專利名稱：葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米金顆粒，特別涉及葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法。
技術(shù)背景
近年來，生物大分子越來越多地被作為還原劑用于制備納米金顆粒(納米金顆粒 可簡寫為GNPs)，包括糖、蛋白、核酸等均有報道。生物大分子制備出的納米金顆粒具備生物 功能化的特點，易于與生物應(yīng)用相結(jié)合，其制備過程通常是無毒的。Wang等([l]Li G P,Li D, ZhangL X, Zhai J F, Wang E K, One-Step Synthesis of Folic Acid Protected Gold Nanoparticles and TheirReceptor-Mediated Intracellular Uptake[J]Chem. Eur. J., 2009,15 :9868-9873)報道了一種在溫和條件下，以葉酸為還原劑制備納米金顆粒，并且證 實制備出的納米金顆粒對葉酸受體高表達的細胞具有靶向性。這種方法雖然具備合成條 件較為溫和，制備的納米金生物相容性較好等優(yōu)點，但是顆粒的形貌不夠規(guī)整，粒徑不夠均 一，制備用時較長。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法，葉酸受體靶 向型納米金顆?？珊唽憺镕A-GNPs。
本發(fā)明包括以下步驟
1)往HAuCl4溶液中加入葉酸溶液，混勻后再加入NaOH溶液，得溶液A ；
2)將溶液A進行微波反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻，透析除去未反應(yīng)的小分子，即得葉酸 受體靶向型納米金顆粒。
在步驟1)中，所述HAuC14、葉酸與NaOH的質(zhì)量比可為100 (6 10) (80 120)；所述HAuCl4溶液的摩爾濃度可為0. 8 1. 2mmol/L,最好為lmmol/L ；所述NaOH溶 液的摩爾濃度可為6 lOmmol/L，最好為8mmol/L ；所述葉酸溶液的摩爾濃度可為0. 1 0. 3mmol/L，最好為 0. 2mmol/L。
在步驟2)中，所述微波反應(yīng)的條件可為將溶液A密封，反應(yīng)溫度為100 120°C， 反應(yīng)時間為90 150min，攪拌速度為1000 1200r/min ；所述透析的時間可為12 16h。
本發(fā)明直接以葉酸為還原劑，利用微波法快速制備出粒徑均勻、分散性較好的葉 酸受體靶向型納米金顆粒。通過透射電子顯微鏡和紫外可見分光光度計，以及采用動態(tài)光 散射、傅立葉紅外光譜、X射線光電子能譜和X射線衍射(XRD)等手段對FA-Gws進行表征， 通過WST-I細胞毒性實驗分析FA-GNPs的細胞相容性，利用電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS) 測定HeLa細胞對FA-GNPs的攝取量，證實，合成的的FA-GNPs能夠特異性地識別表面有高 水平葉酸受體表達的腫瘤細胞，具有良好的靶向性。表明其具有良好的細胞相容性，并且能 夠特異性地識別表面有高水平葉酸受體表達的細胞，在腫瘤細胞檢測中具有廣泛的應(yīng)用。
本發(fā)明與傳統(tǒng)納米金顆粒的合成方法相比，具有以下優(yōu)勢
1)所合成的葉酸受體靶向型納米金顆粒表面包裹一層葉酸，可增強金納米顆粒的穩(wěn)定性。
2)所合成的葉酸受體靶向型納米金顆粒具備良好的細胞相容性。
3)所合成的葉酸受體靶向型納米金顆粒具有良好的細胞靶向性，可用于癌細胞的 檢測等。


圖1為FA-GNPs的紫外吸收光譜圖。在圖1中，橫坐標為波長(nm)，縱坐標為吸光 度；紫外光譜檢測結(jié)果表明其最大吸收峰在529nm。
圖2為FA-GNPs的透射電鏡圖。在圖2中，標尺為20nm。
圖3為FA-GNPs和葉酸的紅外光譜圖。在圖3中，橫坐標為波數(shù)(cnT1)，縱坐標為 透光率(％)；曲線a為FA-GNPs的紅外光譜圖，曲線b為葉酸的紅外光譜圖。
圖4為FA-GNPs的Au 4f的X射線光譜圖。在圖4中，橫坐標為結(jié)合能(eV)，縱坐 標為脈沖計數(shù)；結(jié)合能在80 90eV代表Au 4f的信號峰；Au 4f5/2和Au 4f7/2的結(jié)合能 在87. 5eV and84. OeV，這是由于Au所決定的，說明葉酸成功的將HAuC14中的Au3+還原為 Au0o
