用于葉酸過表達癌細胞快速檢測的比色方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種葉酸過表達癌細胞快速檢測的方法。將金納米顆粒與不同比例的K2PtCl6和H2PdCl4混合制備出Au@PtPd納米材料；利用6-巰基-己醇和疊氮-11-烷基-硫醇對Au@PtPd納米粒子表面修飾，通過點擊化學技術(shù)與炔基化的葉酸進行偶合；葉酸受體靶向的Au@PtPd納米材料與癌細胞進行孵育，連接于細胞表面，Au@PtPd納米材料能夠催化過氧化氫氧化顯色劑發(fā)生顏色變化，將其溶液低于色譜紙親水區(qū)，晾干后利用掃描儀對其進行掃描，對所呈現(xiàn)顏色進行色度分析，K562細胞濃度為200-10000cells/mL時，K562細胞與所呈現(xiàn)的色度差展現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為ΔI=38.69+0.075c，相關(guān)系數(shù)R=0.9931，據(jù)此建立了一種操作簡便，快速，費用低和無需專業(yè)人士即可檢測癌細胞。
【專利說明】用于葉酸過表達癌細胞快速檢測的比色方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及癌細胞的檢測方法，具體地說是一種基于AuOPtPd納米材料制備用于比色方法測定癌細胞。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤的發(fā)生嚴重影響著人們的生活質(zhì)量，危及著人們的生命安全，實現(xiàn)腫瘤細胞及其生理活動的準確、快速、簡便檢測，對于疾病的確診與治療具有非常重要的意義。目前，有關(guān)檢測方法已有一些報道，但普遍操作繁瑣費時、不易定量、儀器昂貴，且要求工作人員有較高的專業(yè)技能。因此實現(xiàn)目標物的高靈敏、快速、簡單測定癌細胞有著非常重要的意義。目前對細胞檢測流式細胞術(shù)是一種能夠?qū)毎騺喖毎Y(jié)構(gòu)進行快速檢測的新型分析和分選技術(shù)，其主要特點是檢測速度快，并且可進行多參數(shù)測量。隨著流式細胞術(shù)研究的逐步深入和成熟，其應用范圍已經(jīng)從科學研究擴展到臨床診斷，在臨床醫(yī)學領(lǐng)域里有著極大的應用潛力。但是，由于其昂貴的分析成本(儀器價格、試劑盒時間消耗等)及對操作人員專業(yè)訓練的嚴格要求，這種分析技術(shù)只能在條件比較完善的大型實驗室或檢測不能才能實現(xiàn)。同時，由于這類儀器一般還具有較為龐大的體積，因此也在一定程度上限制了其應用和普及。
[0003]細胞檢測方法的發(fā)展離不開新的材料和技術(shù)，沒有材料和技術(shù)的新突破，就很難有細胞檢測方法的研究進展。納米材料在生物分子檢測中的應用一直是生物分析化學領(lǐng)域研究的熱點問題之一，利用納米材料特殊的表面效應、體積效應、量子效應等可以在生物分子檢測中明顯地提高分析與檢測的靈敏度和選擇性，因此在生物醫(yī)學等領(lǐng)域有著非常廣闊的應用前景。近年來，利用納米材料和納米技術(shù)，并將納米生物傳感器與生化檢測技術(shù)相結(jié)合，進行癌癥的早期診斷與靶向治療的研究，是相關(guān)生物【技術(shù)領(lǐng)域】中的研究前沿。基于細胞受體的細胞傳感器是直接或者間接以細胞表面的受體作為識別元件與待測目標特異性結(jié)合，當待測目標與細胞表面受體結(jié)合后，細胞內(nèi)部會發(fā)生一系列級聯(lián)反應，信號轉(zhuǎn)換器會將這些反應裝化為可檢測的信號，從而達到獲取該反應機制的功能性信息的目的。大部分細胞傳感器在生物識別的起始階段都是直接或間接的利用細胞受體，所以，細胞受體對于新型細胞傳感系統(tǒng)的開發(fā)意義重大。自從發(fā)現(xiàn)葉酸受體在絕大多數(shù)惡性腫瘤細胞中高度表達，而在正常細胞高度保守以來，葉酸/葉酸受體介導靶向傳遞成為該領(lǐng)域研究的熱點。一種AuOPtPd納米材料用于催化顯色劑顯色，實現(xiàn)通過顯色對細胞進行檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種葉酸過表達癌細胞快速檢測的方法，所述的癌細胞的快速檢測方法是利用AuOPtPd納米材料催化顯色劑顯色方法。
[0005]所述的癌細胞的快速檢測方法檢測過程如下:
(1)將金納米顆粒與不同比例的K2PtCl6和H2PdCl4混合制備出AuOPtPd納米材料；
(2)利用6-巰基-己醇和疊氮-11-烷基-硫醇對AuOPtPd納米粒子表面修飾，通過點擊化學技術(shù)與炔基化的葉酸進行偶合；
(3)葉酸受體靶向的葉酸/AuOPtPd納米材料與癌細胞進行孵育，離心分離；
