一株水解米渣的蛋白酶產(chǎn)生菌——解淀粉芽孢桿菌及其篩選與使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株水解米渣的蛋白酶產(chǎn)生菌——解淀粉芽孢桿菌及其篩選和使用方法，該解淀粉芽孢桿菌（ Bacillus amyloliquefaciens ）菌株純培養(yǎng)物已于2014年5月13日保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱解淀粉芽孢桿菌HP60，保藏編號為CCTCC NO.M 2014200。通過初篩和復(fù)篩篩選得到目標菌株。取斜面保藏菌株培養(yǎng)之后，即直接用于米渣中蛋白質(zhì)的水解。解淀粉芽孢桿菌HP60用于米渣蛋白水解，水解度可達15.63％。該菌株成本低、能循環(huán)利用、穩(wěn)定性好、綠色安全、能直接用于生物催化，原料來源廣泛，方法簡單實用。因此，該菌株具有重要應(yīng)用前景，該菌株可應(yīng)用于其他蛋白質(zhì)的水解。
CCTCC NO. M 2014200
2014.05.13
【專利說明】-株水解米渣的蛋白酶產(chǎn)生菌一解淀粉芽孢桿菌及其篩 選與使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物或酶，特別涉及蛋白酶產(chǎn)生菌。

【背景技術(shù)】
[0002] 稻谷，在植物學(xué)上屬禾本科稻屬普通栽培稻亞屬種的普通稻亞種，是全球第一大 糧食品種。稻谷的年均產(chǎn)量大約占到了全國糧食總產(chǎn)量的2/5,達到了 1.90億t。米渣是 以早秈米、碎米、陳化米等為原料進行發(fā)酵和生產(chǎn)糖漿、味精、生化藥品等過程中被過濾掉 米漿后剩下的殘渣，價格低廉，產(chǎn)量巨大，在大米淀粉糖的生產(chǎn)過程中每消耗7t大米就要 產(chǎn)生It米渣。米渣中蛋白質(zhì)含量約為40%?70%，相當于稻谷中蛋白質(zhì)含量的5?8倍， 其含量接近大豆，而且氨基酸配比符合WH0/FA0推薦的理想模式，其品質(zhì)被公認為糧食種 子蛋白中的最佳者。但是這些優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源大部分都以干粉的形式廉價的賣給了飼料 廠做飼料，并沒有得到深度開發(fā)和利用，若將這些米渣蛋白資源轉(zhuǎn)化成具有高附加值的氨 基酸和多肽，不但能提高其生物效價、經(jīng)濟價值，對提高我國稻谷深加工的技術(shù)含量，以及 促進整個糧食產(chǎn)業(yè)的發(fā)展都有著深遠的影響。
[0003] 蛋白質(zhì)經(jīng)酸、堿或者蛋白酶處理可獲得氨基酸和多肽。酸、堿水解作用強烈會破壞 一些敏感氨基酸，并且生成有毒的氯丙醇類物質(zhì)。酶水解條件溫和，對敏感氨基酸無破壞， 能最大保留原料理化性質(zhì)、風味、功能特性、綠色安全，能耗小?？墒悄壳岸鄶?shù)利用商品蛋白 酶水解蛋白質(zhì)，這使得工業(yè)化生產(chǎn)成本較高，因此，篩選蛋白酶產(chǎn)生菌尤為重要。
[0004] 目前中國專利數(shù)據(jù)庫中，涉及蛋白酶產(chǎn)生菌的專利申請件不多，僅有 ZL2010101038046號《一種耐有機溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌及其所產(chǎn)耐有機溶劑蛋白酶的基因和 應(yīng)用》、2007101919691號《一種耐有機溶劑堿性蛋白酶產(chǎn)生菌以及該耐有機溶劑堿性蛋白 酶的基因和應(yīng)用》和2013101991045號《一種膠原蛋白酶產(chǎn)生菌》。至今為止，尚無涉及水 解米渣的蛋白酶產(chǎn)生菌的申請件。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在提供一株水解米渣的蛋白酶產(chǎn)生菌--解淀粉芽孢桿菌，使之能夠用 于米渣蛋白的生物法水解。
[0006] 本發(fā)明的又一目的是提供上述解淀粉芽孢桿菌的篩選方法及使用方法，使其具備 特定的工業(yè)用途。