圖5為FA-GNPs的Cls的X射線光譜圖。在圖5中，橫坐標為結(jié)合能(eV)，縱坐標為 脈沖計數(shù)；結(jié)合能在280 290eV代表Cls的信號峰；Cls譜在結(jié)合能為觀1. 5和四1. 4eV的 范圍內(nèi)有很寬的信號峰，以Cls在結(jié)合能為觀4. 2eV的位置為標準，該信號峰可分為觀4. 8 及^SJeV 2個峰，分別代表-C-C-和-COOH等基團。經(jīng)過分析，顆粒表面含有的N元素應(yīng) 來源于葉酸。
圖6為FA-GNPs的Nls的X射線光譜圖。在圖6中，橫坐標為結(jié)合能(eV)，縱坐標 為脈沖計數(shù)；結(jié)合能在395 405eV代表Ws的信號峰；Nls譜能夠被分為2個峰，分別在 398. 3eV和400. IeV,該結(jié)合能的位置分別代表-NH2和-NHCO中的N。
圖7為FA-GNPs的01 s的X射線光譜圖。在圖7中，橫坐標為結(jié)合能(eV)，縱坐標 為脈沖計數(shù)；結(jié)合能在5 538eV代表Ols的信號峰；Ols在結(jié)合能位置為531. 45eV的 寬峰，也可被分為3個不同的峰，其中結(jié)合能在534. 6eV位置的由C-O形成的。
圖8為FA-GNPs的X射線衍射圖譜。在圖8中，橫坐標為衍射角2Theta (Degree)， 縱坐標為強度；圖中出現(xiàn)了位于38. 2°，44. 6°，64. 7°，77. 5°和82. 4°處的衍射峰，分 別對應(yīng)于面心立方金的(111)、(200)、(220)、(311)和(22 晶面，沒有任何其它雜質(zhì)峰，表 明納米粒子為純凈的金晶體。(111)晶面與(200)晶面的衍射強度之比約為2. 86，與JCPDS No. 089-3697標準卡片中的比值2. 20相比明顯偏高，說明(111)為產(chǎn)物的主導(dǎo)晶面，晶體沿 (111)晶面生長。X射線衍射結(jié)果說明制備出的FA-GWs為面心立方體晶型結(jié)構(gòu)。
圖9為不同濃度的FA-GNPs與HeLa細胞共培養(yǎng)12h、24h、3Mi后HeLa細胞的存活 情況圖。在圖9中，橫坐標為濃度(g/mL)，縱坐標為細胞存活率(％) ； ■為12h時的HeLa 細胞的存活情況， 為24h時的HeLa細胞的存活情況，▲為3 時的HeLa細胞的存活情況。
圖10為HeLa細胞單細胞內(nèi)部攝取FA-GNPs和GNPs隨著時間增長的變化圖。在 圖10中，橫坐標為孵育時間(h)，縱坐標為金納米顆粒的濃度(pg/cell) ；■為FA-GNPs，· 為 GNI3Stj
圖11為FA-GNPs與GNPs與HeLa細胞共培養(yǎng)池后的HeLa細胞單細胞內(nèi)部攝取FA-GM^s和GMps量隨著體系中葉酸含量增加的變化圖。在圖11中，橫坐標為葉酸濃度 (mmol/L)，縱坐標為金納米顆粒的濃度(pg/cell) ； ■為FA-GNPs，·為GNPs。
圖12為利用FA-GNPs對葉酸受體高表達的HeLa細胞的檢測結(jié)果圖。在圖12中， 橫坐標為細胞濃度(Cells/mL)，縱坐標為吸光度的變化值ΔΑ ；■為HeLa細胞， 為成纖維 細胞，▲為不含細胞的PBS緩沖液。
具體實施方式
實施例1
取一潔凈20mL燒杯，加入IOmL lmmol/L HAuCl4溶液，室溫下不斷攪拌混勻，向溶 液中逐滴加ImL lmmol/L葉酸溶液，使HAuCl4與葉酸的質(zhì)量比值為100 10，再往其中加 入40 μ 1 lmol/L的NaOH溶液，直至溶液呈橙黃色清亮態(tài)，室溫攪拌混勻30min，立即轉(zhuǎn)入微 波反應(yīng)瓶中，密封，微波反應(yīng)條件為100°C，120min，攪拌速度為1200r/min。反應(yīng)后取出反 應(yīng)瓶，自然冷卻至室溫，透析12h，以除去未反應(yīng)的小分子，將制備好的樣品放入4°C的冰箱 中保存。
實施例2
取一潔凈20mL燒杯，加入IOmL lmmol/L HAuCl4溶液，室溫下不斷攪拌混勻，向溶 液中逐滴加0.9mL lmmol/L葉酸溶液，使HAuCl4與葉酸的質(zhì)量比值為100 9，再向其中加 入40 μ 1 lmol/L的NaOH溶液，直至溶液呈橙黃色清亮態(tài)，室溫攪拌混勻30min，立即轉(zhuǎn)入 微波反應(yīng)瓶中，密封，微波反應(yīng)條件為100°C，120min，攪拌速度為1200r/min。反應(yīng)后取出 反應(yīng)瓶，自然冷卻至室溫，透析12h，以除去未反應(yīng)的小分子，即得葉酸受體靶向型納米金顆 粒，將制備好的樣品放入4°C的冰箱中保存。
