夠抑制肥大刺激因子所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，包括肥大指標(biāo)如細(xì)胞表面積，蛋白/DNA的比值及肌小節(jié)的重組也與對(duì)刺激組相比都有明顯的降低；在動(dòng)物水平通過(guò)注射外源PiRNA也能夠抑制肥大模型的肥大效應(yīng)包括心臟表型、心臟體重比、邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞橫截面積(WGA染色)和心肌纖維化(Masson染色)都有明顯的降低，同時(shí)心功能也有明顯的改善。
[0010]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其藥物組合物配方合理，藥理可靠，制作工藝簡(jiǎn)單，治療效果明顯，應(yīng)用范圍廣，使用環(huán)境友好。
【附圖說(shuō)明】
:
[0011]圖1為經(jīng)心臟肥大刺激因子PE (苯腎上腺素)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中PiRNA表達(dá)水平的變化；
[0012]圖2為經(jīng)piRNA反義核苷酸抑制劑轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞進(jìn)行心肌細(xì)胞肥大效應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果示意圖；
[0013]圖3為經(jīng)piRNA轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞進(jìn)行PE處理，在細(xì)胞水平上對(duì)PE所誘導(dǎo)的肥大的抑制情況；
[0014]圖4為小鼠靜脈注射piRNA能抑制PE所誘導(dǎo)的肥大模型的檢測(cè)結(jié)果示意圖?！揪唧w實(shí)施方式】:
[0015]下面通過(guò)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步闡述。
[0016]實(shí)施例1、
[0017]piRNA過(guò)表達(dá)腺病毒載體及陰性對(duì)照腺病毒構(gòu)建，本實(shí)施例采用人工合成piRNA序列，亞克隆連入Amb1n公司的pSi lencer Adeno 1.0-CMV系統(tǒng)，構(gòu)建piRNA過(guò)表達(dá)腺病毒。其 piRNA 序列如下列 SEQ ID NO:1 所示:5’ -UGGUAAACAAAUAAUCUGCGCAUGUGCCAA-3’ ；
[0018]按照公司說(shuō)明書(shū)步驟，將Pac I線性化的該載體與線性化的腺病毒骨架(AdenovirTs LacZ Backbone)共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，包裝腺病毒，擴(kuò)增收集病毒，測(cè)定病毒滴度；將空載體和腺病毒骨架按照上述步驟共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，包裝陰性對(duì)照腺病毒。
[0019]將上述所得的過(guò)表達(dá)piRNA的重組體腺病毒磷酸鹽緩沖液稀釋為感染滴度lxl016PFU/ml，按Iml量無(wú)菌分裝到安瓿瓶?jī)?nèi)，即得。
[0020]實(shí)施例2、
[0021]在PE刺激下P i RNA表達(dá)水平的變化，本實(shí)施例對(duì)于心肌細(xì)胞肥大模型，采用已建立的方法培養(yǎng)大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞(大鼠乳鼠購(gòu)自北京醫(yī)科大學(xué)，大鼠品系為Wistar，大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞的制備可參見(jiàn)以下文獻(xiàn):ff.-Q.Tan, etal, Foxo3aInhibits Card1myocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase J B1lChem.20080ctober 31 ；283(44): 29730-29739)，對(duì)心肌細(xì)胞用PE進(jìn)行處理，在培養(yǎng)的不同時(shí)間，提取細(xì)胞的總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)piRNA的表達(dá)水平。如圖1所示，大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞經(jīng)PE處理后piRNA隨時(shí)間的表達(dá)水平，縱坐標(biāo)表示以未處理的大鼠原代心肌細(xì)胞中PiRNA的表達(dá)水平為基準(zhǔn)，在PE處理過(guò)程中大鼠原代心肌細(xì)胞中piRNA的表達(dá)水平。piRNA表達(dá)水平在PE處理6小時(shí)之內(nèi)有顯著的下降。
[0022]實(shí)施例3、
[0023]piRNA反義核苷酸能夠在細(xì)胞水平上誘導(dǎo)的肥大，本實(shí)施例對(duì)原代心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染PiRNA反義核苷酸(anta-piRNA)后，能有效的抑制piRNA的表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞用anta-piRNA對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行處理，及同時(shí)用piRNA反義核苷酸的陰性對(duì)照(anta-NC)處理，經(jīng)過(guò)24小時(shí)之后，對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行心肌肥大指標(biāo)的檢測(cè)，如心肌細(xì)胞表面積(圖2A)、蛋白/DNA(圖2B)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明piRNA反義核苷酸能夠有效的誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。
[0024]實(shí)施例4、
[0025]piRNA能夠在細(xì)胞水平上抑制PE所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，本實(shí)施例對(duì)原代心肌細(xì)胞感染piRNA腺病毒后，用PE對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行處理，經(jīng)過(guò)處理24小時(shí)之后，對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行心肌肥大指標(biāo)的檢測(cè)，如心肌細(xì)胞表面積(圖3A)、蛋白/DNA(圖3B)檢測(cè)，如圖3所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明PiRNA能夠有效的抑制PE所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的肥大。
[0026]實(shí)施例5、
[0027]小鼠靜脈注射piRNA腺病毒能抑制PE所誘導(dǎo)的肥大模型，本實(shí)施例對(duì)小鼠用PE埋泵處理二周后，小鼠的心臟有明顯的肥大表型，而同時(shí)加入piRNA可以明顯減弱PE所誘導(dǎo)的肥大效應(yīng)包括心肌細(xì)胞的橫截面積大小(WGA染色)(如圖4A)及心臟體重比(如圖4B);同時(shí)向小鼠注射piRNA的陰性對(duì)照和PE，并不能減弱PE的肥大效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)PiRNA能夠在整體水平抑制PE所誘導(dǎo)的心臟肥大的發(fā)生。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種PiRNA藥物組合物，其特征在于PiRNA序列為:5’-UGGUAAACAAAUAAUCUGCGCAUGUGCCAA-3’ ；該藥物組合物包括感染滴度為116PFU過(guò)表達(dá)piRNA載體、病毒或輔料；所述載體為膽固醇、納米顆?；蛑|(zhì)體；病毒載體為腺病毒載體、慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的一種或多種；所述輔料為甘露醇、磷酸鹽緩沖液、生理鹽水中的一種或多種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種piRNA藥物組合物，其特征在于藥物劑型為口服制劑、注射制劑、片劑、干粉劑型中的一種或多種。
3.—種piRNA藥物組合物的用途，其特征在于通過(guò)口服或注射用于預(yù)防和治療心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病和心衰。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種piRNA藥物組合物及其用途，piRNA序列為：5’-UGGUAAACAAAUAAUCUGCGCAUGUGCCAA-3’；該藥物組合物包括感染滴度為1016PFU過(guò)表達(dá)piRNA載體、病毒或輔料；所述載體為膽固醇、納米顆?；蛑|(zhì)體；病毒載體為腺病毒載體、慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的一種或多種；所述輔料為甘露醇、磷酸鹽緩沖液、生理鹽水中的一種或多種。該藥物組合物用于預(yù)防和治療心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病和心衰，其配方合理，藥理可靠，制作工藝簡(jiǎn)單，治療效果明顯，應(yīng)用范圍廣，使用環(huán)境友好。
【IPC分類】A61K48-00, A61K31-7088, A61P9-04, A61P9-10
【公開(kāi)號(hào)】CN104548136
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510039653
【發(fā)明人】李培峰, 王昆, 周露玙, 趙兵, 趙文科
【申請(qǐng)人】青島大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月27日