一種葉酸受體靶向的干擾Claudin3 基因表達的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種葉酸受體靶向的干擾Claudin3基因表達的 藥物組合物及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是當今世界各國面臨的一個主要的公共健康難題。在發(fā)達國家，癌癥是人口 死亡的首要原因；而在發(fā)展中國家，癌癥也是引起人口死亡的第二位原因。據(jù)最新癌癥統(tǒng)計 學(xué)數(shù)據(jù)，全球癌癥患者每年新發(fā)病例1266萬，死亡病例756萬。在發(fā)達國家如美國，每年癌 癥新發(fā)病例約166萬，因癌癥死亡約58萬，每4人中就有1人死于癌癥。據(jù)《2012中國腫 瘤登記年報》，我國每年新發(fā)癌癥病例約350萬，因癌癥死亡約250萬，全國每6分鐘就有1 人被確證為癌癥，每天有8550人成為癌癥患者，每7到8人中就有1人死于癌癥。
[0003] 雖然在過去的近20?30年間，傳統(tǒng)治療手段包括放射治療、化學(xué)治療和手術(shù)治 療不斷發(fā)展，但是新的治療藥物以及新技術(shù)的應(yīng)用依舊未能改進癌癥患者生存質(zhì)量和存活 率。因此，新的治療手段--基因治療--的開發(fā)可能改變癌癥的治療現(xiàn)狀。截止目前，腫 瘤基因治療臨床試驗已開展近20年，仍在開放的臨床試驗829例，占整個基因治療臨床試 驗的 66. 85% (829/1240)。
[0004] Claudins家族是上皮細胞間緊密連接的骨架蛋白，參與緊密連接的構(gòu)成，緊密連 接有維持細胞極向排列和屏障功能，其表達異常而導(dǎo)致緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的破壞是許多 疾病的病例基礎(chǔ)。研究表明，多種上皮來源的腫瘤中Claudins家族異常表達，并與這些 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，在診斷、治療以及預(yù)后的判斷等方面有廣泛的應(yīng)用前景，因此 Claudins家族成為腫瘤研究的新熱點。Claudin3是Claudins家族的一員，分子量為22kDa， 其基因定位于人染色體7qll. 23,正常表達于導(dǎo)管上皮和腺泡上皮的連接中。近年研究發(fā) 現(xiàn)，Claudin3在多種腫瘤包括卵巢癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、子宮癌、腦癌、 肝癌、肺癌、頭頸部癌以及結(jié)直腸癌等異常高表達，在腫瘤的生長、增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移等方面 都具有重要作用，并且與病人的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，Claudin3是腫瘤治療的一個重 要靶點。研究發(fā)現(xiàn)，利用RNA干擾技術(shù)（RNAi)干擾Claudin：3的表達，能夠抑制多種腫瘤的 生長，抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。但是由于已有的RNAi缺乏腫瘤選擇性，Claudin3干擾 效率低，抗腫瘤的療效有待提高，因此亟待開發(fā)新型的RNAi靶向傳遞系統(tǒng)。
[0005] 文獻報道，多種上皮來源的腫瘤包括卵巢癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、宮頸 癌、腦癌、肺癌、頭頸部癌以及結(jié)直腸癌等都有葉酸受體的高表達。利用可靶向腫瘤細胞表 面高表達的葉酸受體成分投遞藥物，可以實現(xiàn)腫瘤選擇性的靶向給藥，提高藥物的抗腫瘤 效果。
[0006] 發(fā)明人擬構(gòu)建一種葉酸受體靶向的干擾Claudin3基因表達的藥物組合物，利用 可靶向腫瘤細胞表面高表達的葉酸受體成分，將干擾Claudin3基因表達的RNA序列選擇性 投遞到腫瘤部位，提高Claudin3的干擾效率，使其具有較好的抗腫瘤效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種葉酸受體靶向的干擾Claudin3基因表達的 藥物組合物，目的在于提高Claudin3的干擾效率，從而提高抗腫瘤效果。