實施例3
取一潔凈20mL燒杯，加入IOmL lmmol/L HAuCl4溶液，室溫下不斷攪拌混勻，向溶 液中逐滴加0.8mL lmmol/L葉酸溶液，使HAuCl4與葉酸的質(zhì)量比值為100 8，再向其中 加入40μ llmol/L的NaOH溶液，直至溶液呈橙黃色清亮態(tài)，室溫攪拌混勻30min，立即轉(zhuǎn)入 微波反應(yīng)瓶中，密封，微波反應(yīng)條件為100°C，120min，攪拌速度為1200r/min。反應(yīng)后取出 反應(yīng)瓶，自然冷卻至室溫，透析12h，以除去未反應(yīng)的小分子，即得葉酸受體靶向型納米金顆 粒，將制備好的樣品放入4°C的冰箱中保存。
實施例4
取一潔凈20mL燒杯，加入IOmL lmmol/L HAuCl4溶液，室溫下不斷攪拌混勻，向溶 液中逐滴加0.6mL lmmol/L葉酸溶液，，使HAuCl4與葉酸的質(zhì)量比值為100 6，再向其中 加入40μ 1 lmol/L的NaOH溶液，直至溶液呈橙黃色清亮態(tài)，室溫攪拌混勻30min，立即轉(zhuǎn)入 微波反應(yīng)瓶中，密封，微波反應(yīng)條件為100°C，120min，攪拌速度為1200r/min。反應(yīng)后取出 反應(yīng)瓶，自然冷卻至室溫，透析12h，以除去未反應(yīng)的小分子，將制備好的樣品放入4°C的冰 箱中保存。
實施例5
取一潔凈20mL燒杯，加入IOmL lmmol/L HAuCl4溶液，室溫下不斷攪拌混勻，向溶 液中逐滴加0.4mL lmmol/L葉酸溶液，使葉酸與HAuCl4物質(zhì)的量的比值為0.04 1，后向 其中加入40μ 1 lmol/L的NaOH溶液，直至溶液呈橙黃色清亮態(tài)，室溫攪拌混勻15min，立即轉(zhuǎn)入微波反應(yīng)瓶中，密封，微波反應(yīng)條件為100°C，120min，攪拌速度為1200r/min。反應(yīng)后 取出反應(yīng)瓶，自然冷卻至室溫，透析12h，以除去未反應(yīng)的小分子，將制備好的樣品放入4°C 的冰箱中保存。
實施例6
按照細胞培養(yǎng)的常規(guī)方法培養(yǎng)Hela細胞和成纖維細胞的培養(yǎng)，分別取對數(shù)生長 期的Hela細胞和成纖維細胞，用0. 25%胰蛋白酶0. 02% EDTA消化液消化5min，添加PBS 調(diào)整細胞密度為1. 5X IO6個/ml，然后分別用PBS進行稀釋調(diào)整細胞量，待檢測。
實施例7
通過透射電子顯微鏡、紫外可見分光光度計、動態(tài)光散射、傅立葉紅外光譜、X射線 光電子能譜以及X射線衍射(XRD)對FA-Gws進行表征，分析討論了葉酸濃度、HAuCl4濃 度、PH值以及反應(yīng)時間等實驗條件對FA-GNPs制備的影響以及分析葉酸與葉酸受體靶向型 納米金顆粒表面的結(jié)合方式。通過WST-I細胞毒性實驗分析FA-GM^s的細胞相容性。利用 電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS)測定HeLa細胞對FA-GNI3s的攝取量，證實合成的的FA-GNPs 能夠特異性地識別表面有高水平葉酸受體表達的腫瘤細胞，具有良好的靶向性。表明其具 有良好的細胞相容性，并且能夠特異性地識別表面有高水平葉酸受體表達的細胞，在腫瘤 細胞檢測中具有廣泛的應(yīng)用。
紫外光譜檢測結(jié)果表明其最大吸收峰在529nm(參見圖1)，且特征吸收峰較尖銳。 特征峰越窄，粒徑分布越均勻。所制備的FA-GNPs顏色為酒紅色，在室溫下長時間放置仍然 能夠穩(wěn)定存在。制備出的葉酸受體靶向型納米金顆粒分散性良好(參見圖幻，呈球型結(jié)構(gòu)， 粒徑比較均一，顆粒表面可以看到一些層狀物，經(jīng)過測定，其粒徑為15士5nm。