(4)取(3)懸浮液與顯色劑混合，加入顯色劑溶液底物；
(5)比較(4)得到溶液顏色，將其溶液滴在色譜紙親水區(qū)(樣品區(qū))上，晾干，掃描儀掃描對其色度分析。
[0006]所述的癌細胞的快速檢測方法具體檢測步驟如下:
(I)所述AuOPtPd納米材料制備方法，量取80mL去離子水于三口燒瓶中，加熱至90°C，加入0.8mL 1%的HAuCl4,加熱至96°C并保持一分鐘，之后加入2.8 mL 1%檸檬酸鈉，繼續(xù)攪拌15min，自然冷至室溫；秤取0.048g K2PtCl6于50 mL水中，0.035 g PdCl2溶于2 mL0.2 mol/L的鹽酸并加水稀釋至100 mL ;取5 mL金納米溶液與40 μ L 2mmol/L K2PtCljP40 μ L 2mmol/L H2PdCl4溶液混合，加入10倍量的抗壞血酸，劇烈震蕩，溶液顏色由棕色變?yōu)榛疑?br> [0007](2)所述的對AuOPtPd納米材料表面進行葉酸功能化具體方法，6-巰基-己醇，疊氮-11-烷基-硫醇和AuOPtPd按照物質(zhì)的量比為20:10:1混合，所得溶液在25°C下放置72小時,采用分子量30 kDa的半透膜進行透析30min, AuiPtPd納米材料表面形成6-巰基-己醇和疊氮-11-烷基-硫醇包覆物(A);l.0 g葉酸溶入10 mL 二甲基甲酰胺(DMF)，待完全溶解后再加入0.26 g N-羥基琥珀酰亞胺和0.44 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，得到的混合物在冰浴中繼續(xù)攪拌，直至得到白色沉淀，然后再向其中加入0.124 g炔丙胺的DMF溶液(5 mL)，得到的混合物在室溫下攪拌24 h，接著加入100mL蒸餾水，攪拌40 min，產(chǎn)生沉淀，停止反應，過濾，得到桔黃色沉淀，用丙酮洗滌，真空干燥，得炔基化葉酸(B) JEA物質(zhì)和B物質(zhì)按照物質(zhì)的量之比為1:10混合，加入CuSO4和抗壞血酸的濃度分別為0.01 mol/L和0.05 mol/L，放置10h，得到葉酸受體靶向的葉酸/AuOPtPd材料。
[0008](3)所述葉酸受體靶向的葉酸/AuOPtPd材料與腫瘤細胞進行孵育，孵育時間30min，在轉(zhuǎn)速 IOOOrpm 離心 5 min。
[0009](4)所述顯色劑TMB溶液底物為H2O2，取I mL (3)懸浮液與顯色劑100 μ L 0.1mmol/L TMB和100 μ L 0.1 mmol/L H2O2混合，加入pH 6.5的磷酸緩沖溶液I mL，靜置10min，溶液顏色變藍。
[0010](5)所述色譜紙親水區(qū)，利用蠟打印技術(shù)在色譜紙紙上打印圓形圖案，直徑5 mm,將打印蠟的圖案放在恒溫150°C下2min，未打印蠟的地方為親水區(qū)，在親水區(qū)滴加50 μ L
(4)得到的溶液，在室溫下放置，晾干，掃描儀掃描對親水區(qū)域色度進行分析，定量測定細胞數(shù)量。
[0011]本發(fā)明所述顯色劑為鄰苯二胺(0PD)，2，2’_聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)和3，3，，5，5’ _四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明所述一種葉酸受體靶向的AuOPtPd納米粒子能夠特異性識別表面有高水平葉酸受體表達的細胞，能夠催化過氧化氫氧化顯色劑發(fā)生顏色變化，用于癌細胞的檢測。
[0013](I)葉酸可以與癌細胞表面的葉酸受體特異性的結(jié)合，因此該方法大大提高了選擇性。[0014](2) AuiPtPd納米粒子具有非常高的穩(wěn)定性，在生理環(huán)境下能夠穩(wěn)定存在。
[0015](3)葉酸通過“點擊化學”反應可以與AuOPtPd納米粒子形成共價鍵，連接牢固，葉酸受體靶向的AuOPtPd納米粒子具有很好的生物相容性。
[0016](4) AuiPtPd具有高的催化活性，對催化過氧化氫氧化顯色劑效果顯著。
[0017](5)由于所用的葉酸分子小，有利于聚集于細胞的表面；具有良好的葉酸受體靶向性，AuiPtPd催化顯色劑顏色發(fā)生明顯變化，可以實現(xiàn)對癌細胞的檢測。
[0018]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為AuOPtPd納米粒子透射電鏡圖。
[0020]圖2為AuOPtPd納米粒子掃描電鏡圖(內(nèi)插能級譜圖)。
【具體實施方式】
[0021]實施例1用于K 562腫瘤細胞的快速檢測方法 I葉酸/AuOPtPd納米材料的制備
(I)量取80mL去離子水于三口燒瓶中，加熱至90°C，加入0.8mL 1%的HAuCl4,加熱至96°C并保持一分鐘，之后加入2.8 mL 1%檸檬酸鈉，繼續(xù)攪拌15min，自然冷至室溫；秤取