[0007] 發(fā)明人提供的水解米渣的蛋白酶產(chǎn)生菌是解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)，該菌株純培養(yǎng)物已于2014年5月13日保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物 保藏中心，簡稱解淀粉芽孢桿菌HP60,保藏單位地址：中國武漢?武漢大學(xué)430072,保藏編 號為CCTCC NO. M 2014200。該菌株系從中國貴州傳統(tǒng)豆豉中分離得到。
[0008] 上述解淀粉芽孢桿菌HP60的形態(tài)特征和生理生化特征接近芽孢桿菌屬，解淀 粉芽抱桿菌 HP60 的 16S rRNA 序列與 Genbank 中已知 sw/w/?.NC 009725. 1 序列同源性在 99 % 以上，看家基因 recA 與 Bacillus amyloliquefaciens IT~45 (CP004065.1)> Bacillus amyloliquefaciens ZM77J? (CP006952. 1)等9株同源性達99%。根據(jù)彡伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊彡中芽 孢桿菌屬的分類概況，HP60屬芽孢桿菌綱（ifeci^7i),芽孢桿菌目（ifeciBa/es)，芽 孢桿菌科，芽孢桿菌屬，解淀粉芽孢桿菌種（Baci atnyloliquefaciens、。
[0009] 發(fā)明人提供的解淀粉芽孢桿菌HP60的篩選方法是：先從豆豉采樣，將樣品中的蛋 白酶產(chǎn)生菌分別經(jīng)富集培養(yǎng)后，采用酪蛋白為底物，經(jīng)過富集培養(yǎng)后稀釋涂布在酪蛋白平 板選擇培養(yǎng)基上，以微生物分解酪蛋白的能力作為初篩指標，挑取具有透明圈較大的菌落 在酪蛋白平板上三區(qū)劃線純化，純化后的單菌落移接斜面培養(yǎng)基保存，從而實現(xiàn)初篩；之后 以米渣為底物，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，以微生物搖瓶發(fā)酵米渣，離心，上清液注酪蛋白平板孔，恒溫 培養(yǎng)，以平板孔直徑為指標第一次復(fù)篩；平板經(jīng)直徑較大的菌株再經(jīng)搖瓶發(fā)酵米渣，離心后 測上清液蛋白酶活力，以酶活為指標二次復(fù)篩；最后酶活較高的菌株發(fā)酵米渣，離心，上清 液沸水滅酶，測上清液中氨態(tài)氮，以氨態(tài)氮為指標第三次復(fù)篩。
[0010] 所述富集培養(yǎng)的條件為：富集培養(yǎng)基以g/100mL計的成分：牛肉膏0.5?1.0,蛋 白胨 0? 5 ?1. 0,（NH4)2S04 0? 1 ?0? 2，K2HP04 0? 5 ?1. 0，MgS04.7H20 0? 01 ?0? 02, CaCl2 0.01?0.02，恥(：10.5?1.0，其？116.5?7.5;酪蛋白選擇培養(yǎng)基以8/1001111計的成分 ： 牛肉膏 0? 5 ?1. 0,酪蛋白 0? 5 ?1. 0,（NH4)2S04 0? 1 ?0? 2，K2HP04 0? 5 ?1. 0，MgS04.7H20 0? 01 ?0? 02，CaCl2 0? 01 ?0? 02，NaCl 0? 5 ?1. 0,瓊脂粉 2. 0,其 pH 6. 5 ?7. 5 ;斜面保藏 培養(yǎng)基細菌為細菌完全培養(yǎng)基，真菌為PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基同發(fā)酵培養(yǎng)基以g/1 OOmL計 的成分：米渣 1. 2 ?1. 8, NaCl 0? 5 ?1. 0, MgS04 ? 7H20 0? 01 ?0? 02, CaCl2 0? 01 ?0? 02， K2HP04 0? 5 ?1. 0,其 pH 6. 5 ?7. 5。
[0011] 為了驗證本發(fā)明的菌株，發(fā)明人進行了如下實驗： ⑴樣品米集： 23個分離樣品分別采集于2012年10月，從貴州花溪傳統(tǒng)臘肉、豆豉、酸肉、發(fā)酵肉、豆 制品、酒曲、酒醅采樣，用聚乙烯袋封口；2012年11月從貴州黔東南屠宰場及花溪貴州大學(xué) 南區(qū)食堂附近的表層土壤、淤泥采樣，用聚乙烯袋封口；取回樣品后，即著手分離工作。