紅外光譜結(jié)果表明(參見圖3)，F(xiàn)A-GNPs中由于寬峰的存在，不能詳細的區(qū)分出 FA-GNPs中葉酸所對應(yīng)的在3550CHT1處的羥基、3430CHT1處氨基以及在3325CHT1處的二位 氨基，但是其芳香環(huán)中的1510CHT1的CH以及3個C = C伸縮峰也比較明顯。在1300 IOOOcm-1區(qū)域的峰則是由于葉酸分子中C-O鍵的伸縮振動以及O-H鍵的彎曲振動引起的， 另夕卜，葉酸在1699CHT1和16(Mcm 1處最主要特征峰在FA-GNPs中也很明顯的存在。這就進 一步說明在金納米顆粒的表面存在有葉酸分子，這一結(jié)果與王爾康等(見參考文獻[1])的 結(jié)果也相一致。根據(jù)報道，葉酸受體靶向型納米金顆粒既能夠與氨基相互作用，也可以與羧 基相互作用，而葉酸分子中既含有氨基，又含有羧基，因此，這就為葉酸分子能夠結(jié)合在葉 酸受體靶向型納米金顆粒的表面提供了理論依據(jù)。
FA-GNPs的X射線衍射結(jié)果(參見圖4 8)表明
圖4中Au 4f5/2和Au 4f7/2的結(jié)合能在87. 5eV and 84. OeV，這是由于Au所決 定的，說明葉酸成功的將HAuC14中的Au3+還原為Au°。
圖5中的Cls譜在結(jié)合能為觀1. 5和四1. 4eV的范圍內(nèi)有很寬的信號峰，以Cls 在結(jié)合能為觀4. 2eV的位置為標準，該信號峰可分為觀4. 8及觀8. 2eV 2個峰，分別代 表-C-C-和-COOH等基團。
經(jīng)過分析，顆粒表面含有的N元素應(yīng)來源于和葉酸，圖6中的Nls譜能夠被分為2 個峰，分別在398. 3eV和400. IeV,該結(jié)合能的位置分別代表-NH2和-NHCO中的N。
圖7中的Ols在結(jié)合能位置為531. 45eV的寬峰，也可被分為3個不同的峰，其中 結(jié)合能在534. 6eV位置由C-O形成。
圖8中出現(xiàn)了位于38. 2°，44. 6° ,64. 7° ,77. 5°和82. 4°處的衍射峰，分別對 應(yīng)于面心立方金的(111)、(200), (220)、(311)和(222)晶面，沒有任何其它雜質(zhì)峰，表明 納米粒子為純凈的金晶體。(111)晶面與(200)晶面的衍射強度之比約為2. 86，與JCPDS No. 089-3697標準卡片中的比值2. 20相比明顯偏高，說明(111)為產(chǎn)物的主導(dǎo)晶面，晶體沿 (111)晶面生長。X射線衍射結(jié)果說明制備出的FA-GWs為面心立方體晶型結(jié)構(gòu)。
取96孔培養(yǎng)板，在孔中接種對數(shù)生長期HeLa細胞，于37°C，5% CO2細胞培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)12h后加入濃度為lOnmol/L的FA-GNPs溶液，對照組為完全培養(yǎng)基，分別進行培 養(yǎng)ia!、24h、3^!后，每孔加入10 μ IffST-I溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育池后，選擇測量波長 450nm,參考波長630nm，在酶標儀上測定各孔的光吸收值(0D值)。重復(fù)實驗5次，取平均 值。根據(jù)公式細胞相對存活率=OD測定值/OD對照值X 100%。加入不同濃度的葉酸受 體靶向型納米金顆粒的細胞存活情況與沒有加入葉酸受體靶向型納米金顆粒的細胞存活 情況沒有明顯差別，且在增大葉酸受體靶向型納米金顆粒濃度后，一定范圍內(nèi)細胞依然表 現(xiàn)出良好的存活率，表明葉酸受體靶向型納米金顆粒具有良好的細胞相容性(參見圖9)。
取6孔培養(yǎng)板，在孔中接種對數(shù)生長期HeLa細胞，于37°C，5% C02細胞培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)12h后加入濃度為lOnmol/L的FA-GNPs溶液，對照組為lOnmol/L的GNPs溶液，分 別進行共培養(yǎng)lh、ai、3h、4h、5h，用PBS沖洗2次，胰酶消化收集細胞，后用新配制的王水 (HCI-HNO3)將細胞消解，將消解后的溶液稀釋配置成IOOmL的溶液，用電感耦合等離子體質(zhì) 譜進行定量測定(參見圖10)。
實施例8
1)分別取對數(shù)生長期的HeLa細胞和成纖維細胞，用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化液消化5min，添加PBS調(diào)整細胞密度為1. 5 X IO6個/mL，然后，分別利用PBS進行 稀釋調(diào)整細胞量，待檢測。
2)取一定量的FA-GNPs溶液置于離心管中，向其中加入不同濃度的HeLa細胞懸 液，輕微震蕩混勻后，在37°C的條件下，孵育30 60min。