0.048 g K2PtCl6于50 mL水中，0.035 g PdCl2溶于2 mL 0.2 mol/L的鹽酸并加水稀釋至100 mL ;取 5 mL 金納米溶液與 40 μ L 2mmol/L K2PtCl6 和 40 μ L 2mmol/L H2PdCl4 溶液混合，加入10倍量的抗壞血酸，劇烈震蕩，溶液顏色由棕變?yōu)榛疑?br> [0022](2) 6-巰基-己醇，疊氮-11-烷基-硫醇和AuOPtPd按照物質(zhì)的量比為20:10:1混合，所得溶液在25 °C下放置72小時，采用分子量30 kDa的半透膜進行透析30min，在AuOPtPd納米材料表面形成6-巰基-己醇和疊氮-11-烷基-硫醇包覆物(A);1.0 g葉酸溶入10 mL 二甲基甲酰胺(DMF)，待完全溶解后再加入0.26 g N-羥基琥珀酰亞胺和0.44 g1- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，得到的混合物在冰浴中繼續(xù)攪拌，直至得到白色沉淀，然后再向其中加入0.124 g炔丙胺的DMF溶液(5 mL)，得到的混合物在室溫下攪拌24 h,接著加入100 mL蒸懼水,攪拌40 min,產(chǎn)生沉淀,停止反應,過濾,得到桔黃色沉淀，用丙酮洗滌，真空干燥，得炔基化葉酸(B);把A物質(zhì)和B物質(zhì)按照物質(zhì)的量之比為1:10混合，加入CuSO4和抗壞血酸的濃度分別為0.01 mol/L和0.05 mol/L，放置10 h，得到葉酸受體祀向的葉酸/AuiPtPd材料。
[0023]2 K562細胞的培養(yǎng)
RPM1-1640培養(yǎng)液:稱取RPM1-1640粉10.4 g，溶于三蒸水1000 mL，加入2 gNaHCO3，調(diào)節(jié)pH值至7.4，用0.22 μπι的微孔濾膜正壓過濾除菌，用之前加入10 %胎牛血清(FBS)，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μ g/mL, I mmol/L L-谷氨酰胺，4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0024]從液氮中取出凍存管后立即置于38 1:恒溫水浴中解凍，取出凍存管，用75 %酒精清潔管口，將凍存細胞轉(zhuǎn)移到大玻璃培養(yǎng)瓶，加入20 mL新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，復蘇次日更換培養(yǎng)液。K562細胞在含有10 %滅活胎牛血清(FBS)、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μ g/mL的RPM1-1640培養(yǎng)液中，于37 °C、5 % CO2、水飽和濕度條件下培養(yǎng)。
[0025]3 K562細胞的測定 (I)取 20 μ L 葉酸 /AuOPtPd 納米材料與 100 個 /mL，1000 個 /mL，2000 個 /mL，5000個/mL, 10000個/mL和15000個/mL的K 562細胞孵育30 min,在轉(zhuǎn)速為1000 rpm離心5min,得到細胞表面結(jié)合葉酸/AuOPtPd的懸浮液。
[0026](2)取 I mL (I)懸浮液與顯色劑 100 μ L 0.1 mmol/L TMB 和 100 μ L 0.1 mmol/L H2O2混合，加入pH 6.5的磷酸緩沖溶液I mL，靜置10 min，溶液顏色變藍。
[0027](3)用Adobe illustrator CS4設計圖案,利用臘打印技術(shù)通過打印機在I級色譜紙上打印圖案，將打印蠟的圖案放在恒溫150°C下2min，在設計的紙上圖案區(qū)作為疏水區(qū)，未打印蠟的地方親水區(qū)作為工作區(qū)(樣品區(qū))，樣品區(qū)直徑5 mm，在親水區(qū)滴加50 μ L (3)得到的溶液，在室溫下放置，晾干。
[0028](4)將步驟(3)得到的帶有顏色的色譜紙放在掃描儀上對樣品區(qū)進行色度處理，隨著K 562細胞濃度的增加，表明結(jié)合在細胞表面的葉酸受體靶向的AuOPtPd就越多，催化過氧化氫氧化TMB變色越大，色度差值(Λ I)值也隨之變大。Κ562細胞濃度為200-10000cells/mL時，K 562細胞與所呈現(xiàn)的色度差展現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為Δ 1=38.69+0.075c，相關(guān)系數(shù)R=0.9931。因此，基于葉酸受體靶向的AuOPtPd用于檢測腫瘤細胞的檢測限為80個/mL，這種方法實現(xiàn)了操作簡便，快速，費用低和無需專業(yè)人士即可檢測葉酸受體過表達的細胞。