[0012] ⑵富集培養(yǎng)： 稱取5. 0g樣品，加入到50mL無菌生理鹽水中，再放入4顆小玻璃珠，于30°C、180r/min 下振蕩培養(yǎng)30min，取5mL加入富集培養(yǎng)基中，30°C、180r/min下?lián)u床富集培養(yǎng)24h ; 上述富集培養(yǎng)基的成分為（以g/l〇〇mL計）：牛肉膏0. 5?1. 0,蛋白胨0. 5?1. 0， (NH4)2S04 0? 1 ?0? 2, K2HP04 0? 5 ?1. 0, MgS04 ? 7H20 0? 01 ?0? 02, CaCl2 0? 01 ?0? 02， NaCl 0? 5 ?1. 0,其 pH 6. 5 ?7. 5。
[0013] ⑶初篩： 取上述0. 2mL稀釋適當梯度的富集菌液涂布于酪蛋白選擇培養(yǎng)基平板，靜置5min，倒 置平板，于30°C培養(yǎng)。挑取形成透明圈較大的單一菌落，劃線純化后在試管斜面上劃Z形 線，30°C條件下培養(yǎng)至出現(xiàn)豐滿的菌落后，4°C冰箱保藏。
[0014] 初篩共獲得形成明顯透明圈的菌株115株，其中菌株HP60形成的透明圈較大。
[0015] 上述初篩酪蛋白選擇培養(yǎng)基的成分為（以g/l〇〇mL計）：牛肉膏0.5?1.0,酪蛋 白 0? 5 ?1. 0，（NH4)2S04 0? 1 ?0? 2, K2HP04 0? 5 ?1. 0, MgS04 ? 7H20 0? 01 ?0? 02, CaCl2 0? 01 ?0? 02, NaCl 0? 5 ?1. 0,瓊脂粉 2. 0,其 pH 6. 5 ?7. 5。
[0016] 斜面保藏培養(yǎng)基：細菌用細菌完全培養(yǎng)基，真菌用PDA培養(yǎng)基。
[0017] ⑷第一次復(fù)篩： 用打孔器在初篩酪蛋白選擇培養(yǎng)基平板上打孔，每平板均勻打3孔(三孔為一組平行)， 孔徑為0. 4cm。挑取初篩試管菌2環(huán)接入種子培養(yǎng)基中，以30°C、180r/min培養(yǎng)24h后，以 6%?8% (1.235X 106 cfu/mL)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在同樣條件下培養(yǎng)24h后，于 4°C、10000r/min離心lOmin，上清液即粗酶液。取30 y L粗酶液注入平板孔，平板于30°C恒 溫培養(yǎng)12h后，測量水解透明圈直徑d作為第一次復(fù)篩指標；選取形成透明圈直徑較大的酶 液所對應(yīng)的菌株以備第二次復(fù)篩。
[0018] 經(jīng)第一次復(fù)篩，115株菌株粗酶液都形成透明圈，透明圈直徑從1.0cm到2. 8cm不 等，透明圈直徑d > 2. 4cm的菌株共26株，解淀粉芽孢桿菌HP60形成的透明圈直徑較大， 為 2. 70±0. 05cm。
[0019] 上述種子培養(yǎng)基同發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為（以g/100mL計）：米渣1.2?1.8, NaCl 0? 5 ?1. 0，MgS04.7H20 0? 01 ?0? 02，CaCl2 0? 01 ?0? 02，K2HP04 0? 5 ?1. 0,其 pH 6. 5 ? 7. 5。
[0020] (5)第二次復(fù)篩： 選取水解透明圈直徑d > 2. 4cm的菌株，采用Folin-酚試劑顯色法測定其粗酶液(粗 酶液制備同第一次復(fù)篩中粗酶液制備）中蛋白酶活力。
[0021] 標準曲線的繪制：取9個10mL容量瓶依次編號0到8,分別加入100Pg/mL的酪 氨酸標準溶液〇，1，2, 3,4, 5,6, 7,8mL，用蒸餾水定容，制得濃度依次為0,10, 20, 30,40, 50， 60,70,80l^g/mL的酪氨酸溶液。分別取上述梯度酪氨酸溶液lmL，各加0.4mol/L Na2C(V^ 液5mL，F(xiàn)olin-酚試劑lmL，置于40°C水浴中顯色20min，取出于680nm波長，10mm比色皿， 以不含酪氨酸的〇號管為空白，分別測定其吸光度；再以吸光度為縱坐標，酪氨酸的濃度為 橫坐標，繪制吸光度值-酪氨酸濃度標準曲線。
[0022] 酶活力測定：粗酶液用pH7. 5磷酸緩沖液稀釋適當?shù)谋稊?shù)，供測試用。將1%酪蛋 白溶液放入40°C恒溫水浴中預(yù)熱5min，然后按下述過程操作：①試驗組(需作3個平行試 驗):吸取lm稀釋的粗酶液加入試管，40°C水浴預(yù)熱2min，加1%酪蛋白溶液lmL搖勻，40°C 準確計時l〇min，加0. 4mol/L三氯乙酸2mL搖勻終止反應(yīng)，取出靜置10min，過濾，取lmL濾 液，加 〇? 4mol/LNa2C035mL，加 Folin-酌?試劑 lmL，40°C顯色 20min，于 680nm 波長，用 10mm 比色皿測其吸光度。②空白組：同試驗組，只是將酪蛋白溶液和三氯乙酸溶液的加入順序調(diào) 換。
