallieValGlyAsnAlaAlaAsnAsnValLeuLysGly340345350GlyAlaGlyAsnAspValLeuPheGlyGlyGlyGlyAlaAspGluLeu355360365TrpGlyGlyAlaGlyLysAspliePheValPheSerAlaAlaSerAsp370375380SerAlaProGlyAlaSerAspTrplieArgAspP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