3)然后將孵育完成的離心管收集，以轉(zhuǎn)速為IOOOrpm離心5min，收集上清液，用紫 外可見分光光譜來進行表征，記錄不同濃度條件下，529nm處的吸光值。對照組為相同濃度 梯度的成纖維細胞，空白組為含有FA-GNPs的PBS溶液，未加細胞，每組實驗重復(fù)5次。計 算FA-GNPs溶液離心后與離心前在529nm處的吸光度的變化值(Δ A)，S卩Δ A = Α0-Α1 (AO =空白組吸光度，Al =離心后上清液的吸光度)(參見圖12)。
權(quán)利要求
1.葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法，其特征在于包括以下步驟1)往HAuCl4溶液中加入葉酸溶液，混勻后加入NaOH溶液，得溶液A；2)將溶液A進行微波反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻，透析除去未反應(yīng)的小分子，即得葉酸受體 靶向型納米金顆粒。
2.如權(quán)利要求1所述葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法，其特征在于在步驟1) 中，所述HAuC14、葉酸與NaOH的質(zhì)量比為100 (6 10) (80 120)。
3.如權(quán)利要求1所述葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法，其特征在于在步驟1) 中，所述HAuCl4溶液的摩爾濃度為0. 8 1. 2mmol/L。
4.如權(quán)利要求1所述葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法，其特征在于在步驟1) 中，所述HAuCl4溶液的摩爾濃度為lmmol/L。
5.如權(quán)利要求1所述葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法，其特征在于在步驟1) 中，所述NaOH溶液的摩爾濃度為6 10mmol/L。
6.如權(quán)利要求1所述葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法，其特征在于在步驟1) 中，所述NaOH溶液的摩爾濃度為8mmol/L。
7.如權(quán)利要求1所述葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法，其特征在于在步驟1) 中，所述葉酸溶液的摩爾濃度為0. 1 0. 3mmol/L。
8.如權(quán)利要求1所述葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法，其特征在于在步驟1) 中，所述葉酸溶液的摩爾濃度為0. 2mmol/L。
9.如權(quán)利要求1所述葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法，其特征在于在步驟2) 中，所述微波反應(yīng)的條件為將溶液A密封，反應(yīng)溫度為100°C 120°C，反應(yīng)時間為90 150min，攪拌速度為 1000 1200r/min。
10.如權(quán)利要求1所述葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法，其特征在于在步驟2) 中，所述透析的時間為12 16h。
全文摘要
葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法。涉及納米金顆粒，提供葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法。往HAuCl4溶液中加入葉酸溶液，混勻后加入NaOH溶液，混勻得溶液A；將溶液A進行微波反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻，透析除去未反應(yīng)的小分子，即得葉酸受體靶向型納米金顆粒。合成的葉酸受體靶向型納米金顆粒能夠特異性地識別表面有高水平葉酸受體表達的腫瘤細胞，具有良好的靶向性和細胞相容性，并且能夠特異性地識別表面有高水平葉酸受體表達的細胞，在腫瘤細胞檢測中具有廣泛的應(yīng)用。
文檔編號B82Y40/00GK102029401SQ20101056731
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者孫莉萍, 張召武, 賈靜, 賴友群, 馬燕燕 申請人:廈門大學(xué)