[0023] 酶活力計算：酶活單位定義為lmL粗酶液在40°C條件下，lmin水解酪蛋白產(chǎn)生 1呢酪氨酸的酶量為一個酶活力單位（u)。發(fā)酵液蛋白酶活力（u/mL)=AXKX4n/10,式中， A-樣品平行試驗的平均吸光度；K一吸光常數(shù)；4一反應(yīng)液的總體積（mL) ;10-反應(yīng)時間 (min) ；n一粗酶液稀釋倍數(shù)。
[0024] 經(jīng)第二次復(fù)篩得到發(fā)酵液酶活在190u/mL以上的菌株8株，其中解淀粉芽孢桿菌 HP60的蛋白酶活力排列第2,達263±7.0u/m。
[0025] (6)第三次復(fù)篩： 選取上述蛋白酶活力在190u/mL以上的8株菌株發(fā)酵后離心，上清液沸水滅酶后測定 其中氨基酸態(tài)氮含量；所述上清液制備同第一次復(fù)篩上清液的制備。
[0026] 氨基酸態(tài)氮的測定：吸取5mL上述滅過酶的發(fā)酵上清液，置于100mL容量瓶中，蒸 饋水定容。然后吸取20mL置于200mL燒杯中，加60mL蒸饋水，開動磁力攪拌器，用0. 05mol/ LNaOH標準溶液滴定至酸度計指示pH=8. 2。再加入10mL甲醛溶液混勻，再用0. 05mol/LNa0H 標準溶液滴定至pH=9. 2,記下消耗0. 05mol/LNa0H標準溶液的毫升數(shù)。同時做試劑空白試 驗。
[0027] 氨基酸態(tài)氮計算：X=[(VrV2) ? CX0.014] X100/[5X (V3/100)] 式中：X-樣品中氨態(tài)氮的含量，g/100mL…一測定用樣品稀釋液加入甲醛溶液后消耗 NaOH標準溶液的體積，mL八一實際空白試驗加入甲醛溶液后消耗NaOH標準溶液的體積， mL ；V3一樣品稀釋液取用量，mL ;C -NaOH標準溶液的濃度，mol/L ;0. 014 -lmLlmol/LNaOH 標準溶液溶液相當于氮的g數(shù)。
[0028] 經(jīng)第三次復(fù)篩菌株HP60發(fā)酵液氨態(tài)氮明顯高于其他6株，排列第2,為 (17. 50±0. 35)mg/100mL，對應(yīng)米渣蛋白水解度分別為（15. 63±0. 30) %。
[0029] 菌株HP60的鑒定： 鑒定菌種的屬種，了解其基本的生理生化特征，對有效地利用已有文獻、指導(dǎo)進一步實 驗有著重要作用。為此，對解淀粉芽孢桿菌HP60菌株進行形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特征，16S rRNA及看家基因recA序列鑒定。
[0030] 形態(tài)特征：將菌種劃線接種于細菌完全培養(yǎng)基固體平板于30°C，培養(yǎng)18h。在細 菌完全培養(yǎng)基上解淀粉芽孢桿菌HP60菌落生長較快，菌落呈淡黃色，半透明，圓形或近圓 形，邊緣齊整，光滑半濕潤，稍隆起，菌落直徑1. 5?3. 5mm，不產(chǎn)生色素，粘稠、易挑取。取斜 面保存幼齡菌進行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下解淀粉芽孢桿菌HP60細胞形態(tài)為長、直桿 狀，革蘭氏染色呈紫色，為革蘭氏陽性桿菌。生理生化特征采用API 20NE、Biolog GP微生 物鑒定自動分析系統(tǒng)，生理生化結(jié)果見表1、表2。
[0031] 表1菌株HP60生理生化特征一碳源利用

【權(quán)利要求】
1. 一株水解米渣的蛋白酶產(chǎn)生菌一解淀粉芽孢桿菌，其特征在于該解淀粉芽孢桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens)菌株純培養(yǎng)物已于2014年5月13日保藏于武漢中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，簡稱解淀粉芽孢桿菌HP60,保藏單位地址：中國武漢?武漢大學(xué)430072， 保藏編號為 CCTCC NO. M 2014200。