[0008] 該藥物組合物含有葉酸受體靶向成分和干擾Claudin3基因表達的RNA序列，可添 加其他藥學(xué)上可接受的成分，也可不添加其他成分。
[0009] 該藥物組合物中的葉酸受體靶向成分包括但不限于葉酸受體的抗體、葉酸、葉酸 衍生物、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤衍生物。其中，葉酸受體的抗體包括但不限于單克隆抗體、多克 隆抗體和人源化抗體中的一種或多種，例如：Farletuzumab (M0RAb-003)或其他公開的葉 酸受體的抗體；葉酸衍生物包括但不限于四氫葉酸、5-甲基四氫葉酸、5, 10-亞甲基四氫葉 酸、5-甲酰四氫葉酸、10-甲酰四氫葉酸、5, 10-二脫氮四氫葉酸中的一種或多種。
[0010] 該藥物組合物中的干擾Claudin3基因表達的RNA序列是針對Claudin3基因的 mRNA堿基序列設(shè)計的，可以是單鏈RNA，也可以是雙鏈RNA ;具體的干擾序列可以承載于 miRNA、siRNA、shRNA等RNA干擾（RNAi)分子結(jié)構(gòu)中。RNAi可以不用載體，直接與葉酸受體 靶向成分形成組合物；也可選擇性構(gòu)建在包括但不限于質(zhì)粒、病毒、噬菌體、脂質(zhì)體、膠束、 納米粒在內(nèi)的一種載體或幾種載體中。其中，病毒包括但不限于腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病 毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、溶瘤病毒中一種或多種。
[0011] 該藥物組合物中葉酸受體靶向成分與干擾Claudin3基因表達的RNA序列的組裝 方式包括但不限于以下方式中的一種或多種：葉酸受體靶向成分直接與RNAi偶聯(lián)，或葉酸 受體靶向成分修飾在RNAi載體的表面。
[0012] 具體地，利用RNA干擾序列設(shè)計軟件，例如利用Invitrogen公司BLOCK-iT ? RNAi Designer 在線設(shè)計軟件（http ://rnaidesigner. invitrogen. com/rnaiexpress/)或 其他在線設(shè)計軟件（http://sidirect2. rnai. jp/)設(shè)計干擾Claudin3基因表達的RNA序 列，再與GeneBank序列比較，設(shè)計序列不能與人體其他任何mRNA存在同源性。利用上述 方法，已設(shè)計獲得了兩個RNAi序列，且證實基因沉默效果較好，編號為SEQl和SEQ2。SEQl 的正義鏈為：GCAACAUCAU CACGUCGCAT T，反義鏈為：UGCGACGUGA UGAUGUUGCT T。SEQ2 的 正義鏈為：TCCCGCAACA TCATCACGTC GCATTCAAGA CGTGCGACGT GATGATGTTG CTTTTTTG，反 義鏈為：AGCTCAAAAA AGCAACATCA TCACGTCGCA CGTCTTGAAT GCGACGTGAT GATGTTGC。干擾 Claudin3基因表達的RNA序列，可以是通過上述原則設(shè)計的其他任何序列，并不限于以上 所列的RNAi具體序列。
[0013] RNAi直接全身給藥，存在穩(wěn)定性差，體內(nèi)半衰期短的缺點；因此，優(yōu)選化學(xué)修飾的 RNAi，包括正義鏈和反義鏈的3'端以及正義鏈的5'端進行封端反應(yīng)或化學(xué)基團修飾、正義 鏈和反義鏈的第2個堿基引入一個小的疏水基團進行修飾（如2' -OMe修飾）或在siRNA 的兩條鏈上引入硫代磷酸基團而增加其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。RNAi的化學(xué)修飾可選擇任何能增加其 穩(wěn)定性的方式，并不限于以上所列的具體方式。
[0014] RNAi可直接與葉酸受體靶向成分偶聯(lián)形成組合物。具體地，RNAi的羥基可與葉 酸受體靶向成分包括葉酸受體的抗體、葉酸及其衍生物、甲氨蝶呤及其衍生物的羧基直接 偶聯(lián)，形成酯化復(fù)合物?；蛘撸琑NAi還可通過一定的間隔基與葉酸受體靶向成分連接；具體 地，葉酸受體靶向成分可先與生物素偶聯(lián)，再加入鏈霉親和素和RNAi，即形成RNAi與葉酸 受體靶向成分的組合物。RNAi與葉酸受體靶向成分直接偶聯(lián)形成組合物的方法，可包括多 種其他任何能讓二者相連的方法，并不限于以上所列方法。