【權(quán)利要求】
1.一種用于葉酸過表達的癌細胞的快速檢測方法，其特征是包括以下步驟: (1)將金納米顆粒與不同比例的K2PtCl6和H2PdCl4混合制備出AuOPtPd納米材料； (2)利用6-巰基-己醇和疊氮-11-烷基-硫醇對AuOPtPd納米粒子表面修飾，通過點擊化學技術(shù)與炔基化的葉酸進行偶合； (3)葉酸受體靶向的葉酸/AuOPtPd納米材料與癌細胞進行孵育，離心分離； (4)取(3)懸浮液與顯色劑混合，加入顯色劑溶液底物； (5)比較(4)得到溶液顏色，將其溶液滴在色譜紙親水區(qū)(樣品區(qū))上，晾干，掃描儀掃描對其色度分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1在步驟(1)中，所述AuOPtPd納米材料制備方法,量取80mL去離子水于三口燒瓶中，加熱至90°C，加入0.8mL 1%的HAuCl4,加熱至96°C并保持一分鐘，之后加入2.8 mL 1%檸檬酸鈉，繼續(xù)攪拌15min，自然冷至室溫，秤取0.048g K2PtCl6于50 mL水中，0.035 g PdCl2溶于2 mL 0.2 mol/L的鹽酸并加水稀釋至100 mL，取5 mL金納米溶液與40 μ L 2mmol/L K2PtClf^MOyL 2mmol/L H2PdCl4溶液混合，加入10倍量的抗壞血酸，劇烈震蕩，溶液顏色由棕色變?yōu)榛疑?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1在步驟(2)中，所述的對AuOPtPd納米材料表面進行葉酸功能化具體方法，6-巰基-己醇，疊氮-11-烷基-硫醇和AuOPtPd按照物質(zhì)的量比為20:10:1混合，所得溶液在25°C下放置72小時，采用分子量30 kDa的半透膜進行透析30min，AuOPtPd納米材料表面形成6-巰基-己醇和疊氮-11-烷基-硫醇包覆物(A); 1.0 g葉酸溶入10 mL二甲基甲酰胺(DMF)，待完全溶解后再加入0.26 g N-羥基琥珀酰亞胺和0.44 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，得到的混合物在冰浴中繼續(xù)攪拌，直至得到白色沉淀，然后再向其中加入0.124 g炔丙胺的DMF溶液(5 mL)，得到的混合物在室溫下攪拌24 h,接著加入100 mL蒸懼水,攪拌40 min,產(chǎn)生沉淀,停止反應,過濾,得到桔黃色沉淀，用丙酮洗滌，真空干燥，得炔基化葉酸(B);把A物質(zhì)和B物質(zhì)按照物質(zhì)的量之比為1:10混合，加入CuSO4和抗壞血酸的濃度分別為0.01 mol/L和0.05 mol/L，放置10h，得到葉酸受體祀向的葉酸/AuiPtPd材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1在步驟(3)中，所述葉酸受體靶向的葉酸/AuOPtPd材料與腫瘤細胞進行孵育，孵育時間30 min,在轉(zhuǎn)速1000rpm離心5 min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1在步驟(4)中，所述顯色劑TMB溶液底物為H2O2，取ImL (3)懸浮液與顯色劑 100 μ L 0.1 mmol/L TMB 和 100 μ L 0.1 mmol/L H2O2 混合，加入 pH 6.5 的磷酸緩沖溶液I mL，靜置10 min，溶液顏色變藍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1在步驟(5)中，所述色譜紙親水區(qū)，利用蠟打印技術(shù)在色譜紙紙上打印圓形圖案，直徑5 _，將打印蠟的圖案放在恒溫150°C下2min，未打印蠟的地方為親水區(qū)，在親水區(qū)滴加50 μ L (4)得到的溶液，在室溫下放置，晾干，掃描儀掃描對親水區(qū)域色度進行分析，定量測定細胞數(shù)量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述本發(fā)明所述顯色劑為鄰苯二胺(0PD)，2，2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二 銨鹽(ABTS)和3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(ΤΜΒ)。
【文檔編號】G01N21/78GK103913453SQ201410124906
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】葛慎光, 于京華, 葛磊, 顏梅, 張彥, 黃加棟, 劉偉艷 申請人:濟南大學