2. 如權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌，其特征在于所述解淀粉芽孢桿菌HP60的 形態(tài)特征和生理生化特征接近芽孢桿菌屬，其16S rRNA序列與Genbank中已知Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42NC 009725.1 序列同源性在 99% 以上， 看家基因 recA 與 Bacillus amyloliquefaciens IT-45、Bacillus amyloliquefaciens LFB112等9株同源性達99% ;根據(jù)<伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊彡中芽孢桿菌屬的分類概況， HP60屬芽孢桿菌綱（Bacilli),芽孢桿菌目（Bacillales)，芽孢桿菌科（Bacillaceae)，芽 抱桿菌屬（Bacillus),解淀粉芽抱桿菌種（Baci llus amyloliquefaciens)。
3. 如權(quán)利要求1和2所述的解淀粉芽孢桿菌的篩選方法，其特征在于：先從豆豉采樣， 將樣品中的蛋白酶產(chǎn)生菌分別經(jīng)富集培養(yǎng)后，采用酪蛋白為底物，經(jīng)過富集培養(yǎng)后稀釋涂 布在酪蛋白平板選擇培養(yǎng)基上，以微生物分解酪蛋白的能力作為初篩指標，挑取具有透明 圈較大的菌落在酪蛋白平板上三區(qū)劃線純化，純化后的單菌落移接斜面培養(yǎng)基保存，從而 實現(xiàn)初篩；之后以米渣為底物，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，以微生物搖瓶發(fā)酵米渣，離心，上清液注酪蛋 白平板孔，恒溫培養(yǎng)，以平板孔直徑為指標第一次復(fù)篩；平板經(jīng)直徑較大的菌株再經(jīng)搖瓶發(fā) 酵米渣，離心后測上清液蛋白酶活力，以酶活為指標二次復(fù)篩；最后酶活較高的菌株發(fā)酵米 渣，離心，上清液沸水滅酶，測上清液中氨態(tài)氮，以氨態(tài)氮為指標第三次復(fù)篩。
4. 如權(quán)利要求3所述的篩選方法，其特征在于：富集培養(yǎng)基以g/100mL計的成分：牛肉 膏 0? 5 ?1. 0,蛋白胨 0? 5 ?1. 0,（NH4)2S040. 1 ?0? 2，K2HP040. 5 ?1. 0，MgS04.7H20 0? 01 ? 0? 02, CaCl20. 01 ?0? 02, NaClO. 5 ?1. 0,其 pH 6. 5 ?7. 5 ;酪蛋白選擇培養(yǎng)基以 g/100mL 計的成分：牛肉膏 〇? 5 ?1. 0,酪蛋白 0? 5 ?1. 0,（NH4)2S040. 1 ?0? 2, K2HP040. 5 ?1. 0， MgS04 ? 7H20 0? 01 ?0? 02, CaCl20. 01 ?0? 02, NaCl 0? 5 ?1. 0,瓊脂粉 2. 0,其 pH 6. 5 ? 7. 5 ;斜面保藏培養(yǎng)基細菌為細菌完全培養(yǎng)基，真菌為PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基同發(fā)酵培 養(yǎng)基以 g/l〇〇mL 計的成分：米渣 1. 2 ?1. 8, NaCl 0? 5 ?1. 0, MgS04 ? 7H20 0? 01 ?0? 02， CaCl20. 01 ?0? 02, K2HP040. 5 ?1. 0,其 pH 6. 5 ?7. 5。
5. 如權(quán)利要求1和2所述的解淀粉芽孢桿菌的使用方法，其特征在于：取斜面保藏菌 株解淀粉芽孢桿菌HP602環(huán)分別接于種子培養(yǎng)基中，于30°C、180r/min搖床培養(yǎng)24h后，以 6%?8%的接種量分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，同樣條件下?lián)u床培養(yǎng)24h，即用于米渣蛋白水 解。
6. 如權(quán)利要求5所述的使用方法，其特征在于：所述種子培養(yǎng)基的成分以g/100mL計 的成分為：米渣 1. 2 ?1. 8, NaCl 0? 5 ?1. 0, MgS04 ? 7H200. 01 ?0? 02, CaCl20. 01 ?0? 02， K2HP040. 5 ?1. 0,其 pH 6. 5 ?7. 5。
【文檔編號】C12N1/20GK104450554SQ201410475311
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】何臘平, 薛榮濤, 李翠芹 申請人:貴州大學(xué)