[0015] 干擾Claudin3基因表達的RNA序列可以不用載體，也可以構(gòu)建于質(zhì)粒、病毒、噬菌 體在內(nèi)的一種載體，分別記為RNAi-質(zhì)粒、RNAi-病毒、RNAi-噬菌體。其中，病毒包括但不 限于腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、溶瘤病毒中一種或多種。具體構(gòu)建方法為常 規(guī)方法，具體參照分子克隆實驗室指南(第三版，科學(xué)出版社，2002)中所述方法，或者按照 所用試劑盒的生產(chǎn)廠商所建議的條件。由于siRNA大量定制價格高、周期長，故本發(fā)明優(yōu)選 采用可大量擴增或生產(chǎn)的質(zhì)粒、病毒、噬菌體表達載體。具體的質(zhì)粒、病毒、噬菌體表達載體 可以是商品化的載體也可以是構(gòu)建的新型載體。
[0016] 干擾Claudin3基因表達的RNA序列也可以構(gòu)建于脂質(zhì)體、膠束、納米粒在內(nèi)的一 種載體或多種載體中。具體裝載方式為：脂質(zhì)體、膠束或納米粒靜電吸附、物理包裹中的 一種或多種直接轉(zhuǎn)載RNAi。具體地，脂質(zhì)體選自陽離子脂質(zhì)體、中性脂質(zhì)體、陰性脂質(zhì)體； 膠束載體材料可選用商品化的輔料如泊洛沙姆、磷脂等，或者文獻已經(jīng)報道的載體如PEG 與聚酯類的嵌段共聚物（包括：PEG-PCL、PEG-PLA、PEG-PLGA、PEG-PCL-PEG、PEG-PLA-PEG、 PEG-PLGA-PEG、PCL-PEG-PCL、PLA-PEG-PLA、PLGA- PEG-PLGA)，或者新設(shè)計合成的聚合 物載體，或新設(shè)計的載體以及內(nèi)源性成分的衍生物中的一種或幾種；納米粒載體材料可 選用商品化的輔料如PLGA、PLA、殼聚糖、透明質(zhì)酸、PEI等，或者文獻已經(jīng)報道的載體如 PLGA、PLA、殼聚糖、透明質(zhì)酸或PEI的衍生物，或者PEG與聚酯類的嵌段共聚物(包括： PEG-PCL、PEG-PLA、PEG-PLGA、PEG-PCL-PEG、PEG-PLA-PEG、PEG-PLGA-PEG、PCL-PEG-PCL、 PLA-PEG-PLA、PLGA- PEG-PLGA)，或者新設(shè)計合成的聚合物載體，或新設(shè)計的載體以及內(nèi)源 性成分的衍生物中的一種或幾種。
[0017] 干擾Claudin3基因表達的RNAi-質(zhì)粒、RNAi-病毒、RNAi-噬菌體中的一種也可 進一步構(gòu)建于脂質(zhì)體、膠束、納米粒在內(nèi)的一種載體或多種載體中，形成復(fù)合載體。具體地， 通過靜電吸附、物理包裹中的一種或多種機制，RNAi-質(zhì)粒、RNAi-病毒或RNAi-噬菌體中 的一種可裝載在脂質(zhì)體、膠束、納米粒在內(nèi)的一種載體或多種載體中，形成RNAi-質(zhì)粒/脂 質(zhì)體、RNAi-質(zhì)粒/膠束、RNAi-質(zhì)粒/納米粒，或RNAi-病毒/脂質(zhì)體、RNAi-病毒/膠束、 RNAi-病毒/納米粒，或RNAi-噬菌體/脂質(zhì)體、RNAi-噬菌體/膠束、RNAi-噬菌體/納米 粒，或RNAi-質(zhì)粒/膠束/脂質(zhì)體、RNAi-質(zhì)粒/納米/脂質(zhì)體、RNAi-病毒/膠束/脂質(zhì) 體、RNAi-病毒/納米/脂質(zhì)體、RNAi-噬菌體/膠束/脂質(zhì)體、RNAi-噬菌體/納米/脂質(zhì) 體。
[0018] 干擾Claudin3基因表達的RNAi-質(zhì)粒、RNAi-病毒、RNAi-噬菌體中的兩種或3種 還可進一步構(gòu)建于脂質(zhì)體、膠束、納米粒在內(nèi)的一種載體或多種載體中，形成復(fù)合載體。具 體地，RNAi-質(zhì)粒、RNAi-病毒或RNAi-噬菌體中的兩種或3種也可通過靜電吸附、物理包裹 中的一種或多種機制，裝載于脂質(zhì)體、膠束、納米粒在內(nèi)的一種載體或多種載體中，RNAi-質(zhì) 粒和RNAi-病毒兩種組合裝載于脂質(zhì)體、膠束、納米粒在內(nèi)的一種載體或多種載體中時， 具體就包括以下制劑=RNAi-質(zhì)粒/RNAi-病毒/脂質(zhì)體、RNAi-質(zhì)粒/RNAi-病毒/膠束、 RNAi-質(zhì)粒/RNAi-病毒/納米粒，或